海绵中可培养与原位微生物组成的DGGE指纹分析

采用不依赖于分离培养的PCR-DGGE基因指纹技术对我国南海4种海绵体内的原位微生物种群组成以及混合培养的海绵微生物组成进行分析,通过比较不同指纹图间的差异与相似性,揭示可培养微生物与海绵原位存在的微生物的关系。由实验可以看出,来自同一海域的不同海绵体内的微生物存在宿主特异性,不同的培养条件是影响微生物可培养的重要因素,目前所能培养的海绵微生物还仅占自然环境下海绵微生物总量的很少一部分。     

海绵共附生细菌种群组成的PCR-DGGE基因指纹分析

采用不依赖于分离培养的16S rDNA的PCR-DGGE基因指纹技术对我国南海的细薄星芒海绵、皱皮软海绵、贪婪倔海绵、澳大利亚厚皮海绵体内的优势细菌的种群组成进行了比较分析。结果显示:每种海绵体内都含有丰富多样的细菌;通过DGGE指纹图的聚类分析发现来自同一海域的不同海绵的共附生细菌的种群组成具有明显不同,即共附生细菌具海绵宿主特异性;同时也发现有相同的细菌存在于不同的海绵体内。     

温度对厚指海绵Pachychalina sp.体内真细菌的影响

摘要：温度是影响微生物多样性的重要因素之一。【方法】本研究采用16S rDNAs扩增产物酶切片段多态性（amplified rDNA restriction analysis , ARDRA）和16S rDNAs序列分析方法,对生长在16℃和30℃条件下厚指海绵Pachychalina sp.体内真细菌（eubacteria）的多样性进行了研究,【目的】探讨温度对海绵体内细菌的影响。【结果】根据ARDRA 聚类分析,16℃条件下海绵体内100个真细菌的16S rDNAs克隆片断被分成34个类群,而30℃条件下,海绵体内100个细菌的16S rDNAs克隆片断则被分为32个类群,说明在不同温度条件下,海绵体内真细菌的组成与群落结构有所变化,但研究发现温度没有明显改变海绵体内真细菌总的群落结构。【结果】根据厚指海绵Pachychalina sp.体内真细菌的16S rDNAs序列分析结果发现：在16℃和30℃条件下,海绵体内的真细菌均属于α、γ、δ-变形菌、硫细菌、硫还原菌和烃类分解菌,此外还有少数放线菌。16℃条件下海绵体内的优势菌为γ-变形菌,而且体内的硫细菌和硫还原菌主要是耐寒细菌,而30℃条件下海绵体内的优势菌为α-变形菌。该研究还发现：同一ARDRA类型的克隆序列分析表明在同一ARDRA群内各组分间彼此关系比较密切。     

繁茂膜海绵细胞内微生物多样性的研究

采用海绵组织离散、细胞分离的方法,对繁茂膜海绵细胞进行纯化、胞内微生物DNA提取,构建了繁茂膜海绵细胞内微生物的16SrDNA克隆,对其遗传多样性进行了分析,发现海绵细胞内微生物16SrDNA序列主要归类于紫硫细菌门(Proteobacteria)中的α-亚门、γ-亚门和浮霉菌门(Planctomycetes)等类群。与研磨直接提取海绵组织DNA所得海绵组织中总微生物多样性相比,海绵细胞内存在丰富的浮霉菌(23%),说明浮霉菌主要存在于海绵细胞胞内。     

海绵共生微生物研究中的分子技术

海绵共生微生物与海绵活性物质有紧密的关系,由于其大多不可培养,分子生物学技术成为海绵微生物研究的有效方法。本文重点介绍了海绵共生微生物研究中经常应用到的FISH、PCR、16S rRNA克隆测序、DGGE、RFLP等各种分子技术,对它们的特点及缺陷进行了分析与小结,希望有助于海绵共生微生物分子研究的进一步发展。     

海绵Pachychalina sp.体内细菌多样性的研究

通过非分离培养分析方法,直接从海绵体内提取细菌总DNA。以样品总DNA为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA。用16S rDNA限制性酶切片段长度多态性(ARDRA)和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp．体内的细菌多样性进行了研究。在细菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱间存在差异;随机挑选22个克隆进行测序得到它们的16S rDNA部分序列,大部分序列属于γ-proteobacterium和α-proteobacterium,但有少数克隆序列与RDP数据库中收录的16S rDNA序列间的相似性极小,不参与系统发育树的构建。研究结果表明海绵Pachychalina sp.体内细菌组成具有丰富的多样性。     

利用海綿大量培养微生物

在大量培养需氧性微生物时,在培养过程中应重视其通气措施,一般须将菌体悬浊液经常地予以搅拌或震荡。最近美国学者弗雷曼(Freeman)创造了一种简易的方法,利用海绵来培养需氧性微生物,这样解决经常通气的问题。他把海绵纤维置于金属制的圆筒中,使菌株接种于培养液中以后,然后灌于海绵上,使海绵吸附于菌株培养液,必要时可使用活塞进出圆筒,以便对海绵发生压缩或送气作用。经过这种方式培养的微生物数量可大增,而且精简一些烦杂的通气和震动等的措施。     

未培养微生物原位培养技术研究进展

近几十年来,可培养微生物被不断重复培养和筛选,从中分离结构新颖、活性显著的化合物越来越困难,而这些可培养微生物却仅占微生物总数的1%。未培养微生物是指迄今为止在实验室中还无法纯培养的微生物(占99%)。为了解决未培养微生物问题,科学家们突破了传统的培养方式建立了新型原位培养技术。文章详细介绍了未培养微生物在自然环境中的多样性及重要性、微生物不可培养的原因,重点介绍研究策略以及基于原位培养技术原理发展起来的5种未培养微生物培养分离方法,指出了未培养微生物培养技术的发展方向以进一步促进难培养微生物资源的开发与利用。     

海绵特异性微生物的分子钟初测及其意义

海绵动物是最原始的后生动物,营底栖、滤食性生活,它们体内共生有丰富的微生物菌落,包括仅在海绵动物体内存在的特异性微生物。为了探讨海绵特异微生物是否与宿主存在协同演化关系,我们基于16SrRNA基因序列利用宽松分子钟方法估测了各个门类中海绵特异微生物的分歧时间,并与海绵动物的化石记录及分子谱系年代学结果相比较。结果表明:多数微生物门类中海绵特异微生物的分支分化发生在新元古代(800—1000Ma),与海绵动物的分子化石记录和当前分子钟估算结果之间存在一定程度的一致性,说明微生物与宿主海绵动物之间存在一定的协同演化关系。少数门类中海绵特异微生物分化时间过早于(如蓝细菌,2200Ma)或者过晚于(如古细菌,148Ma;Alphaproteobacteria,480Ma)新元古代,这可能是由于系统采样等因素所致,有待于进一步的分析与研究。     

中国海绵天然产物的研究

据统计,从海洋生物的天然产物中获得药物或药物先导化合物的几率要比陆源生物高,海绵是海洋中除珊瑚以外的第二大生物资源。在海绵体内已发现许多高活性的化合物。中国海绵的研究主要集中在南海。南海海绵种类多、数量大,样品采集比较容易。本文统计调查了国内外海绵研究的现状,重点综述中国已研究的海绵种类、所获得的天然化合物以及相关产物的药理研究结果,对上述研究的特点与存在的不足进行了分析、讨论。     

汉阳陵陶俑表面微生物群落结构与种群多样性分析

【背景】汉阳陵是我国截至目前发现的规模最大、陪葬级别最高的汉代陶俑群,出土了大量形神毕肖的裸体俑群,考古学家认为这种裸体陶俑原本“着衣、装木臂”,称为“着衣式陶俑”,为皇室独有,异常珍贵。然而这些推测尚无科学依据,而且陶俑表面附着微生物可能会腐蚀俑体。【目的】通过比较研究汉陶俑表面微生物的组成差异,为汉裸体陶俑着有衣物且装有断臂的推测提供一定的科学佐证,同时为汉陶俑微生物腐蚀的防控提供靶标。【方法】应用微生物高通量测序与纯培养相结合的方法,对着衣式陶俑不同部位微生物进行测定。【结果】高通量测序结果显示女俑头部微生物多样性较高;男俑上半身微生物多样性最高,腿部居中,头部较低。汉陶俑表面微生物组成按俑的类别及不同部位聚集在一起,其优势菌为放线菌门的克洛斯氏菌属、糖多孢菌属、假诺卡氏菌属及链霉菌科,其他各部位优势类群相对丰度存在差异,断臂处与碳循环相关功能微生物的相对丰度最高。纯培养结果显示女俑头部的可培养细菌数量高于男俑头部可培养的细菌数量;男俑上身与腿部可培养的微生物数量高于男俑头部,表明上半身与腿部可能有衣物覆盖,导致其营养差异。【结论】汉陶俑头部与身体表面部位微生物多样性与组成存在明...     

湖光岩玛珥湖可培养浮游细菌的BOX-PCR图谱及生物多样性分析

玛珥湖是一类具有独特地质构造特征的火山口湖泊, 目前国内外对玛珥湖内微生物多样性的研究还鲜有报道。为了解具有典型玛珥特征的湖光岩湖泊中可培养浮游细菌的种群资源特征, 采用盒式PCR (BOX-PCR) 筛选技术, 通过通用贫营养和原位湖水培养基研究在冬夏两季各水层内获得的可培养细菌种群的差异。结果表明: 不同培养基在不同水层上表现的细菌数量的变化相一致, 为夏季的5 m>1 m>13 m, 冬季的1 m>5 m>13 m, 变形菌占据优势地位, 其它为放线菌、厚壁菌和拟杆菌; 两类培养基上所获培养菌BOX-PCR图谱的多样性相似, 但菌群结构不同; 而细菌多样性在季节上的变化表现为冬季高于夏季, 这与相关湖泊内细菌微生物多样性在夏季会发生减少的特点相似; 相同季节同一水层上不同培养基上获得的培养菌门类不同, 表明此类通用性培养基在培养该环境微生物中的局限。研究的结果为探讨此类型湖泊微生物多样性与环境的关系及分离该环境下特定微生物菌株提供参考。     

昆虫肠道微生物及其功能研究方法进展

昆虫是世界上种类最为丰富、分布最为广泛的动物类群，其肠道内栖息着复杂且多样的微生物。不同昆虫因肠道结构、肠道内环境、食性、龄期、外界环境不同，肠道内微生物组成与丰度也存在差异。肠道微生物主要通过垂直方向与水平方向在种群与个体间传播，对昆虫宿主营养代谢、生理行为、防御、解毒等诸多方面有重要影响；通过体外培养的方法可从培养基对昆虫肠道微生物进行分离，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)及16S rRNA基因测序技术等可迅速鉴定微生物；宏基因组学、蛋白质组学、代谢组学等多种组学技术联合运用，使得肠道微生物鉴定与功能推测更为高效；体外试验、微生物补充、菌群移植、沉默微生物成员相关基因等试验方法使微生物功能验证更为准确；利用高温处理、溶菌酶处理、无菌饲养处理及抗生素处理等方式能清除肠道内的微生物群落，获得无菌昆虫用于功能验证试验，但当前使用最广的抗生素法在实际应用中仍存在一定局限；利用肠道微生物特性，通过共生菌基因工...     

增强型生物除磷过程中聚磷酸盐积累微生物的研究进展

从磷污染控制、污水脱磷和磷资源角度论述了生物除磷的作用,并着重论述了增强型生物除磷过程中聚磷酸盐微生物(PAO)的研究历史、代谢特征及研究方法．聚磷酸盐广泛存在于自然界,但只有少数PAO微生物被分离、培养、鉴定出来．培养基能否分离出PAO和PAO能否在实验室条件下表现出polyP积累特征,均至关重要．糖原积累微生物(GAO)与PAO对碳源存在竞争关系,影响EBPR的效率．原位荧光分子杂交、激光共聚焦扫描电镜、微量放射自显影术、活体核磁共振光谱等现代科学技术的发展。使我们能够观察原位微生物群落组成、空间结构和功能变化．对PAO的深入研究,可改进污水脱磷的效率,提高对磷在环境中迁移转化的认识     

环境中微生物原位检测方法研究进展

微生物是生态系统物质循环和能量流动的主要参与者,在生态系统中起着重要的作用。但在现有技术条件下可培养微生物所占比例极小,限制了微生物资源的开发利用。目前有许多方法,可以避开微生物不可培养的问题,直接对微生物进行原位检测。对此,将前人关于微生物生态的原位检测研究方法进行了综述,方便以后对这些方法的合理应用。分别从DNA水平、RNA水平和蛋白质水平,介绍了对应的原位微生物检测方法(如Brd U标记、DNA-SIP、FISH和环境转录物组等),比较了它们的优缺点,并介绍了如何将这些方法与目前流行的高通量测序、单细胞测序等技术相结合来捕获原位活性微生物组等。同时,还对这些方法的特点进行了比较,使得人们可以更清楚地了解在不同场景下对不同方法的选择。这些经过改进的新兴方法及其与其它方法的结合使用将有助于解决微生物生态学研究中出现过或即将出现的很多问题。地球上的各种生态系统复杂而庞大,包含的微生物种群也各有差异。各种原位检测方法对微生物生理生态做出了更加真实有效的描述,必将成为研究微生物生态的有力手段。     

游离氨基酸和甜菜碱类在海产海绵细胞内渗透压调节中的作用

本文分析了海绵纲中六种海产海绵体内所含的游离氨基酸和甜菜碱类,并研究了两种生活在潮间地带的海绵在低或高渗条件下所含成分浓度的变化。研究发现,在海绵体内富含游离氨基酸和甜菜碱类,其中以高含量的甘氨酸为特点。环甜菜碱的含量如龙虾肌碱和N-甲基烟酸内盐高于ω-甜菜碱如甜菜碱、β-丙氨酸甜菜碱和三甲铵丁内酯,其中N-甲基烟酸内盐在海绵Halichondria japonica中含量最高。虽然两种潮间地带海绵中游离氨基酸和甜菜碱类的浓度随盐度变化而波动,但这些成分总的变化是由于甘氨酸的作用。     

海绵Pachychalina sp.体内细菌多样性的研究

通过非分离培养分析方法,直接从海绵体内提取细菌总DNA。以样品总DNA为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA。用16S rDNA限制性酶切片段长度多态性（ARDRA）和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp.体内的细菌多样性进行了研究。在细菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱间存在差异;随机挑选22个克隆进行测序得到它们的16S rDNA部分序列,大部分序列属于γproteobacterium和αproteobacterium,但有少数克隆序列与RDP数据库中收录的16S rDNA序列间的相似性极小,不参与系统发育树的构建。研究结果表明海绵Pachychalina sp.体内细菌组成具有丰富的多样性。     

分子生态学方法在微生物肥料质量监测中的应用

应用PCR—DGGE技术对某微生物肥料的质量进行了跟踪监测,并结合分离培养和克隆文库分析对其菌种组成进行了检测。结果表明,同一生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌DGGE（denaturing gradient gel eleetrophoresis）图谱相似性为80％-100％,3个不同生产批次之间DGGE图谱相似性为80％-88％,表明该微生物肥料的菌种组成的稳定性较好。但分离培养和克隆文库分析结果显示样品的菌种组成与产品标签说明之间存在较大差异。对于产品标注的6种微生物组成,只有Lactobacillus属的微生物可与之对应,其他检测到的Bacillus、Monascus、Brevibacillus、Psudomonas和Penicillium属的微生物并未包括在产品说明中。研究表明用分子生态学方法可以比较客观准确的对微生物肥料质量进行评估和峪测。     

自然界中不可培养微生物的研究进展

尽管微生物培养技术已经发展了几十年,但是环境中可培养的微生物比例仍然较低。目前研究者对微生物不可培养的原因有了进一步的了解,其关键在于：高浓度的营养基质、无法实现原位培养、不明确环境中微生物之间的相互作用、缺乏尖端的微生物检测方法等。研究者为了克服这些培养障碍,不断研究出许多提高微生物培养效率的方法,简要介绍改进培养基、发展新的培养条件等提高微生物可培养性的方法。     

繁茂膜海绵原细胞富集细胞团培养过程中的细胞迁移规律

海绵是重要的生物活性物质来源, 近10年来, 从海绵中发现的具有生物活性的新化合物占海洋生物来源的30%以上, 并且大多具有显著的抗肿瘤, 抗艾滋病病毒的活性。但是, 由于海绵生物量不能满足这些活性物质进一步研究和商业化的需求, 目前仅有一种活性物质被成功的商业化, 这不仅是商业开发的损失, 也是提高人类生活质量活动的一种损失。为了解决海绵供给不足的问题, 人们进行了包括化学合成、海绵养殖以及海绵细胞培养在内的多种尝试,目前的研究结果表明, 海绵细胞离体培养技术是最有可能彻底解决海绵供给不足的途径之一。但是由于海绵自身的特殊性, 还没有人成功的建立起海绵细胞系以满足生产需要。人们发现, 海绵细胞的相互接触对于离体海绵细胞长期培养至关重要。经过多年的探索, 大连化物所海洋生物产品工程组建立了开发出了海绵原细胞富集细胞团培养技术, 通过对海绵组织内的原细胞进行富集来获得可长期培养的海绵细胞。海绵原细胞是海绵组织内的“干细胞”, 具有很强的分化、增殖潜力, 同时也是海绵组织内负责消化的主要细胞类型。为了探索海绵原细胞的增殖、分化规律, 本研究基于海绵原细胞富集细胞团培养体系, 构建了海绵细胞培养实时观测平台, 对繁茂膜海绵原细胞、领细胞、上皮细胞3类主要海绵细胞类型在海绵细胞团形成及生长的全过程进行观察, 了解不同类型细胞迁移规律的变化。通过对视频记录进行分析,发现离散的海绵细胞与细胞团内的海绵细胞具有截然相反的运动规律, 海绵细胞的运动具有很强的协同性。伴随原细胞在细胞团内不停息的迁移, 还观察到海绵细胞团内新生骨针的迁移以及细胞间进行颗粒物质的传递。这些信息的获得, 将有助于进一步了解不同细胞的功能与作用, 也有助于在此基础上探索海绵细胞的增殖、分化控制规律。