丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究

丙型肝炎病毒(HCV)基因易发生变异, 尤其是含中和抗原表位的高变区1(HVR1)变异性最大. 模拟HVR1的B细胞表位具有涵盖多种天然表位的抗原特性, 保守的T细胞表位具有各型间的相对保守性. 为解决HCV高变性造成的疫苗研究障碍, 我们选取HCV E2区HVR1(384～410 aa)模拟B细胞表位9条、C区的保守CTL表位2条(35～44 aa, 132～140 aa)、NS3区保守的CTL表位1条(1073～1081 aa)及NS3区保守的Th表位1条(aa 1251～1259), 各表位之间以插入3个氨基酸为连接臂, 人工合成上述13条表位基因串联的HCV多表位抗原基因(mfc). 将mfc与gst基因融合, 表达了多表位抗原蛋白GST-MFC. 同时, 构建了白介素-2信号肽基因、PADRE表位基因和mfc基因串联的候选HCV DNA疫苗, 即质粒pVAX1.0-st-mfc. 以GST-MFC蛋白免疫家兔和质粒pVAX1.0-st-mfc免疫小鼠, 采用ELISA和Western blot方法, 应用10条具有代表性的HCV HVR1合成肽进行检测, 证明有9条HVR1合成肽能与所有免疫动物血清反应, 交叉反应率(cross reactivity, CR)为90%. 应用HCV抗体阳性的感染者血清与多表位抗原GST-MFC蛋白进行反应, 证明其反应识别率(reactivity frequency, RF)为75%. 上述结果表明, 筛选合成的HCV多表位抗原基因mfc具有HCV中和抗原表位的特征, 可作为HCV疫苗研制的候选基因.     

丙型肝炎病毒多表位DNA疫苗的研究进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是非甲非乙型肝炎的主要病原,目前还没有有效的预防和治疗手段。多表位DNA疫苗(multi-epitope DNA vaccine, minigenes/epigenes)是指通过筛选与组合优势抗原表位(包括T细胞、B细胞表位)基因,以能产生高效细胞、体液免疫应答进而清除HCV病毒为目的的新型核酸疫苗。其优势在于通过选择最具免疫保护潜力的表位以覆盖尽量多的病毒亚型和诱导全面的机体抗病毒免疫应答,并尽量减少无关、干扰和抑制序列可能产生的负面影响。本文介绍近年来国内外在丙型肝炎多表位DNA疫苗方面的研究进展,并展望了其发展方向。     

丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCVHVR1模拟表位融合蛋白。用Westernblot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况。皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应。结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35)。融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCVHVR1合成肽发生交叉反应。本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值。     

丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCV HVR1模拟表位融合蛋白.用Western blot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况.皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应.结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35).融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCV HVR1合成肽发生交叉反应.本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值.     

HCV抗原表位预测

应用网络生物信息资源查找丙型肝炎病毒基因组全序列,用软件Lasergene中的EditSeq将来自中国河北株mRNA序列翻译为氨基酸序列,尔后用程序Protean进行氨基酸序列分析,对HCV各区段的B细胞抗原指数进行预测。同时又在两个网站对中国汉族人中频率较高的HLA基因型进行CD8和CD4T细胞表位预测。B细胞和T细胞抗原表位预测结果对于HCV诊断试剂和疫苗研制有重要的指导意义。     

丙型肝炎病毒多表位抗原在恒河猴中的免疫应答及保护性试验

利用HCV抗原多表位来研制HCV疫苗是目前的一个新方向.本研究利用HCV的HCV的5个保守表位串联,并加入破伤风类毒素上的一个T细胞激活位点,设计成一个HCV多表位抗原基因PCX,在大肠杆菌中表达,用此蛋白免疫恒河猴,诱导猴体产生了较高的抗体水平,滴度达11000以上,在免疫后的60周抗体滴度仍达140以上.同时,在免疫后6周用人HCV阳性血清攻击猴子,免疫PCX的猴子出现一过性ALT升高,在攻击后三周内用RT-PCR检测到猴血清内HCV的RNA阳性.结果表明,免疫多表位的PCX蛋白可以诱导机体产生高水平的免疫应答.     

丙型肝炎病毒多表位抗原在恒河猴中的免疫应答及保护性试验

利用ＨＣＶ抗原多表位来研制ＨＣＶ疫苗是目前的一个新方向。本研　究利用ＨＣＶ的ＨＣＶ的５个保守表位串联,并加入破伤风类毒素上的一个Ｔ细胞激活位点,设计成　一个ＨＣＶ多表位抗原基因ＰＣＸ,在大肠杆菌中表达,用此蛋白免疫恒河猴,诱导猴体产生了较　高的抗体水平,滴度达１∶１０００以上,在免疫后的６０周抗体滴度仍达１∶４０以上。同时,在免　疫后６周用人ＨＣＶ阳性血清攻击猴子,免疫ＰＣＸ的猴子出现一过性ＡＬＴ升高,在攻击后三周内用　ＲＴ－ＰＣＲ检测到猴血清内ＨＣＶ的ＲＮＡ阳性。结果表明,免疫多表位的ＰＣＸ蛋白可以诱导机体产生　高水平的免疫应答。     

丙型肝炎病毒高变区1模拟表位的交叉反应性分析

研究丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)高变区1(Hypervariable region 1,HVR1)抗原表位的交叉反应性,获取高反应性的抗原表位.设计并合成5种HVR1模拟表位基因,构建编码HVR1模拟表位的表达载体,表达并纯化表位蛋白.ELISA法检测表位蛋白与35份HCV抗体阳性血清的交叉反应性.包装HCV假病毒(HCV pseudotype particles,HCVpp),评价表位蛋白免疫BALB/c鼠血清在假病毒感染Huh7.5细胞中的作用.结果表明,表达纯化的5种表位蛋白(P1、P2、P5、P6、P8)均可与HCV抗体阳性血清反应,阳性反应率分别为54.3%(P1)、62.9%(P2)、80%(P5)、68.6%(P6)、54.3%(P8).表位蛋白P6、P8免疫BALB/c鼠血清对HCV假病毒感染Huh7.5细胞具明显的抑制作用.结果提示,选取的HVR1模拟表位在HCV感染免疫与疫苗研制中可能具有潜在的价值.     

丙型肝炎病毒高变区基因变异特点初探

对两例ＨＣＶＲＮＡ持续阳性者分三个时间点随访五年,测定了ＨＣＶ的高变区基因序列,每个时间点平均测定２８个克隆,总共测定了１６８个克隆。研究发现ＨＣＶ高变区基因变异有五个明显特点：（１）变异程度大,高变区至少有８９％的核苷酸位点都可能发生变异;（２）变异形式多样,除常见的替代突变外,缺失突变（缺失１、２或３个核苷酸）的克隆数占总克隆数的２２．５％;（３）优势克隆明显,即有若干个克隆高变区的核苷酸和氨基酸序列相同;（４）类似株现象严重;（５）变异幅度大。该研究说明ＨＣＶ高变区基因变异具有高度复杂多样性。     

丙型肝炎病毒诱发肝细胞癌的分子机制

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的一种肝脏疾病。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一。大量实验和临床研究表明,HCV的感染是导致肝细胞癌的主要因素之一。尽管目前可以通过直接抗病毒药物治疗HCV感染,但是患肝细胞癌的风险仍然存在。HCV诱发肝细胞癌是一个多步骤过程,其可能是通过病毒因子直接作用和/或通过引起慢性炎症诱发肝癌。因此,需要更好地了解HCV诱发肝细胞癌的分子机制,为肝细胞癌的防治提供研究基础。本文就近年来国内外对丙型肝炎病毒直接作用诱发肝细胞癌的分子机制进行综述,具体从血管生成、细胞凋亡、细胞增殖、上皮 间质转化、脂肪变性和氧化应激6个方面进行阐述,以期更好地了解HCV诱发肝细胞癌的分子机制,为肝细胞癌的防治提供研究基础。     

丙型肝炎病毒诱发肝细胞癌的分子机制

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的一种肝脏疾病。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一。大量实验和临床研究表明,HCV的感染是导致肝细胞癌的主要因素之一。尽管目前可以通过直接抗病毒药物治疗HCV感染,但是患肝细胞癌的风险仍然存在。HCV诱发肝细胞癌是一个多步骤过程,其可能是通过病毒因子直接作用和/或通过引起慢性炎症诱发肝癌。因此,需要更好地了解HCV诱发肝细胞癌的分子机制,为肝细胞癌的防治提供研究基础。本文就近年来国内外对丙型肝炎病毒直接作用诱发肝细胞癌的分子机制进行综述,具体从血管生成、细胞凋亡、细胞增殖、上皮 间质转化、脂肪变性和氧化应激6个方面进行阐述,以期更好地了解HCV诱发肝细胞癌的分子机制,为肝细胞癌的防治提供研究基础。     

河北省丙型肝炎病毒基因分型研究

丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus, HCV)感染是输血后肝炎的主要原因[1],主要通过输血或使用污染的血制品传播[2],且与肝硬化和肝细胞癌的发生有密切关系.     

河北省丙型肝炎病毒基因分型研究

Using nested RT-PCR and type special primers of HCV, we performed genotype analysis of HCV RNA from five representative cities in Hebei Province. Among 168 samples with HCV RNA, 104 sera was typelb(61.9%), type 2a account for 22.6% (38/168) , and lb/2a mixed-type was 15.5% (26/168) . The results indicate that typelb is the dominance strain in Hebei Province. Compared with type 2a, typelb has important relationship with chronic hepatitis C. This study build up some foundations for diagnosis, treatment and vaccine study of hepatitis C.     

丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

提高对丙型肝炎患者实验室检测的灵敏度和特异性,对相关人群进行筛查和早期诊断,是控制丙型肝炎病毒(HCV)流行与传播的有效措施。为了建立更为可靠的HCV诊断方法,通过采用PCR方法从J6/JFH12a型病毒中克隆出HCV ns3基因片段,将其连接到p ET-28a载体上,重组载体p ET-28a-ns3转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,以10%SDS-PAGE进行鉴定,获得表达的NS3重组蛋白分子量为72 k Da。将纯化的NS3蛋白免疫BALB/c小鼠,第4次免疫后采集血液并分离血清进行抗体活性鉴定,小鼠抗体效价为1∶256 000。进一步的Western blotting和间接免疫荧光结果显示,以重组NS3蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体可以很好地识别HCV感染Huh7.5.1细胞中的NS3蛋白,为下一步开展单克隆抗体制备和检测试剂盒研制工作奠定了基础。     

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展

由于缺乏合适的HCV感染细胞模型,严重制约了HCV复制,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的研究.对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp.NS5B C端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性.在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制,特别是能有效复制HCV全长(+)RNA.高浓度GTP激活HCV RdRp活性.NS5B N/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性,但D区345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高.HCV RdRp的发现及其功能研究为HCV药物研究提供了新型靶标.     

Hepatitis C Virus Particle Assembly Involves Phosphorylation of NS5A by the c-Abl Tyrosine Kinase

Hepatitis C virus (HCV) nonstructural protein 5A (NS5A) is thought to regulate the replication of viral RNA and the assembly of virus particles in a serine/threonine phosphorylation-dependent manner. However, the host kinases that phosphorylate NS5A have not been fully identified. Here, we show that HCV particle assembly involves the phosphorylation of NS5A by the c-Abl tyrosine kinase. Pharmacological inhibition or knockdown of c-Abl reduces the production of infectious HCV (J6/JFH1) particles in Huh-7.5 cells without markedly affecting viral RNA translation and replication. NS5A is tyrosine-phosphorylated in HCV-infected cells, and this phosphorylation is also reduced by the knockdown of c-Abl. Mutational analysis reveals that NS5A tyrosine phosphorylation is dependent, at least in part, on Tyr³³⁰ (Tyr²³⁰⁶ in polyprotein numbering). Mutation of this residue to phenylalanine reduces the production of infectious HCV particles but does not affect the replication of the JFH1 subgenomic replicon. These findings suggest that c-Abl promotes HCV particle assembly by phosphorylating NS5A at Tyr³³⁰.     

A p7 Ion Channel-derived Peptide Inhibits Hepatitis C Virus Infection in Vitro

Viral infection is an early stage of its life cycle and represents a promising target for antiviral drug development. Here we designed and characterized three peptide inhibitors of hepatitis C virus (HCV) infection based on the structural features of the membrane-associated p7 polypeptide of HCV. The three peptides exhibited low toxicity and high stability while potently inhibiting initial HCV infection and suppressed established HCV infection at non-cytotoxic concentrations in vitro. The most efficient peptide (designated H2-3), which is derived from the H2 helical region of HCV p7 ion channel, inhibited HCV infection by inactivating both intracellular and extracellular viral particles. The H2-3 peptide inactivated free HCV with an EC₅₀ (50% effective concentration) of 82.11 nm, which is >1000-fold lower than the CC₅₀ (50% cytotoxic concentration) of Huh7.5.1 cells. H2-3 peptide also bound to cell membrane and protected host cells from viral infection. The peptide H2-3 did not alter the normal electrophysiological profile of the p7 ion channel or block viral release from Huh7.5.1 cells. Our work highlights a new anti-viral peptide design strategy based on ion channel, giving the possibility that ion channels are potential resources to generate antiviral peptides.     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．