α—淀粉酶基因表达中启动子上游区EcoRI—BclI片段的生理功能

本文从ｐＡｍｙ４１和ｐＮＬ２０１出发,构建一系列α－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲｉ－ＢｃｌＩＩ片段的人或部分缺失的质粒,并构建了ｐＡｍｙ４１系列质粒ｐＡｍｙ４１系列、ｐＮＬ２０１系列双质粒工程菌,通过对这些工和力α－淀粉酶基因表达水平的分析显示,Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－Ｂｃｌｌ片段在α－淀粉酶基因表达中行使负的调控功能。     

利用枯草杆菌α-淀粉酶分泌载体合成和分泌具有生物活性的鼠β干扰素

经BAL31酶消化除去信号序列的鼠β-干扰素(IFN-β)cDNA,引入到用枯草杆菌α-淀粉酶基因的启动子和信号序列所构造的一个枯草杆菌分泌载体中。把得到的嵌合质粒转移进枯草杆菌207-25中。采用菌落杂交和一种新的、用于分泌蛋白质的免疫印迹方法选出四株卡那霉素抗性转化株。这些转化株把与羊抗-IFN-β血清起交叉 反应的蛋白分泌到培养基中去。用L细胞和水泡性口膜炎病毒系统检测,其中一株表达一种高IFN-β活性,而其它三株表现弱的或没有IFN-β活性。基于我们先前的研究[Ohmura等人,Nucl.Acids Res.12(1984)5307-5319],认为这种分泌的IFN分子是杂种蛋白,在这分子中,NH_2-末端区域由一部分α-淀粉酶信号肽组成。核苷酸序列分析指出:表达高IFN活性的pTUB502质粒是与来自鼠的成熟蛋白质的密码子位置6的IFN-β基因连接。其它三个质粒,pTUB506、pTUB509和pTUB519分别含有来自密码子位置3,1和5的鼠IFN-β基因。鼠IFN-β的NH_2-未端区域似乎与它的生物活性紧密相关。     

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20（b）中构建成质粒pET—amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20（b）中构建成质粒pET—amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET—amyAⅠ中构建成质粒pET—amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E．coli JM109（DE3）,并将重组质粒pET—amyAⅠ转化E．coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIL。通过IPTG诱导测酶活性：在E．coli JM109（DE3）中表达的重组酶（pET—amyA）、（pET—amyAⅠ）、（pET—amyAⅡ）的酶活分别是1658．0U／mL、6721．7U／mL、8904．5U／mL,在E．coil BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中表达的重组酶（pET—amyAⅠ）的酶活是13867．7U／mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。     

枯草杆菌α－淀粉酶基因的克隆和表达

以自构的质粒pBEl为载体,采用鸟枪法克隆枯草杆菌168突变株GRl0的α－淀粉酶基因,获得了在大肠杆菌中的表达。该基因片段位于7367bp的Bgl Ⅱ酶切片段上。利用质粒pUB110。将此片段亚克隆到枯草杆菌中,同样也获得了表达。本文还测定了该基因克隆子是否有GR10的抗葡萄糖阻遏效应。     

C型产气荚膜梭菌α、β_1毒素基因的融合

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出α和β1毒素基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含αβ1融合基因表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1)。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1含有αβ1融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的αβ1融合蛋白能够被α、β1毒素抗体识别。免疫实验结果表明,αβ1融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的C型产气荚膜梭菌C5944毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

藤黄微球菌纤溶酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

MLFE(Micrococcus luteus fibrinolytic enzyme)是由一株新的纤溶酶产生菌藤黄微球菌ML909分泌的胞外纤溶酶。从一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DC-4中克隆a-淀粉酶基因的启动子－信号肽序列, 将其与mlfe基因(GenBank, 登录号为EU232121)的成熟肽编码序列相融合, 构建成融和基因amymlfe。将该基因克隆到大肠杆菌－枯草芽孢杆菌穿梭质粒pSUGV4上, 构建成表达质粒pSU-AmyMLFE, 再将其转化     

通过同源介导α-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌α-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一.为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL.将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株Bacillus licheniformis B0204,再在卡那霉素存在下介导其B.1icheniformis B0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子.对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定.与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高.其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%.     

调节猪TNF-α表达的miRNAs鉴定

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是脂肪细胞的分泌产物之一,在脂肪中行使着复杂的调节功能,为了研究猪脂肪组织中TNF-α的表达受到哪些miRNA的调控,从猪脂肪组织基因组中获得猪TNF-α3'端非翻译区(UTR)序列,与荧光素酶质粒PGL3-control连接构建猪TNF-α的萤光素酶表达质粒PGL3-TNF-α3'UTR。生物信息学预测miR-19a,miR-124,miR-130a,miR-301,miR-506等miRNAs均靶向猪TNF-α,将这些miRNA分别与PGL3-TNF-α3'UTR质粒共转到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对质粒荧光素酶活性的作用。结果发现miR-19a,miR-124和miR-130a均能够显著抑制萤光素酶的活性(P0.01),为了验证这3个miRNA是否通过各自种子序列起调控作用,突变了PGL3-TNF-α3'UTR中这3个miRNA种子序列的结合位点,结果发现miRNAs对突变质粒中的荧光素酶均无明显抑制作用(P0.05)。结果证明,miR-19a,miR-124和miR-130a与猪TNF-α均有直接的靶向关系并通过各自种子序列抑制TNF-α的表达。     

碱性成纤维细胞因子在枯草芽孢杆菌BS224中的表达

让一种有抗菌活性的非致病性枯草芽孢杆菌BS224表达碱性成纤维细胞生长因子（bFGF),使其同时具有抗菌和促进伤口愈合的作用。用PCR方法克隆了一个α－淀粉酶高产株的α－淀粉酶基因的启动子和信号肽序列及3'端序列,合成了gnt(葡萄糖酸盐操纵元）终止子序列作为构建, 碱性成纤维细胞因子的cDNA序列一起插入质粒pHV32组建成整合型载体,该质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322和枯草村菌质粒pC194。然后通过原生质体转化法转化BS224,氯霉素抗性筛选得到转化体,用α－淀粉酶分析实验和Southern杂交证明其发生了同源重组,Western杂交证明碱性成纤维细胞因子有表达。     

通过同源介导a-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌a-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一。为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL。将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株BacilluslicheniformisB0204,再在卡那霉素存在下介导其B.licheniformisB0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子。对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定。与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高。其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%。     

α－淀粉酶基因表达中启动子上游区EcoRI－BclI片段的生理功能

本文从ｐＡｍｙ４１和ｐＮＬ２０１出发,构建了一系列α－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－ＢｃｌＩ片段缺失或部分缺失的质粒,并构建了含有ｐＡｍｙ４１系列单质粒ｐＡｍｙ４１系列、ｐＮＬ２０１系列双质粒工程菌。通过对这些工程菌α－淀粉酶基因表达水平的分析显示,Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－ＢｃｌＩ片段在α－淀粉酶基因表达中行使负的调控功能。     

短短小芽孢杆菌启动子筛选载体的构建

为了筛选短短小芽孢杆菌强启动子元件,应用PCR技术从枯草杆菌168中分离出α-淀粉酶基因,用其作为报告基因与质粒pUB110和pKF3一起构建了启动子筛选载体pKB/A.将短短小芽孢杆菌细胞壁蛋白基因启动子引入该载体构建成重组质粒pKB/PA,电穿孔法转化短短小芽孢杆菌50后发现α-淀粉酶以活性形式分泌表达.结果表明短短小芽孢杆菌启动子筛选载体构建成功.     

高温α-淀粉酶高表达的研究

为了进一步提高工业上重要的地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶(BLA)的发酵生产性能,以高温α-淀粉酶基因(amyL)为目的基因,构建地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶基因产生菌的整合表达通用性质粒pB li16 s-amyL-EryR,采用原生质体转化法将此整合型表达质粒导入B.licheniformis CBBD302,在整合表达质粒中的16SrDNA序列的介导下实现了同源整合。挑选20株阳性转化子,分别通过提高培养基中红霉素的使用浓度,增加染色体上目的基因amyL的拷贝数,由此获得的重组菌的BLA生产水平提高了56.37%~80.29%。     

嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以质粒pATl53为载体,应用鸟枪法在大肠杆菌中建立了嗜热脂肪芽孢杆菌α－淀粉酶基因无性繁殖系。两个含α一淀粉酶基因的克隆的Hind Ⅲ片段均为4．5kb,内切酶谱也相同。本文还比较了从HBl01,p^a－1823和从基因供体菌中提取的α－淀粉酶的耐热性。     

能分泌活性α-淀粉酶(鼠胰)的稳定的酵母转化株

将鼠胰α-淀粉酶的cDNA插入酵母穿梭质粒,并位于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MFα1基因编码序列的启动子和分泌信号肽的后面。经这种重组质粒转 化的啤酒酵母即能合成和分泌有活性的α-淀粉酶,该酶能有效地水解培养基中的淀粉。已从不同的酵母株系得到遗传稳定的分解淀粉的细胞株。意味着可用酵母直接转化淀粉原料为酒精,在生产上这是很有意义的一步。     

强启动子glaA介导cbhB基因在黑曲霉中的表达

黑曲霉纤维素酶三类不同酶系中,纤维二糖水解酶基因表达处于很低水平,导致纤维素酶总体活力水平不高。为构建黑曲霉纤维素酶高产菌株,采用基因工程方法,全基因合成拼接黑曲霉高表达葡萄糖淀粉酶基因glaA的强启动子片段与纤维二糖水解酶基因cbhB编码区片段,然后将杂合基因克隆到二元载体pCAMBIA1301上,重组质粒通过农杆菌介导转化黑曲霉分生孢子,携带杂合基因的T-DNA片段插入到黑曲霉转化子的染色体上,共筛选到48个具有潮霉素抗性的转化子。纤维素酶活力水平测定结果显示,转化子A3-9的CMC酶活力最高,为野生型黑曲霉菌株的1.31倍;转化子B1-7与A3-6的滤纸酶活力最高,为野生型黑曲霉菌株2.51倍。另外,初步分析了杂合基因在黑曲霉中的表达所需的诱导条件。     

含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌C500遗传稳定性研究

为了分析研究含抑制素重组质粒pVAX-IS-asd(以下简写为pXAIS)的crp(cAMP受体蛋白)和asd(天冬氨酸β-半乳搪脱氢酶)基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株的遗传稳定性.方法:将现有的无抗性抑制素重组表达质粒pXAIS转化入crp和asd基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株(简称"空质粒株")中,得"含质粒株".将"含质粒株"细菌在无选择压力条件下传代培养50代.利用酶切鉴定方法,分析"含质粒株"细菌中抑制素pXA/S质粒的稳定性;利用PCR方法扩增菌株("含质粒株"和"空质粒株")保守序列中invA基因,分析各代细菌的invA基因稳定性;通过比较传代培养后各代细菌的生长图型,分析"含质粒株"细菌传代后的生长规律.结果表明,"含质粒株"细菌连续传代50次后,仍能检出pXAIS质粒和invA基因,而且生长规律与"空质粒株"没有明显差异.说明含pXAIS质粒的猪霍乱沙门氏菌crp和asd基因双缺失株具有良好的遗传稳定性.     

热稳定α—淀粉酶稳定性工程菌的构建

本文以质粒pE194为载体亚克隆B.licheniformis热稳定α-淀粉酶基因,构建成重组质粒pNW102,通过噬菌体PBS1将它转导进入中温α-淀粉酶生产菌B.subtilis BF7658。B.subtilis BF7658(pNW102)经过长时间非许可温度处理,筛选得到2株热稳定α-淀粉酶稳定性表达的工程菌株。酶学分析显示同源重组具有热点,2株重组菌株B.subtilis BFNW产生的热稳定α-淀粉酶符合B.licheniformis产生的淀粉酶特性。     

一种不依赖钙离子的酸性α淀粉酶基因的克隆表达

以产酸性淀粉酶菌株Bacillus sp.CN7的基因组DNA为模板,PCR扩增到α淀粉酶成熟肽基因,将该基因插入表达质粒pSE380中,构建重组质粒pSE380-cn7a。将重组质粒导入到Escherichia coli JM109中,IPTG诱导表达。重组酶经Sephacryl S300、Ni-NTA纯化后测定其酶学性质。重组酶CN7A的最适温度为65°C,最适pH为5.5?6.0,对可溶性淀粉的Km值为3.784g/L,最大反应速度为101.2mg/(L·min),该酶的热稳定性不依赖钙离子。     

α－淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α－淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌．酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示：在酵母MF—αl因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α－淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97%的淀粉。重组质粒能在酵母中较稳定地存在。