乳链球菌Z270乳糖－蛋白酶质粒pUCL22的消除及其整合

用简单的温和法消除乳链球菌Lactococcus lactis sub sp．Lactis Z270的乳糖-蛋白酶质粒pUCL22(54kb)。DNA普通琼脂糖凝胶电泳图和生化检验证明,变异菌株D16和D17的质粒pUCL22被消除了。脉冲电泳图表明,D16的染色体限制酶图谱与野生菌Z270的相似,但D17的染色体被质粒的蛋白酶基因多位点整合,从而改变了其染色体限制酶的酶切图。     

与慢生大豆根瘤菌吸氢和固氮作用有关的基因克隆

用Tn5插入导致的T-1(His Hup Fix)变株为受体,从慢生大豆根瘤菌USDA 110基因文库中钓取His+结合子10株,经捡测,它们都不同程度地恢复了Hup+与Fix+功能,从它们的DNA琼脂糖凝肢电泳图上,可见到都有一个分子量大小各异的pLAFRI：：his质粒,其中5株接合子的重组质粒已转入E．Coli HB101中,从它们的质粒电泳图型再显示其分子量各有差异,经 Southern转移之后,分别用hup探针和nif探针进行DNA杂交分析,明确Ecr菌株的质粒能与hup和nif探针杂交,Ec。菌株的质粒能与hup探针杂交,其它三株虽能解除Hup Fix-功能上的缺陷,但其质粒DNA序列上并无与nif或hup序列有同源性的成份     

慢生型大豆根瘤菌的结瘤基因转入快生型大豆根瘤菌中

通过三亲本杂交把慢生型大豆根瘤菌USDAllO的基因文库转移至Tn5诱变的不结瘤的快生型大豆根瘤菌321,338中,用链霉素和四环素平板选择大量接合子,接种大豆,通过结瘤基因功能互补,获得7个根瘤,从中分离出的每个菌株都仍具有链霉素和四环素抗性。分离其质粒,发现每个菌株都多了一条较载体质粒pLAFRl分子量大的质粒。将这些质粒转移至大肠杆菌HBl01中,分离其质粒,用32P标记的ncd探针进行DNA—DNA分子杂交,除载体质粒pLAFRl为阴性反应外,其他重组质粒均为阳性反应,即所获得pLAFRl克隆的DNA片段上确有nod结构基因。回收重组质粒pLAFRl：：nod,用限制性内切酶EcoR I进行酶切,从其琼脂糖凝胶电泳图上估计pLAFRl上克隆的DNA片段分子量为32kb。     

吸水链霉菌应城变种10—22中一个复制子的克隆和基本复制区的定位

利用由pBR322衍生的链霉菌复制子探针载体pIJ2703,从吸水链霉菌应城变种菌株10－22中克隆了一段１3kb的可以自主复制的DNA,制作了携带这段DNA的杂合质粒p}Iz54的限制酶图谱。利用缺失、次级克隆等方法将基本复制区确定在2．86kb的范围内。用外切酶Ⅲ顺序缺失法不仅进一步确证了基本复制区的位置,而且将其缩小到2kb的范围内。同时,在上述试验过程中、还组建了一系列既可在大肠杆菌、又可在变铅青链霉菌中复制的双功能质粒,其中有些质粒是有用的穿梭载体。     

苏云金芽孢杆菌cry1基因在荧光假单胞菌Pfx-18中的表达特性

用DIG标记的cry1Aa基因EcoRI-F片段的RNA探针,对筛选的鳞翅目高毒力菌株的质粒进行Southern分析,将cry基因定位在39．3MD质粒上。该质粒经HindⅢ酶解,用同样探针进行杂交,呈现6．5kb和7．1kb两条阳性带,其中7．1kb片段的杂交强度明显高于6．5kb片段。将7．1kb片段与多寄主质粒pSUP106连接,转化荧光假单胞菌Pfx－18,获得克隆子LZP-1。克隆基因用PCR鉴定,显示典型的cry1Ab谱带。经SDS-PAGE分析,克隆株表达66kD杀虫晶体蛋白和一些小分子多肽。其发酵液稀释1000倍对三龄小菜蛾幼虫的致死率为33％。     

小单孢菌40027菌株质粒pJTU112复制区的克隆与序列特性

福堤霉素A产生菌——小单孢菌40027菌株含有两个质粒pJTU101和pJTU 112.[目的]对质粒pJTU 112复制区进行克隆,并对质粒pJTU 112复制区序列进行测定和分析.[方法]克隆质粒pJTU 112的不同DNA片段导入消除质粒的小单孢菌40027菌株,通过复制功能的测定,确定质粒pJTU 112的复制区,并进行测序和生物信息学分析.[结果]质粒pJTU 112的复制区定位在约4.7 kb的SacI-KpnI DNA片段上,测序和生物信息学分析表明:4.7 kb的SacI-KpnI DNA片段包含5个ORFs(open reading frames),其中pJTU 112.1和pJTU 112.2与质粒接合转移有关,pJTU112.3、pJTU112.4和pJTU112.5与质粒复制有关.[结论] 质粒pJTU112的复制区定位在约4.7 kb的SacI-KpnI DNA片段上.     

pUB 110质粒转化枯草杆菌Ki-2株及其突变体的研究

迄今文献中报道枯草杆菌基因克隆化都采用枯草杆菌168株及其突变体。本文采用我国分离的枯草杆菌Ki-2株及其突变体Ki-2-1 32(Thr~-Ile~-Val~-)和Ki-2-148(ura~-)为pUB110质粒DNA的受体菌株。用酸酚法提纯pUB110质粒DNA,在琼脂糖凝胶电泳上看不到样品中有染色体DNA的带。结果表明,Ki-2、Ki-2-132和Ki-2-148都可作pUB 110质粒的受体菌,其转化频率在10~(—3)—10~(—8)之间,因菌株和条件不同,频率有所差异。Ki-2-132的转化效率为每微克DNA可产生10~4转化体。pUB 110质粒DNA浓度在0.01—1.00μg/ml之间时,转化体数目随DNA浓度增加而增加,其中,在浓度为0.01—0.1μg/ml之间成直线关系,测定的DNA依赖指数为1.04,系一级反应。从pUB110质粒DNA转化168、Ki-2、Ki-2-132、Ki-2-148的转化体中提取的质粒DNA仍具有pUB110质粒DNA的抗卡那霉素的转化活性。从转化体提纯的质粒DNA的电泳图以及EcoRI消化后的电泳图与原来的pUB110 DNA的电泳图相同。     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红索酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4·0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC3167l中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4．Okb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4．0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4．0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉索产生菌酮基还原酶基因定位于BssH Ⅱ—BamH Ⅰ 1．3kb DNA片段上。对1．3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明：此1．3kbDNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77．4%,相同性为66．7％,对麦迪霉素产生苗酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。     

沈阳地区铜绿假单胞菌药物敏感性测定及质粒图谱分析

目的 测定铜绿假单胞菌对22种药物的敏感性,帮助临床选择用药。并对分离株进行质粒图谱分析以了解耐药菌株的流行情况。方法 药物敏感性实验采用纸片琼脂扩散法,质粒指纹图谱分析采用碱变性法提取质粒DNA,限制性内切酶切割后进行凝胶电泳分析。结果 铜绿假单胞菌对头胞哌酮、氧派酸、丁胺卡那霉素、壮观霉素、多粘菌毒和头孢三嗪的敏感率在84％－100％之间。所有菌株对其他16种抗性素均有不同程度的耐药。质粒DNA图谱分析显示,12株被检测菌株中有11株含有质粒DNA,其中8株含有23kb质粒DNA。结论 铜绿假单胞菌对头胞哌铜、氟派酸、丁胺卡那霉素、壮观霉素、多粘菌素敏感;多数耐药菌株含23kb质粒DNA。     

我国葡萄根癌农杆菌Ti质粒的特征

以窄宿主葡萄农杆菌Ag162Ti质粒的T-DNA区tmr、tmsl和ocs基因座位以及T_A-DNA和T_B-DNA片段为探针,对12株我国分离的不同生物型、质粒类型和寄主范围的葡萄根癌农杆菌的引质粒转移DNA(T-DNA)进行Southern杂交分析。在9株生物3型octoplne Ti质粒菌株中,与上述探针均同源。其中窄宿主葡萄根癌农杆菌菌株杂交片段彼此较一致。广宿主葡萄根癌农杆菌菌株的杂交片段彼此差异较大。1株无致瘤能力的生物1型菌株与5个探针均不杂交。1株生物3型nopaline Ti质粒菌株及1株诱导冠瘿瘤中只合成精氨酸的菌株,杂交带的变化也大。由此可见葡萄农杆菌在生物进化过程中其转移DNA呈多态性,成为农杆菌中特殊类群。本分析对葡萄根癌农杆菌致病菌株的鉴定亦有帮助。     

影响紫云英根瘤菌入侵和根瘤发育的exo基因的克隆及分析

紫云英根瘤菌菌株107的3个胞外多糖缺陷突变株NA－01、02、04不具备诱导宿主植物紫云英结瘤的能力。以NA-01突变位点的DNA片段为探针,从可互补这3个变种的exoR′－11质粒上亚克隆到2．6kb的DNA片段。互补试验表明,2．6kb的片段不仅可纠正突变株的胞外多糖缺陷表型,而且使变种恢复诱导宿主植物形成有效根瘤的能力。2．6kb片段经Tn5定位突变后丧失这种恢复能力,表明该片段带有对应于3个变种的野生型基因。     

YAC克隆系统

目前,利用质粒和噬菌体作为载体,已完成了许多基因与基因组DNA片段的克隆及作图.但是,质粒和噬菌体所能携带的外源DNA片段的大小是很有限的.一般来说,入噬菌体能携带的DNA片段不超过25kb;Cosmid质粒所能携带的DNA片段不超过45kb.而现在发现的一些大基因,如人类的Factor VIII基因(180kb)和Dystrophin基因(1800kb)都已远远超过上述载体的克隆容量.这些容量较小的克隆载体,在克隆真核基因组的染色体时,遇到了巨大的困难.为了克服这一难题,80     

吸水链霉菌应城变种的四个内源质粒及其逐个消除的研究

在改良质粒DNA提取方法的基础上,从三种农用抗生素的同一产生菌——吸水链霉菌应城变种中同时发现四个内源质粒,用双向电泳技术确定了它们均为CCC构型,根据分子量从大到小的顺序将它们分别命名为pHZ1、pHZ2、pHZ3和pHZ4,与已知分子量的CCC质粒分子同步电泳估计它们的分子量依次分别为61kb、4.7kb、4.1kb和3.3kb,基于这四个内源质粒中至少部分个体可能为接合性质粒,可在没有某个质粒的衍生菌株的菌坪上形成“麻点”的假设,我们分离和鉴定了三个质粒逐个消除的10-22衍生菌株,并在光学显微镜下确证了二种类型的麻点。     

六株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学分析

对 6株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学进行了分析 .6株菌与nifHDK基因有杂交 .菌株总DNA经BamHⅠ酶切后与pEA9 DNA进行Southern杂交 ,只有 2株菌具有完整的质粒DNA ,其余菌株质粒DNA发生了 15 3～ 137 7kb不同程度的缺失 .用切割位点较少的限制性内切酶XbaⅠ酶切 6株菌的总DNA ,经脉冲场凝胶电泳 (PFGE)后用pEA9 DNA为探针进行Southern杂交 ,每株菌的pEA9 DNA明显大于用BamHⅠ酶切后的杂交结果 ,表明质粒与染色体发生了整合 .转座子Tn5或插入序列IS 12 2 2和IS 12 71可能参与质粒与染色体的整合过程 .     

西藏土壤中分离的链霉菌含有丰富的线型和环型质粒

【目的】研究极端自然环境对链霉菌线型和环型质粒分布的影响。【方法】从西藏高原采集了20份土壤样品,分离和初步鉴定链霉菌,提取和检测质粒DNA。【结果】从中分离到46株链霉菌,其中有23株菌含有1 4个线型质粒,大小在19 650 kb之间,8个菌株含有1 4个环型质粒,大小在4 80 kb之间。【结论】西藏土壤来源的链霉菌含有大量的、多样的线型质粒和环型质粒,暗示极端环境中诸如强紫外辐射等可能会引发DNA损伤和修复,进而造成质粒的多样性。     

紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离

以紫云英根瘤菌菌株7653R为材料,制备总DNA,经EcoRⅠ限制酶部分酶解,通过10—50％蔗糖梯度离心,分离到20一30 kb的DNA片段。利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱寄主载体——pLAFRl质粒,构建了紫云英根瘤菌基因文库。通过与苜蓿根瘤菌102l菌株中8．7kb的共同结瘤基因(作探针DNA)杂交,从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段。以紫云英根瘤菌不结瘤突变株7653R+1(7653R消除共生质粒)为受体、构建的7653R基因文库(E．Coli C600)为供体,通过协助转移质粒pRK2013(LE392)进行三亲交配,在含四环素的根瘤菌台成培养基(sM)上选择接合转移子。将得到的所有接台转移子混合在一起接种植物,通过植物结瘤试验,分离到含紫云英根瘤菌结瘤基因的重组质粒pRaz15。将该质粒用EcoRⅠ完全酶切,得到25kb左右的外源DNA片段,该片段携带完整的结瘤基因簇。     

龙葵叶绿体ATP合酶α-亚单位基因的克隆

本研究以菠菜叶绿体DNA 2.45kb的SalI片段(含有ATP合酶α-亚单位基因)为探针,从龙英叶绿体DNA BamHI片段文库中筛选出含龙葵叶绿体atpA基因的克隆。通过Southrcn吸印与探针杂交,证明了重组质粒pSB 132的插入片段含有atpA基因。同时将atpA基因定位在龙葵叶绿体DNA SalI、BglI、XhoI和BamHI 4种酶切图谱的限制性片段上。     

扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。