重组生防菌308R(pKSH)的遗传稳定性研究

工程菌308R（pKSH）携带有梨火疫欧文氏杆菌的hrpN基因,能产生并分泌诱导植物抗病性蛋白-Harpin。该工程菌在无选择压培养基中生长50代,带有重组质粒pKSH的细胞占总菌量的23．1％,对照菌308R（pCPP430）的细胞占4．75％。将工程菌和对照菌喷雾到番茄叶面,保湿条件下的13d内,叶面菌量维持在10^5cfu／cm^2以上,自然条件下的5d内,菌量维持在10^4cfu／cm^2以上,其间308R（pKSH）的稳定性一直高于对照菌。因此证明工程菌308R（pKSH）比对照菌308R（pCPP430）稳定性有所提高,但还是不够理想。讨论了该工程菌不稳定的原因以及改进途径。     

产harpin的成团泛菌工程菌308R(pCPP430)遗传稳定性的研究*

成团泛菌工程菌３０８Ｒ（ｐＣＰＰ４３０）带有梨火疫欧文氏杆菌的与过敏反应和致病性有关的基因簇 （ｈｒｐ）,可以产生能诱导植物抗病性的蛋白质ｈａｒｐｉｎ。该工程菌在ＬＢ液体培养基中生长５０代后,带有重 组质粒ｐＣＰＰ４３０的细胞占总菌量的 １％,带有载体ｐＣＰＰ９的细胞为４６％。工程菌喷雾到番茄叶面,保湿条 件下叶面菌量维持在 １０^５ｃｆｕ／ｃｍ２以上,其中带有 ｐＣＰＰ４３０质粒的菌维持在 ４０％以上,带有 ｐＣＰＰ９载体的 菌维持在８０％以上。因此,携带ｈｒｐ基因簇的质粒ｐＣＰＰ４     

多株功能菌种混合培养条件的响应面优化及其生长关系

对3种具有土壤中多种重金属污染修复和病虫害防治功能的光合细菌（Photosynthetic bacteria,PSB,包括Rhodobacter sphaeroides H菌株、Rhodopseudomonas palustris N菌株和Rhodospirillium rubrum M菌株）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis, BS）和植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum, LP）进行混合培养,利用单因素和响应面试验优化培养基配方以及培养条件。确定功能菌混合培养的最佳条件：以光合细菌培养基为基础培养基,外加碳源为10 g/L蔗糖、氮源为1.25 g/L硫酸铵、培养温度为31.5 ℃、初始pH值为7.1、接种量为接种后的初始培养活菌数1.90×10⁹cfu/mL、培养时间为28.0 h。通过功能菌的加性模型法、生长动力学以及混合培养的生长关系分析表明,光合细菌、枯草芽胞杆菌和植物乳酸杆菌的生长均存在互惠互利关系。     

一株产酸克雷伯氏菌发酵培养基优化

为提高产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的发酵水平,通过单因素优化,研究培养条件、碳源、氮源、无机盐对产酸克雷伯氏菌活菌量的影响,利用响应面分析法对影响产酸克雷伯氏菌活菌量的关键因子进行优化,30 L发酵罐进行扩大培养。得出最佳配方（质量分数）：黄豆饼粉2.19%,玉米粉1.0%,蔗糖1.10%,硫酸铵0.06%,玉米浆干粉0.5%,蛋白胨0.05%,硫酸镁0.04%,磷酸二氢钾0.02%,氯化钠0.080%,硫酸锰0.03%,pH 7.0~7.4。活菌量稳定在2.0×10¹⁰  cfu/mL以上,能够满足生产要求,为产酸克雷伯氏菌作为微生物菌肥的应用提供参考。     

黑色素皮质素受体激动剂的高通量筛选模型研究

为了建立黑色素皮质素受体（MC4R）激动剂的高通量筛选方法,将人的MC4R基因质粒（hMC4R/pCDNA3.1）与报告基因质粒（3×CRE/3×MRE/SRE-LUC）按1∶5的比例共转染到HEK293细胞,通过G418筛选,建立了稳定的MC4R激动剂筛选细胞株.利用MC4R内源激动剂α-MSH探索和优化了每孔接种细胞数目、激动剂孵育时间、溶剂DMSO终浓度、荧光素酶底物浓度等筛选条件,建立了可靠的筛选方法.实验表明：当细胞数目为4×10⁴个/孔,激动剂孵育时间为8 h,每孔DMSO终浓度小于1％和α-MSH终浓度为1 μmol/L时,系统Z'-因子接近0.7,能够用于MC4R激动剂的高通量筛选.     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

甘草内生细菌的分离及拮抗菌株鉴定

从乌拉尔甘草健康植株的根茎叶中共分离到内生细菌98株,经初步鉴定芽孢杆菌属（Bacillus sp.）为优势种群,约占30%;从不同生长年份甘草的根、茎、叶组织中分离内生细菌种群密度从5.0×10⁴ cfu/g～2.9×10⁷ cfu/g鲜重不等。采用平板对峙方法筛选出6株对植物病原菌有明显体外拮抗活性的菌株,通过菌落、菌体形态观察、生理生化反应及16S rDNA序列分析,同时结合Biolog细菌自动鉴定系统验证,鉴定这6株拮抗菌分属萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Paenibacillus ehimensis。     

栓菌漆酶在毕赤酵母中高效表达及重组酶的性质

栓菌420（Trametes sp. 420）漆酶基因lacD以两种方式在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）进行异源表达,产生两种重组漆酶：rLacDx（具有天然N-末端）和rLacDe（N-末端带有8个额外的氨基酸残基）。摇瓶发酵18d,rLacDx和rLacDe的产量分别为1.21×10⁵u/L、7.38×10⁴u/L ［以2,2′-连氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸（ABTS）为底物］。在高密度发酵条件下,rLacDx的产量增加到2.39×10⁵u/L,同时其生产周期降至7.5 d。两种重组酶对愈创木酚底物的氧化特性相似,且在50℃和pH3～10的范围内均稳定。然而,rLacDx对底物ABTS的比活力（1761u/mg）高于rLacDe （1122u/mg）,其表观K_m值(427μmol/L)低于rLacDe (604μmol/L)。     

REMI介导电转化产甘油假丝酵母

为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择Hind III进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD₆₀₀≈1.3 时收集细胞,在1.5 kV 电压下,感受态细胞浓度为2.0×10⁹个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μg DNA的较高转化率,58% 的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。     

Hyporheic biofilms — a potential food source for interstitial animals

Glass-beads (diam. = 250 μm) were buried 10 cm deep in the sediment of a stream. After an exposure of eight weeks, bacterial densities on the beads varied between 2.7 × 10⁵ and 2.4 × 10⁷/cm², and the length of the fungal mycelium between 0.2 and 5.3 mm/cm². Bacterial densities did not show any correlation with the DOC content of the water, but were positively correlated with respiration on the beads. Fungal mycelium was negatively correlated with water temperature. Acid hydrolysis of stream-exposed beads released sugars and amino acids, whose combined carbon content exceeded that of the microbial cells by a factor of at least 4. Gut extracts of Gammarus tigrinus and Tipula caloptera released amino acids and sugars from stream-exposed beads.     

悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的实验研究

利用5L生物反应器悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus-green fluorescent protein,Ad-GFP),为规模化生产腺病毒基因药物建立一种稳定可行的生产工艺。复苏的种子细胞进行逐级放大最后接入5L搅拌式生物反应器中,采用含5％胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培基灌流培养293 N3S细胞,当细胞密度达到(2～4)×10⁶个/mL时感染Ad-GFP,48h后收获细胞,经两步氯化铯超速离心获得纯化的Ad-GFP。采用紫外分光光度计比色法和高压液相色谱法（HPLC）测定病毒颗粒数和纯度,采用组织培养半数感染剂量（TCID₅₀）法检测腺病毒的感染滴度。连续培养10～12d,细胞密度可达到(2～4)×10⁶6个/mL左右,纯化的Ad-GFP感染滴度和颗粒数分别为1.0×10¹¹IU/mL和1.68×10¹²VP/mL,比活性为6.0%,A₂₆₀A₂₈₀比值为1.33,产品纯度达到99.2%。建立了5L生物反应器悬浮培养293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的生产工艺,对携带其他基因的重组腺病毒药物生产具有一定的指导意义。     

用基因芯片检测DPYD等位基因在受试人群中的发生频率

二氢嘧啶脱氢酶基因（DPYD基因）所编码的二氢嘧啶脱氢酶（DPD酶）是氟化嘧啶类抗肿瘤药物代谢的主要限速酶,其活性存在显著的个体差异,并因此影响药物的疗效和毒副作用.大部分编码低/无活性酶的突变型等位基因是由于基因中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）造成的,检测这些SNPs是预测患者对药物的反应和实现个体化给药方案的基础.制备并优化了用于检测DPYD基因中6个已知SNPs所编码的等位基因（DPYD^*2,^*3,^*4,^*5,^*9,^*12）的基因芯片,建立了该芯片的基因分型标准.并利用该芯片检测了肿瘤患者（112例）、肾病患者（83例）和健康者（45例）中DPYD突变型等位基因的发生频率.在受试人群中,突变型等位基因DPYD^*5和DPYD^*9平均发生率分别为32.08%和11.25%,未发现DPYD^*2,^*3,^*4,^*12突变型等位基因.而且以上单碱基突变的发生率在肿瘤患者、肾病患者和健康者间以及男性、女性肿瘤患者间无显著性差异,表明其与疾病的发生或性别无显著性关联.对20例标本的基因分型结果采用直接测序法进行验证,19例基因芯片分型结果与直接测序法结果相一致.DPYD^*5、DPYD^*9突变型等位基因在受试人群中具有较高的发生率.利用基因芯片能够对其实现快速准确的检测.     

Ni2+胁迫下嗜酸氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化应激效应

【目的】嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)作为湿法冶金的主要功能菌,其在重金属Ni²⁺胁迫下的亚铁氧化应激机制还不清楚。【方法】在两步法培养体系中,设计由低到高Ni²⁺胁迫浓度,利用分光光度法、电化学法和实时荧光定量PCR法等从宏观到微观探究Ni²⁺胁迫下A.ferrooxidans菌亚铁氧化应激效应。【结果】两步培养法体系下A.ferrooxidans菌能够耐受较高浓度的Ni²⁺毒性(≤30 g/L Ni²⁺)。当Ni²⁺胁迫浓度增加至40 g/L时,与对照组(不添加Ni²⁺胁迫)相比,A.ferrooxidans亚铁氧化率和速率显著降低(24 h的亚铁氧化抑制率约为59.4%),亚铁氧化代谢相关的rus操纵子各功能基因的表达量也显著下调,尤其是基因cyc1(最高下调了16倍)和coxBACD(4个不同亚基最高下调2.7–7.4倍);同时Fe²⁺氧化相关的胞外电子传递能力也降低,对照组(0 g/L Ni²⁺,29.0µA)最大还原峰电流值高于实验组(40 g/L Ni²⁺,24.5µA)。【结论】超高浓度Ni²⁺胁迫环境对A.ferrooxidans菌有毒性,导致该菌rus操纵子上各功能基因表达量下调,同时造成胞外电子传递速率降低,最终致使A.ferrooxidans菌亚铁氧化能力降低。研究结果将为含Ni固废高效生物浸出提供理论支持。     

具有维持造血干/祖细胞能力的新型豆类凝集素的分离、纯化及功能鉴定

一种分离自豆类的新型凝集素不仅具有凝集活性,还具有体外长期维持造血干/祖细胞的能力.由眉豆（Dolichos lablab）中分离得到了这种多亚基的凝集素——FRIL（Flt3 receptor-interacting lectin）,并对它进行了核酸和蛋白质序列分析.免疫细胞分析显示,它的受体是CD34⁺造血干/祖细胞所特有的.在培养基中添加这种凝集素可长期维持CD34⁺细胞存活和增殖能力.以Flt3配基（FL）作为对照,在28天的培养时间内,相对于FL,FRIL可维持细胞较高的G0/G1期比例（80%以上G0/G1期）和长期培养中（14天以上）1.5倍以上的集落形成量.可见FRIL通过滞留造血干/祖细胞于G0/G1期而维持它们的自我更新潜能.     

促甲状腺激素抗血清的研制

用较少的抗原量免疫绵羊,采用活体采血法,定期加强免疫,定期补铁,定期采血,获得抗人促甲状腺激素(TSH)抗血清.采用放免分析方法鉴定抗血清,结果为:抗血清滴度为28-205万,与促卵泡激素、促绒毛膜生长激素、促黄体生成素交叉都小于0.02‰,亲和常数K大于10¹⁰L/mol.     

用Blue Sepharose CL-6B快速纯化天花粉蛋白

差光谱显示染料cibacron blue F3GA与天花粉蛋白(TCS)有特异性结合,复合物在可见光部分的最大吸收波长在690 nm,摩尔消光系数ε=2.6×10^-3(mol/L)^-1·cm^-1,解离常数K_d=1.8 μmol/L,0.5 mol/L NaCl可使复合物解离.根据这一特点,用Blue-Sepharose CL-6B凝胶从栝篓块茎中亲和纯化了TCS.此法快速、简便、高效,易于大量制备.     

饲料中添加枯草芽孢杆菌对青鱼生长、消化酶活性和鱼体组成的影响

用不加枯草芽孢杆菌的对照饲料和分别添加2×10⁶、2×10⁷、2×10⁸和5×10⁸ cfu/g枯草芽孢杆菌的4种实验饲料, 分别喂养初始均重为(4.16±0.03) g的5组三重复的青鱼鱼种8周。饲养试验在15只容积为80 L循环式水簇箱内进行, 水温控制为(25±0.5) ℃。结果表明: 饲料中添加枯草芽孢杆菌的实验组青鱼鱼体终重和鱼体增重比不添加的饲料组显著提高, 而饲料系数则显著降低(P<0.05), 不同枯草芽孢杆菌添加量对青鱼鱼体增重和饲料系数均无显著影响(P>0.05)。饲料中添加枯草芽孢杆菌对青鱼的成活率无显著影响(P>0.05)。青鱼摄食添加枯草芽孢杆菌的实验饲料后其肠蛋白酶活性比不添加组显著升高(P<0.05), 并随着枯草芽孢杆菌添加量的增加而显著上升(P<0.05), 但添加量到2×10⁷ cfu/g后继续增加则不再显著变化(P>0.05)。青鱼摄食添加枯草芽孢杆菌的实验饲料后, 其肠淀粉酶活性均比不添加组显著升高(P<0.05), 且随枯草芽孢杆菌添加量增大呈不断升高的趋势。青鱼摄食添加2×10⁷、2×10⁸和5×10⁸ cfu/g枯草芽孢杆菌的饲料后, 其肝胰脏蛋白酶活性显著高于摄食不添加或添加2×10⁶ cfu/g枯草芽孢杆菌的实验组(P<0.05)。青鱼摄食添加枯草芽孢杆菌的实验饲料后, 其肝胰脏淀粉酶、肝胰脏脂肪酶和肠脂肪酶的活性均与不添加的实验组无显著差异(P>0.05)。青鱼鱼种摄食添加枯草芽孢杆菌的饲料与摄食不添加枯草芽孢杆菌的饲料相比, 其全鱼营养组成均无显著差异(P>0.05)。因此, 在实验条件下, 饲料中添加2×10⁶—5×10⁸ cfu/g的枯草芽孢杆菌能促进青鱼鱼种的生长和降低饲料系数, 而对鱼体组成没有影响。     

没食子酸对水稻细菌性条斑病菌细胞结构的影响

没食子酸(gallic acid, GA)是一种植物酚类化合物,具有多种生物活性。前期实验发现,GA对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)具有较强的抑制作用。为了解该物质对Xoc的细胞结构和细胞膜的影响,该研究用电子显微镜观察GA对Xoc的形态结构的影响,通过测定GA处理后的Xoc培养液的电导率、紫外吸收物含量(260 nm的吸光值)、乳酸脱氢酶的活性以及菌体的二乙酸荧光素(fluorescein diacetate, FDA)的强度等,探讨了GA对Xoc细胞膜的完整性和通透性的影响。结果表明:经浓度为200 μg·mL^-1的 GA处理后,Xoc的菌体形态结构发生改变,表面有明显的凹陷或不规则囊泡状突起,表明GA对Xoc细胞壁有损伤作用。200 μg·mL^-1的GA处理24 h后,病菌培养液的电导率为135.48 μS·cm^-1(对照处理为127.85 μS·cm^-1)。GA处理2 h后,Xoc细胞荧光强度下降58.10%,说明病菌细胞内电解质外渗和细胞溶质发生渗漏; 同时,乳酸脱氢酶的活性增加,表明菌体的细胞膜受到破坏。此外,GA处理24 h后,Xoc培养液在260 nm下的吸光值为1.004(对照处理为0.018),表明病菌细胞膜的完整性受到破坏。这表明GA不仅破坏Xoc的细胞膜通透性,而且还影响膜的完整性。     

产harpin的成团泛菌工程菌308R（pCPP430）遗传稳定性的研究

成团泛菌工程菌３０８Ｒ（ｐＣＰＰ４３０）带有梨火疫欧文氏杆菌的与过敏反应和致病性有关的基因簇 （ｈｒｐ）,可以产生能诱导植物抗病性的蛋白质ｈａｒｐｉｎ。该工程菌在ＬＢ液体培养基中生长５０代后,带有重 组质粒ｐＣＰＰ４３０的细胞占总菌量的 １％,带有载体ｐＣＰＰ９的细胞为４６％。工程菌喷雾到番茄叶面,保湿条 件下叶面菌量维持在 １０５ｃｆｕ／ｃｍ２以上,其中带有 ｐＣＰＰ４３０质粒的菌维持在 ４０％以上,带有 ｐＣＰＰ９载体的 菌维持在８０％以上。因此,携带ｈｒｐ基因簇的质粒ｐＣＰＰ４３０在宿主菌中是不稳定的。文中讨论了改进工 程菌遗传稳定性的途径。     

表达幽门螺杆菌粘附素保守区的减毒鼠伤寒沙门菌免疫治疗作用的研究

探讨表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）粘附素保守区（AB）的减毒鼠伤寒沙门菌X4072（pYA248-AB）的免疫治疗效果,以及可能的免疫治疗机制,以确定X4072（pYA248-AB）在Hp疫苗研制中的应用价值.建立Hp感染小鼠模型,在该模型中评价X4072（pYA248-AB）治疗Hp感染的效果,运用细菌培养法观察Hp根除率及定植量的改变,流式细胞术分析免疫后小鼠脾细胞亚型,IL-2和IL-4细胞依赖株的细胞测活法检测细胞因子,ELISA法检测小鼠血清及肠液中抗AB抗体产生情况.结果表明,免疫治疗后疫苗治疗组根除率为53.3%,显著高于X4072（pYA248）和PBS对照组（P＜0.01）.未根除Hp的小鼠,疫苗治疗组Hp的定植密度明显低于其他两组（P＜0.01）.应用流式细胞仪分析免疫小鼠脾CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞的比值时,发现疫苗治疗组和鼠伤寒菌对照组的比值均显著高于PBS对照组（P＜0.05）,而疫苗治疗组的比值又显著高于鼠伤寒菌对照组（P＜0.05）.进一步对细胞因子进行分析发现,与PBS对照组相比免疫治疗组和鼠伤寒菌对照组IL-2和IL-4明显升高(P＜0.05).同时,免疫治疗组与鼠伤寒菌对照组相比,IL-4增高明显(P＜0.05).针对AB的抗体测定结果发现,仅在免疫治疗组的小鼠肠液中检测到了IgA抗体.免疫治疗组IgG抗体滴度较其他两组明显升高,第二次加强免疫后2周即上升至1∶10 000.动物实验表明,X4072（pYA248-AB）能根除或显著降低Hp在小鼠胃内的定植,其可能的免疫治疗机制包括提高CD4⁺/CD8⁺比值,诱导Th1和Th2反应以及产生针对AB的特异性抗体.