遗传学实验— 微生物实验

（十一） 大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选（一） （物理因素诱变）实验原理 在以微生物为材料的遗传学研究中，广泛应用营 养缺陷型。用某些物理因素或化学因素处理细菌，使 基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸，维生素， 核昔酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生 长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱 变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。筛选营养缺陷 型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理，淘汰野生 型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。本实验选择紫外线作为 诱变剂，并用青霉素法淘汰野生型，采用逐个测定法检 出缺陷型，最后用生长谱法鉴定缺陷型。实验原理 在以微生物为材料的遗传学研究中，广泛应用营 养缺陷型。用某些物理因素或化学因素处理细菌，使 基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸，维生素， 核昔酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生 长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱 变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。筛选营养缺陷 型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理，淘汰野生 型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。本实验选择紫外线作为 诱变剂，并用青霉素法淘汰野生型，采用逐个测定法检 出缺陷型，最后用生长谱法鉴定缺陷型。     

诱变筛选荧光假单胞菌M18高产吩嗪-1-羧酸(PCA)菌株及发酵条件研究

研究了亚硝基胍(NTG)的诱变剂量、处理时间以及氯化钠浓度对野生型荧光假单胞菌M18存活率的影响,NTG的诱变剂量25～200mg／L,处理时间10～30min范围内,随着诱变剂剂量增加和时间的延长,M18的存活率不断下降。NTG的作用剂量25mg／L,处理时间10min时,细菌存活率为55％左右。利用细菌存活率为55％时的诱变条件,经生物测定,初筛获得20株抑菌效果明显的诱变株。经摇瓶发酵复筛,从这20株诱变株中,获得PCA高产诱变株M18N07。并对此菌株发酵条件进行调整,较理想的培养条件为：蛋白胨18g／L,葡萄糖16g／L,氯化钠1g／L,硝酸钾10g／L。小瓶培养时间17h,大瓶5％接种量,28℃培养54h。     

卡那霉素链霉菌亚硝基胍诱变育种

亚硝基肌(NTG）是一种高效的诱变剂,对 细菌^[1,3,4]、酵母菌^[5]、、黑曲霉^[2]、、天蓝色链霉菌^[6]、 等的诱变效果显著。为了提高卡那霉素生产菌 种的发酵单位,我们研究了在pH6的条件下,不 同缓冲液、NTG不同浓度和不同处理时间对卡 那霉素链霉菌的杀菌率和效价变异频率的影 响,找到了最适诱变条件,先后筛选到两株高产 突变株K-102和K-41,并已用于生产。     

蝴蝶兰EMS离体化学诱变及再生植株RAPD检测

用EMS对离体培养的蝴蝶兰类原球茎薄切片进行化学诱变,研究了不同浓度、不同时间诱变处理对类原球茎薄切片生长、类原球茎再生及再生苗生长的影响,并对再生苗DNA进行了RAPD检测。结果表明,诱变剂EMS对类原球茎薄切片生长产生重要影响,部分薄切片褐化死亡,再生类原球茎生长受到抑制,再生苗数量减少,表现出明显的伤害作用,这种伤害作用随诱变剂浓度的加大和处理时间的延长而加重。诱变剂EMS使部分再生苗畸变,叶片皱缩、变厚。并产生2株叶形、叶色突变体。部分再生苗表现出RAPD图谱带型的多态性,暗示DNA序列发生了一定的变异。EMS适合诱变剂量为浓度0．4％处理2d～4d。     

啤酒酵母呼吸缺陷型诱变形成机制初探

本文以两株不同的啤酒酵母(S.cerevisiae)作出发菌株,用溴化乙锭(10—100μg/ml)作诱变剂,诱变呼吸缺陷型。发现在非生长条件下,EB诱变呼吸缺陷型过程中出现回复现象。这一现象可被咖啡碱有一定程度的抑制,而在生长条件下EB诱变过程中未发现此现象。但当用KCN处理时,则得到了类似于非生长条件下的诱变结果。因而,推测呼吸缺陷型形成过程中可能存在一中间态过程[ρ~-]~*。呼吸缺陷型的形成过程可用ρ~ [ρ~-]~*→ρ~-表示。这是一动态过程。加入一定量的放线菌酮、氯霉素处理时,对诱变动力学曲线没有发现有影响,但培养酵母所用葡萄糖浓度不同时,对其诱变结果有一定的影响。     

亚硝基呱对苏芸金杆菌晶体和芽抱的影响

苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis）作为高 效、无公害农药用于防治农、林、果、蔬害虫取得 了良好的效果^[1]。近年来,为了提高苏芸金杆 菌对昆虫的致病力,国内外不少学者研究了 苏芸金杆菌的伴袍晶体与杀虫毒力的密切关 系^[2],并通过自然筛选或遗传育种方法不断获 得了新的变种和高毒效菌株^[3,4,10,11]。我国1975 年从美国引进B. thuringiensis var. kurstaki (HD-1)以来,已较广泛地应用于生产^[5],但对 原有菌种进行改良尚无报道。我们用化学诱变 剂亚硝基孤(NTG）处理HD-1菌种,获得了一 些诱变菌株,并研究了NTG 对苏芸金杆菌晶 体、芽抱以及诱变后对昆虫毒力     

姬松茸原生质体诱变育种研究

以姬松茸原生质体为诱变材料,用不同诱变剂紫外线（UV）,钴60（Co^60）,亚硝基胍（NTG）进行多次反复诱变处理,获得2株活性多糖产量较高,遗传稳定的变异株C811/N516。与出发菌株各项发酵指标比较,突变株其他各发酵特性变化不明显,而单位发酵液活性多糖含量分别提高260%和300%以上。     

NTG对庆丰链霉菌诱发产生营养缺陷型突变体的研究

我们为了对庆丰链霉菌的遗传研究准备实 验材料,应用效果显著的化学诱变剂N一甲基一 N'一硝基-N一亚硝基狐(NTG),对庆丰链霉菌 进行诱变处理,筛选各种不同遗传标记的营养 缺陷型突变体,并分析了这些变种类型的分布 和突变机理。     

化学诱变法选育D-核糖高产菌株工艺研究

研究了以硫酸二乙酯(DES)为诱变剂,诱变生产D-核糖的转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌HG02,考察了不同诱变剂用量对菌体致死率及其生产能力的影响。得出了以DES诱变该菌株的致死率曲线及最佳的诱变条件:诱变剂用量0.8%,诱变时间15min。该诱变条件下对大量的突变株进行筛选,得到D-核糖高产菌HG03,其D核糖产量较出发菌株提高81.69%。达到5.1g/100mL。     

细菌感受态细胞摄取和分泌DNA的相关性研究I.含有质粒的枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突变株的诱变和分离

以携带ｐＵＢ１１０质粒的枯草芽孢杆菌ＢＲ１５１菌株为出发菌株,利用亚硝基胍作诱变剂,直接在ＬＢ平板上进行诱变。从２９４９个菌落中筛选出一个转化频率低于出发菌株２～３个数量级的突变株,并对其营养缺陷型、ＵＶ的敏感性及Ｋｍ抗性和质粒进行了检测,确证其转化能力降低为自然感受态缺陷而非营养缺陷型的改变或重组缺陷所致     

黑曲霉原生质体电融合研究

以NTG和UV分别对生淀粉糖化酶菌株——野生型黑曲霉N 11,N一16(Aspergillusniger)进行诱变处理获Lys^-和Arg^-两类营养缺陷型。采用纤维素酶和蜗牛酶复合酶处理其菌丝并探讨了酶浓及菌龄等因素对原生质体形成和再生的影响。以BAEKON-2000型基因转移仪将上述营养缺陷型进行原生质体电融台处理。产生高融合率的最佳参数为：脉冲幅度4．5kV,脉冲数32,脉宽62．5μs,电激时间0.2s,距离3mm,周期数10。融合率可达60％。经连续传代7次获得4株稳定的融合子,经孢子体积,核DNA含量,生长速度测定证明上述融合子是种内杂合二倍体。以PFA处理得稳定的单倍体分离子。     

灵芝尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选和分子鉴定

【背景】营养缺陷型是一种应用广泛的分子标记,但是目前在灵芝中还未有研究和应用报道。【目的】为灵芝遗传转化研究、杂交育种和菌种鉴别提供亲本材料和技术支持。【方法】采用紫外光诱变、单单杂交、孢子单核化的方法从灵芝单核体菌株出发得到尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。【结果】获得8株稳定的尿嘧啶营养缺陷型单核体突变菌株和7株尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。【结论】灵芝尿嘧啶营养缺陷型菌株在添加外源营养物的基础上可恢复正常生长,可以为灵芝遗传转化体系的构建和灵芝育种提供材料。     

利用制霉菌素溶缩处理高频率地检出黑曲霉营养缺陷型突变株

以亚硝酸诱变处理黑曲霉Ｎ３４３和黑英霉ＵＶ－１１的分子孢子,然后将它们培养在它们培养基平板上至第二代分生孢子生长,收集这些孢子以制霉菌素浓缩处理,结果以３．８－０．３％的高频率和到１９株稳定的营养缺陷型突变株：从黑曲霉Ｎ３４３获得３株维生素类的缺陷型,它们分别为双缺或参缺;从黑曲霉ＵＶ－１１获得１６株特殊遥脯氨酸营养缺陷型,进一步分析表明这是由于从谷氨酸合成脯所酸或精氨酸的代谢阻断所致。     

白桦愈伤组织化学诱变

用不同浓度的甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）对白桦（Betula platyphalla Sak.）愈伤组织进行化学诱变处理。结果表明：EMS诱变剂的浓度和处理时间对愈伤组织的存活率有很大影响。在高浓度EMS短时间处理和低浓度EMS长时间处理条件下得到叶柄、叶片愈伤组织的半致死剂量。通过观察半致死剂量下愈伤组织的染色体发现,诱变后细胞中单倍体、非整倍体及多倍体比例均高于对照,这说明EMS的诱变处理引起了愈伤组织细胞中染色体数量的变化。     

自絮凝工业酒精酵母营养缺陷型的筛选和鉴定

运用紫外诱变方法成功获得了自絮凝酵母的营养缺陷型突变体,并且优化了诱变方法,证明了通过紫外诱变也可获得自絮凝酵母的营养缺陷型突变体。实验证明,较低的致死率更容易获得突变体,利用制霉菌素的富集可明显减少非缺陷型背景。本实验获得了组氨酸和尿嘧啶营养缺陷型各一株,其中组氨酸缺陷型茵株失去絮凝特性,而尿嘧啶缺陷型保持了良好的絮凝特性。继代实验表明,二株突变体均可以稳定遗传。并利用交配型PCR方法证明了絮凝酵母及其两株突变体与其酿酒酵母亲本类似,均为交配型杂合体。     

枯草芽孢杆菌B-903菌株的诱变选育

枯草芽孢杆菌B-903菌株是由河南省农业科学院植物保护研究所从郑州果园中分离得到,其代谢产生的抗菌物质对多种植物病原真菌具有较强抑制作用。以此菌株为出发菌株,进行亚硝基胍（NTG）和微波诱变处理,确定了,二者诱变处理的最佳处理剂量：NTG最佳处理浓度为200μg／mL,微波诱变为HI微波挡（850W、脉冲频率2450MHz）处理100s,筛选出13个高效突变株。经传代实验,2株高效突变株N1和W2抑菌圈直径分别稳定在26mm和24mm以上,比出发菌株提高21．8％和14．8％．     

质粒RP4：：Mu引起霍乱弧菌基因的突变和转移

质粒pULB11(RP4：：Mucts)通过接合能从大肠杆菌转移到霍乱弧菌——吴江2(Vibriccholerae——Wu Jiang 2)中去。带有 puLB 11的霍乱弧菌经42℃诱导后能以0.5％的突变率产生营养缺陷型,这些营养缺陷型十分稳定,在10。细胞中还不能测出它们的回复突变体,这与Mu对大肠杆菌的诱变作用十分相似。质粒RP4及其抗药性很容易从霍乱弧菌中失去,这说明营养缺陷型的产生是由于Mu的插人而不是RP4的整人,所以pULB 11可以作为诱变剂来诱变霍乱弧菌的包括毒素基因在内的各种突变体,这在构建霍乱弧菌活菌苗方面有一定的意义。puLB 113(RP4：：Mini-Mu)还能诱动霍乱弧菌染色体基因,这也是研究霍乱弧菌遗传学的有用手段。     

高产马杜霉素产生菌的诱变选育

研究马杜拉放线菌的筛选,比较代表5类不同诱变剂UV,EMS,LiCl+UV和NTG的处理效果,经摇瓶验证,用NTG处理后经过初筛、复筛得到摇瓶效价比对照菌株高91.5％的诱变菌株348＃,稳定性考查后,在2.5m~3和50m~3发酵罐上进行试生产,效果显著,菌种代谢速度加快,效价比对照罐高60％,主要组分A组分的含量由91％增长到96.5％,提高了经济效益。     

利用制霉菌素浓缩处理高频率地检出黑曲霉营养缺陷型突变株

以亚硝酸诱变处理黑曲霉Ｎ３４３和黑曲霉ＵＶ－１１的分生孢子,然后将它们培养在完全培养基平板上至第二代分生孢子长出,收集这些孢子以制霉菌素浓缩处理,结果以３．８～０．３％的高频率得到１９株稳定的营养缺陷型突变株：从黑曲霉Ｎ３４３获得３株维生素类的缺陷型,它们分别为双缺或叁缺;从黑曲霉ＵＶ－１１获得１６株特殊的脯氨酸营养缺陷型,进一步分析表明这是由于从谷氨酸合成脯氨酸或精氨酸的代谢阻断所致。所有以上突变株形态与各自原养型相似,但在产酶活力方面均为负突变     

秋水仙碱对水稻诱变效果的初步研究

秋水仙碱(colchicine)作为细胞分裂时纺锤体形成的阻断剂,在细胞遗传学研究和诱变育种实践方面已有广泛的应用。但在国内,有关使用秋水仙碱处理诱变稻种的具体条件及效果的详细报道仍然较少。笔者用不同浓度的秋水仙碱对早稻种子作不同时间的处理所产生的生物学效应进行了初步研究,以探索秋水仙碱处理诱变水稻的最佳条件。现将研究情况报道如下。