核酸及蛋白质合成、提取、纯化

920805通过酚抽提法从服硫氛酸中纯化质粒〔英〕/Fishe-r,J .A.…了Anal.Bioehem一1991,194(2)一309~315【译自DBA,1991,10(15),91-08441〕 该方法利用自动核营酸提取设备。基本操作是于pH4.5时用酚从IM的脏氰酸中进行抽提,这样能从水相中有效地去除染色体DNA,而超螺旋的质粒DNA仍留在水相中。51核酸酶消化表明,去除的染色体DNA已经变性,因而可溶于有机相。整套方法包括:用溶菌酶、RNA酶A和蛋白酶K连续预处理细菌细胞;消化后的溶液用酚/氯仿十水混合物抽提二次,再用氯仿抽提一次。通过异丙醇沉淀收集纯化的质粒。这样提纯的质粒中…     

基因诱变、重组、克隆

923552甲醇利用型嗜甲基菌属耐热菌株的高效电激转化[英]/Haider,M.Z.…/Acta Biotechn01.一1991,21(4)一295~301[译自DBA,1902,11 (7),92一03606〕 采用pUC19、pBR322、pCMi、pUC/CAT以及由pSAS片段与pUC19的重组质粒(P USM4、pUSFio、pUSMZo)作为载体。分别用感受态、原生质体和电激三种转化法转化万eth好。夕瓜-105属菌株KISRI一5112(NCIB 12138)、KISRI一512(NCIB 12137和KISRI一6.1(NCIBiZi36)。在25产F、3 kV、1 .5一5 kV/cm电激条件下成功地转化了质粒(P UCM20的转化率达180万转化子/拼9 DNA),并稳定…     

炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建

为制备炭疽芽胞杆菌的基因芯片探针文库,以炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02为原材料,用Sau3A I酶切pX01和pX02质粒DNA,Taq DNA聚合酶72℃补平加A,经AT克隆,PCR初步鉴定筛选出炭疽质粒片段的阳性克隆．DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定;用生物信息学方法对其片段进行同源性分析;并将克隆的探针打印于玻片上,制备成炭疽芽胞杆茵基因芯片,与炭疽杆茵质粒DNA样品进行初步芯片杂交的实验,杂交实验的阳性率达到了90％以上,证明大部分克隆探针属于炭疽芽胞杆菌．炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建为基因芯片探针的制备摸索出一条简便、高效、可行的方法．     

组织与原生质体培养

950616从电激原生质体再生转基因大豆植株[英]/Dhir,S.K.…/P1ant Physi01.一1992,99(1).一81～88E译自DBA,1992,11(14),92—08040] 质粒DNA携带CaMV35S启动子调控的新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因,该基阈与冠瘿碱生物合成的非选择标记相连。从上述质粒电激处理后的原生质体衍生愈伤,并再生出转基因大豆植株。从电激后培养的第15天开始,用卡那霉素(50pg/m1)选择。6周内,从1百万个电激原生质体中选出370～460个抗性集落,绝对转化频率为O.00037～O.00046。其中80％以上的集落具有NPT’Ⅱ活性,这些集落的90％产生冠瘿碱。连接的标记基…     

四种不同细菌质粒转化庆丰链霉菌的研究

利用四种不同质粒(pRR322、pUB110、pKT071和pA01)在10—15％聚乙二醇6000存在时,可以成功地转化到庆丰链霉菌受体;其中转化的pBR322质粒经过20次传代后,仍有如％左右可稳定地存留,而其它三种质粒经2--3次传代后立即消失。用无细胞胞外粗抽提物证实pBR322质粒基因在庆丰链霉菌细胞中得到表达。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证示转化子胞外抽提物中显著呈现一条分子量为30,000左右的蛋白质带,与已知的pBR322编码的β-内酰胺酶分子量相一致。     

基因诱变、重组、克隆

951572齿垢密螺旋体夭冬氨酸·氨甲酰基转移酶基因的克隆和表达[英]/Ishihara,K.…∥Appl.Env-itort Microbi01..1992,58(10).一3399N3403[译自DBA,1992,11(23),92—12850] 用HindllI部分消化齿垢密螺旋体(Trepon-8ma denticola)ATCC33520染色体DNA,连接到噬菌俸k-L47.1里,包装成噬菌体,用之感染大肠杆菌Q358。采用抗该细菌完整细胞的兔抗血清筛选得到18个阳性克隆。克隆X-TDSl2的HindⅢ一HindllI片段亚克隆到质粒pACYC,再转化到大肠杆菌HBl01里。亚克隆TDl2携带质粒pTDS12,含有该螺旋体DNA的8 kb片段。进行DNA测序时,把p…     

动物遗传工程

921940大鼠生长激紊基因微注射到斑马鱼卵里以生产转基因斑马鱼〔英〕/Pandian,T.J.…泌Curr.Sei一1991,60一9~10〔译自DBA,1991,10(22),91一13024〕 将质粒pMGH(15ng DNA/时)(含有与大鼠生长激素基因融合的小鼠金属硫因启动子)微注射到斑马鱼尚未分裂的受精卵(1266个)里。注射一天后胚胎平均存活率为46%,但变动范围为16~72%。利用标记质粒作探针通过Slot一blot和Sou-thern印迹杂交分析了从推定转基因鱼提取出的基因组DNA。杂交图谱显示发生了基因组、染色体外、以及嵌合整合。继续存在于Fl和FZ代里的染色体外DNA浓度逐步降低。F…     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

质粒研究与载体构建

920009构睡能在AmyeolatoPsis mediterranei中盆御的杂交质较〔英〕/Lal,R.…/ApPI.Environ.Mierobiol一2991,57(3)一665~671[译自DBA,1991,10(9),91一94832〕 从A.仍e“‘e,,“。e‘DSM43387中分离到质粒pA387(29.6kb)。经原生质体化、澳乙咤或热处理可低频消除该质粒。该质粒属游离型,不整合到染色体中。将一个5.Ikb的pA38了片段擂人大肠杆菌载体质粒pDM10中,构建成杂交质粒pRLI。该质粒可被电激转化至A.仍。J“e,,a。。云及A。o,亏e:‘a乙妞s中。对前者,用i2.skV/em、10。6也sec条件,转化频率为22。。/拼9 DNA;对后者,用7.s…     

质粒研究与载体构建

95。1530导致嗜热链球菌中重组质粒不稳定的DNA结构[英]/Solaiman,D.K.Y.…,Biotechn01.Lett..1992,14(9).一753～758[译自DBA,1992,11(23),92—12859] 通过电转化法把双功能载体质粒p BN 183导人嗜热链球菌STl281]寸,检测到各种缺失型质粒。用这些质粒转化大肠杆菌H B101。24个克隆的小质粒筛选可鉴定5个主要的质粒缺失种。把这些质粒重新导入嗜热链球菌STl28后表明,它们的结构是稳定的。用重组质粒pDC02和pDC03(包括链露菌胆固醇氧化酶基因)获得类似结果。缺失质粒的限制性图谱分析确定出转化DNA中的缺失pro。ne区。序列测定显…     

农杆菌T—DNA介导的植物转基因的分子机制

前言 根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与发根农根菌(A.rhizogenes)同属根瘤菌科,是革兰氏阴性植物病原菌。前者感染植物引起冠瘿病(Crop gall tumour),冠瘿病用含有抗生素的培养基培养与除菌。可无限增殖;后者感染植物诱发出许多不定根,把不定根培养在上述培养基上也可迅速生长,多次分枝成毛状称毛状根(hairy root)。农杆菌感染机理很复杂。其感染作用起始于受伤的植物细胞分泌的大量化学物质时期。受伤植物细胞分泌的酚分子诱导农杆菌怀有的Ti质粒或Ri质粒上的基因活化,尔后农杆菌紧附植物细胞并把Ti质粒或Ri质粒上一部分DNA(称作T—DNA,tranfer DNA)转移到植物染色体上。T.DNA共价整合后编译合成的新的低分量的代谢物,称为冠瘿碱。     

生物防治

923695分离自苏云金芽抱杆菌肯尼亚亚种的晶体蛋白甚因产物的杀虫特性〔英〕/Masson,L.…了Appl.Environ,Mierobiol一1992,58(2)一642~646〔译自DBA,1992,11(7),。2一03850〕 从苏云金芽抱杆菌肯尼亚亚种(Bac订如8‘h-。,￡。夕￡。。s‘,subsp.无e叮ae)一个大质粒分离到的前毒素基因被克隆到大肠杆菌JM83(质粒pKEN4)的BamHI DNA片段中。该基因(编码Cr刃E毒素)是作为4.skb片段克隆于质粒pMP-CV,在大肠杆菌HB101中作为相发光包涵体表达134kDa蛋白。用胰酶或家蚕胃计消化已溶解的包涵体,得到抗蛋白水解酶的65kDa蛋白。在强迫进食…     

基因工程

940001乳酸克奋维酵母的电激转化〔英〕/San chez,M.…了Appl.Environ.Mierobiol‘一1993,59(7).一2057~2092〔译自DBA,1993,22(16),93-09071」 分析了与通过电激有效转化乳酸克鲁维酵母MDZ八有关的物理和生物学参数。利用最适电压并使小杯中的悬浮细胞体积恒定时,转化率随细胞数和质粒浓度的增加而提高。用二硫苏糖醇预处理上述酵母细胞能提高转化率。但是,最重要的参数是脉冲时间。1毫秒的改变可使转化率下降70~80%以上。在优化条件下,获得10“~107个转化体/协g质粒DNA。在一定条件下,质粒的大小也影响电激效果。在任何情况下,未获…     

嗜热硫杆菌启动子的克隆及定位

用DNA体外重组技术,将嗜热硫扦菌(Thiobacillus sp．)染色体DNA的Hind III片段插人启动子探测质粒pSDSI(Apr、Tc2)的Hind III位点,在四环素平板上获得一批转化子。四环素抗性能力测定表明,有12个转化子可以在含240／μg／ml四环素的平板上生长,有2个可以在360μg／ml的四环素平板上生长,对这二个抗性表达能力较高、分子量较小的质粒pSDH7和pSDH11作了限制性酶切图谱分析,并利用PstI位点,通过亚克隆将pSDH11插人片段上的启动子定位在0．25kb片段内。分子杂交实验证明克隆的启动子活性片段确实来源于嗜热硫杆菌染色体DNA。     

生物固氮

961070 腐生性固氮放射形土壤杆菌5D-1的遗传转化[俄]/Yablunenko,A.N.…//Genetika(Mascow).-1995,31(6).-778～783[译自DBA,1995,14(19),95-11503] 用质粒pVZ2361和染色体DNA(含有标记trp 、his 和卡那霉素抗性)转化腐生性固氮放射形土壤杆菌5D-1的转化率分别为10000/μg DNA和     

质粒RSF1010寄主范围特性的遗传学分析

采用Tn5插入诱变、限制性核酸内切酶作图以及DNA转化等方法,对广泛寄主范围型质粒SF 1010的衍生体－pKT 2 40进行研究。证实质粒的寄主围决定于它在遗传背景不同的寄主中复制并保存自身的能力,而repA,rcpB和repC基因为该质拉复制所必需。     

生物固氮

922582 光合同氮菌深红红螺菌人工DNA介导的遗传转化[英]/Fitzmaurice,W.P.…∥Arch.Microbiol.-1991,156(2).-142～144[译自DBA,1992,10(25),91-14770] 用CaCl_2、CaCl_2-PEG6000和冻融法,以载体质粒pSa4转化深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)VR2(一种天然的链霉素抗性突变株)。DNA浓度低时,转化频率呈线性增加,较高浓度时则达到饱和。在用抗生素筛选前,用对数生长早期和静止生长早期的细胞,1～2分钟热激、37℃、200mM CaCl_2、表达5小时的转化最佳。     

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.     

耐盐及苯乙酸、甲基对硫磷降解基因工程菌的构建

H1（Halomonas sp.）是一株耐高盐浓度（18% NaCl, W/V）和降解苯乙酸的菌株,pDT3质粒为pUC19插入甲基对硫磷水解酶基因（mpd基因）构建而成。采用ＨindⅢ酶切,获得含有完整mpd基因片段,克隆到广宿主质粒pKT230和pBBR1MCS2上,构建成质粒pKTMP和pBBRMP。通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,将质粒pKTMP和pBBRMP转移到Ｈ１中,得到的工程菌HpKTMP和HpBBRMP具有耐盐、降解苯乙酸和水解甲基对硫磷的功能,其中HpBBRMP水解酶活性与亲本菌株甲基对硫磷降解菌（Pseudomonas putida）DLLE4相当,而HpKTMP水解酶活性要提高1倍左右。经过传代试验,证明了工程菌的稳定性。     

枯草芽孢杆菌中的分子克隆和单体杂种质粒转化的研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的质粒转化与质粒的分子构型有关。用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化的pUB110质粒DNA单体是很少或没有转化活性的。在pUB110质粒DNA上插入一段受体菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体可以转化感受态细胞,但受体菌必须是重组型的。转化效率和插入片段的大小有关,片段愈大转化活性愈高,片段小于0.6kb,就和pUB110DNA单体一样,几乎没有转化活性。在pUB110质粒DNA上插入一段解淀粉芽孢杆菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体转化效率都很低。本文还讨论了用鸟枪法在枯草芽孢杆菌中进行分子克隆的一些问题。