SPARC基因敲除小鼠的繁育及子代基因型的鉴定

目的:探讨富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)基因敲除小鼠的繁殖和鉴定方法,为进一步研究SPARC蛋白的功能奠定基础。方法:将所引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型。提取子鼠鼠尾基因组DNA,用PCR法扩增SPARC和Neo基因片段,通过限制性内切酶酶切反应,证实PCR扩增产物的正确性;应用Westernblot检测SPARC蛋白质的表达,进一步证实PCR鉴定方法的可靠性。结果:SPARC基因杂合子小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,SPARC基因缺失纯合子小鼠有繁殖能力。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物分子量大小与预期的目的基因片段相对分子质量大小一致,酶切和Westernblot结果证实PCR结果可靠。结论:PCR方法能够准确鉴定SPARC基因突变小鼠基因型。     

一种快速鉴定重组转化子的方法

对于重组DNA的鉴定往往需要两至三天甚至更长的时间。尤其是对那些既无筛选标志,插入DNA片段又与原载体大小差别甚大的重组转化子的鉴定,更加耗时费力。该研究利用PCR方法,建立了一种从转化子菌落中直接鉴定重组DNA的方法,使这一过程缩短为半天,减少了不必要的人力和物力耗费。     

转化条件对质粒DNA转化大肠杆菌的影响

研究了质粒DNA大小、质粒DNA浓度、CaCl2 浓度、热休克时间及感受态细胞保藏时间等因素对大肠杆菌HB1 0 1和JM1 0 5转化频率的影响 ,并对转化子中质粒DNA进行了分离、酶切、琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明 ,CaCl2 浓度、质粒大小和浓度 ,以及感受态细胞的活力对转化频率有重要影响 ,42℃热休克处理可以提高转化频率。     

PCR技术在鉴定阳性重组子中的应用

阳性重组子的筛选与鉴定是分子克隆实验中经常遇到的一个重要问题。DNA片段连接产物转化感受态大肠杆菌后经相应抗生素抗性粗筛后,为了鉴定转化子中插入片段的存在,目前常采用的方法有:①通过特异探针从菌落原位杂交筛选。②通过快提质粒DNA后,依据分子量大小及酶切图谱进行鉴定。但这两种方法均存在各自的不足。如:周期较长,需进行同位素操作,当载体分子量太大而插入片段较小     

SUSD2基因真核表达载体构建及其在H322细胞中表达

[目的]构建SUSD2基因真核表达载体,并观察其在真核细胞H322细胞中的表达。[方法]从H322细胞中提取总RNA并逆转录为c DNA,采用PCR技术扩增出含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的人SUSD2基因片段,以质粒pc DNA3.1为表达载体,构建重组质粒pc DNA3.1-SUSD2。采用PCR、双酶切鉴定以及测序验证c DNA片段大小和序列正确。将重组载体pc DNA3.1-SUSD2转染H322细胞,Western Blot法检测SUSD2蛋白的表达。[结果]PCR、双酶切鉴定以及测序结果显示pc DNA3.1-SUSD2包含大小、序列正确的SUSD2片段;Western Blot结果显示SUSD2蛋白在转染pc DNA3.1-SUSD2的H322细胞中表达高于转染pc DNA3.1的H322细胞。[结论]成功获得SUSD2基因全长序列,并成功构建SUSD2基因真核表达载体,有效地在非小细胞肺癌细胞株H322中表达,为进一步研究该基因功能及机制奠定了基础。     

同源重组法构建枯草芽孢杆菌224 yugS基因缺失突变株

从枯草芽孢杆菌224的基因组DNA中分别扩增出溶血样基因yugS的上、下游片段,并利用携带新霉素抗性基因(neor)的重组质粒pMD18-T-neo作为骨架,构建了基于yugS基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yugS,线性化后电转化入枯草杆菌224,从新霉素抗性平板上挑取转化子,通过对基因组的PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定转化子yugS156为yugS基因缺失突变株。     

腺病毒介导的Her2基因RNAi载体的构建和鉴定

目的:构建腺病毒介导的Her2基因RNAi栽体.方法:构建含有Her2基因片断的siRNA质粒Her2-pSuppressor,通过特异性酶切将目的基因与穿梭载体pshuttle相连,再通过特异性酶切位点将目的片断与腺病毒DNA相连,并用PCR和酶切鉴定方法进行筛选和鉴定,获得重组腺病毒DNA.以Pac Ⅰ酶切线性化后转染包装含有腺病毒E1的HEK293细胞.以软琼脂平板上的空斑数量计算重组腺病毒的的滴度.结果:Xba Ⅰ Mlu Ⅰ双酶切鉴定Her2a-RNAi/pShuttle和Her2b.RNAi/pShuttle阳性重组子获得304bp的目的片段,重组腺病毒载体Adeno-Her2a-RNAi和Adeno-Her2b-RNAi经PCR扩增出同样大小片断,经线性化后用脂质体法转染293细胞,观察到细胞病变效应.病毒滴度达1.2× 108PFU/mL.结论:成功构建了Adeno-Her2-RNAi,为肿瘤的基因治疗奠定了良好的基础.     

解淀粉芽孢杆菌赖氨酸-3基因在枯草芽孢杆菌中的克隆

限制性核酸内切酶EcoRI酶切解淀粉芽孢杆菌ASl.1099染色体DNA和质粒pUB lloDNA,T4 DNA连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51(trpC2痢“B5 ly.f3 Neo')感受态细胞。用选择性培养基两次筛选,得到Neo‘和与BR 151 lys3营养缺陷突变互补的菌落。用快速测定质粒的方法检查,其中有13株转化子带有大小相同的重组质粒。分离其中l株转化子BRl51-29的重组质粒pB--L29 DNA,再次转化BRl51感受态细胞和原生质体。测定第二次得到的转化子性状,均与转化子B1~151-29相同。琼脂糖曩胶电泳检查这些转化子的质粒,其分子大小也与t组质粒pB--L29相同。以上试验证明,重组质粒pB--L29是由pUBll0和解淀粉芽孢杆蕾的咖3基因片段构成的。根据琼脂糖凝胶电泳测定pB--L29的分子量约为5.0kb,推断出l~,J3基因片段约为O.5kb。     

DDR2基因缺失小鼠的繁育及子代基因型的鉴定

目的：探讨盘状结构域受体2（DDR2）基因缺失小鼠的优化繁殖方法与子代小鼠DDR2基因型的鉴定方法,建立DDR2基因缺失小鼠模型,为进一步研究DDR2分子在肿瘤、肺纤维化、类风湿性关节炎等复杂疾病中的功能以及作用机制奠定基础。方法：将从美国JAX实验室引进的三对杂合子小鼠进行饲养并交配繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型。用基因组提取试剂盒试剂盒提取子鼠鼠尾的基因组DNA,经紫外分光光度计定量后,采用Taqman qPCR的方法准确鉴定出小鼠的基因型,同时观察子代小鼠各基因型的比例,并通过小鼠体态观察,进一步证实Taqman qPCR鉴定方法的可靠性。结果：DDR2基因杂合子小鼠互交繁殖可得到DDR2野生型小鼠、DDR2纯合子小鼠以及DDR2杂合子小鼠三种基因型小鼠,所得子代基本符合孟德尔遗传规律,且雌性和雄性DDR2纯合子小鼠体长均较DDR2野生型小鼠和DDR2杂合子小鼠小,鼻子也较其它基因型小鼠明显变短,无繁殖能力。依据Taqman qPCR的结果所得出的纯合子小鼠体貌特征与文献报道一致,证实了Taqman qPCR结果的可靠性。结论：雌、雄性DDR2杂合子小鼠交配可有效获得DDR2基因缺失小鼠;实验所用Taqman qPCR方法能够准确鉴定子代小鼠的基因型,DDR2纯合子小鼠的获得为后续实验的提供了较理想的动物模型。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的：构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将 Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因 R528H 突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

YfiA、Rmf和Hpf影响大肠杆菌DNA复制起始

探讨核糖体休眠因子yfiA、rmf和hpf对大肠杆菌DNA复制起始的影响。观察ΔyfiA、Δrmf和Δhpf基因缺失突变体的DNA复制式样、细胞倍增时间、细胞大小等表型变化,并使用温度敏感性实验和蛋白定量实验探究yfiA、rmf和hpf对DNA复制起始的作用机理。结果发现,相较于野生型细胞,ΔyfiA、Δrmf和Δhpf突变体出现DNA复制起始的延迟、细胞倍增时间延长、细胞体积减小等表型变化。温度敏感性试验表明YfiA、RMF和HPF蛋白不是直接通过与DnaA、DnaB或DnaC蛋白相互作用来影响DNA复制起始。蛋白定量实验表明它们可能是通过减少细胞内总蛋白的量,包括DnaA蛋白,使细菌的代谢和生长速度减慢,从而导致细菌DNA复制起始发生延迟、细胞倍增时间延长和体积减小等表型改变。这为深入研究yfiA、rmf和hpf的功能提供基础。     

DNA条形码试剂盒检测技术在大小蠹属种类鉴定中的应用

[目的]DNA条形码技术已成为生物分类鉴定的有力工具.DNA条形码技术的相关问题,如物种种内和种间的遗传距离出现重叠区域,将直接影响到物种鉴定的准确性.我们应用DNA条形码试剂盒检测技术来快速、准确地鉴定口岸截获的检疫性大小蠹属种类.[方法]针对大小蠹昆虫设计引物以提高PCR扩增效率.运用自主研发的基因条码分析软件找出基因片段上区分每个物种的多态位点规律,作为该物种的鉴定特征并建立数据库,应用于物种鉴定.[结果]使用针对大小蠹属昆虫设计的引物成功扩增出325 bp的COI基因片段.将大小蠹属12种昆虫的COI基因片段上的核苷酸诊断位点的组合作为物种的鉴定特征,可以准确地区分近似种.通过比对植物检疫鉴定系统数据库里的鉴定特征,将6个大小蠹属的未知样品成功鉴定到种(核苷酸序列一致性为100％),与形态鉴定结果一致.[结论]结果表明DNA条形码试剂盒检测技术可以准确鉴定大小蠹属的种类.该检测技术可以应用于其他经济重要性有害生物的检测鉴定.     

DNA条形码试剂盒检测技术在大小蠹属种类鉴定中的应用（英文）

【目的】DNA条形码技术已成为生物分类鉴定的有力工具。DNA条形码技术的相关问题,如物种种内和种间的遗传距离出现重叠区域,将直接影响到物种鉴定的准确性。我们应用DNA条形码试剂盒检测技术来快速、准确地鉴定口岸截获的检疫性大小蠹属种类。【方法】针对大小蠹昆虫设计引物以提高PCR扩增效率。运用自主研发的基因条码分析软件找出基因片段上区分每个物种的多态位点规律,作为该物种的鉴定特征并建立数据库,应用于物种鉴定。【结果】使用针对大小蠹属昆虫设计的引物成功扩增出325 bp的COI基因片段。将大小蠹属12种昆虫的COI基因片段上的核苷酸诊断位点的组合作为物种的鉴定特征,可以准确地区分近似种。通过比对植物检疫鉴定系统数据库里的鉴定特征,将6个大小蠹属的未知样品成功鉴定到种(核苷酸序列一致性为100%),与形态鉴定结果一致。【结论】结果表明DNA条形码试剂盒检测技术可以准确鉴定大小蠹属的种类。该检测技术可以应用于其他经济重要性有害生物的检测鉴定。     

λ DNA酶切片段与pUC19克隆载体的构建与鉴定

目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。     

黑曲霉糖化酶高产菌株的糖化酶结构基因的分离及其序列分析

从糖化酶高产菌株(Aspergills niger)T21中分离出染色体DNA.Southern印跡分析表明糖化酶结构基因位于约2.5kb的EcoRⅠ-EcoRV片段中.该染色体DNA经EcorⅠ、EcoRⅤ完全酶切后,用琼脂糖凝胶电泳分离,回收2.0—3.0kb的片段,与载体pBR322连接后转化宿主菌大肠杆菌DH5,获得转化子.通过原位杂交,从转化子中筛选出4个阳性克隆.阳性克隆的进一步酶切鉴定及序列分析表明,黑曲霉T21糖化酶结构基因大小为2.3kb,含有4个内含子.     

YAP/TAZ对发育和肿瘤的调控及其功能的研究进展

Hippo通路是一种在进化中形成的保守的蛋白激酶级联通路,它与发育中器官的大小和肿瘤的形成有关。Hippo通路的中枢是从肿瘤抑制子Hippo到原癌蛋白YAP/TAZ的激酶级联反应。YAP/TAZ是Hippo通路下游的主要的效应分子,它们广泛表达于多种组织器官中。在哺乳动物细胞中,Hippo通路激酶级联反应通过对YAP/TAZ磷酸化作用,促使其从细胞核转入细胞质中,从而抑制了YAP/TAZ的功能作用。TEAD家族转录子被鉴定为YAP/TAZ发挥生物学功能的重要调节因子。YAP/TAZ的失调引起的相关的基因的表达改变,将会影响细胞的增殖,分化,以及凋亡,从而会影响器官的大小以及肿瘤的形成。本文综述Hippo通路的最新进展,重点关注的是该通路中的YAP/TAZ调控的缺失对发育缺陷和肿瘤的影响。这将为我们研究再生医学,组织工程技术,肿瘤的干预防治提供新的思路与策略。     

细胞酶联反应法 (cell-ELA) 测定特异结合U87-EGFRvⅢ细胞的适配子的亲和力

通过细胞-指数级富集的配基系统进化(Cell based systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,cell-SELEX)方法从随机文库中筛选得到与稳定过表达人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(Epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)的胶质瘤细胞U87细胞株(U87-EGFRvⅢ)特异结合的DNA适配子。以U87-EGFRvⅢ细胞作为检测对象,筛选到的适配子A15作为检测分子,建立一种细胞酶联反应(Cell enzyme-linked assay,cell-ELA)方法测定适配子的亲和力,并用EGFR抗体作为对照来比较此种DNA适配子的亲和力。结果显示,所测定的DNA适配子A15的解离平衡常数(Equilibrium dissociation constants,Kd)小于100 nmol/L,对U87-EGFRvⅢ细胞的结合能力与抗体相似。Cell-ELA法可较方便地用于cell-SELEX中适配子亲和力的测定。     

全长及缺失VLDL受体基因转染的CHO细胞与β-VLDL的结合效应

为探讨 VLDL受体结合域中 8个重复序列在结合 VLDL中所起的作用 ,利用构建的全长VLDL受体 c DNA和缺失 5个重复序列的该受体 c DNA重组表达载体分别导入 CHO细胞中 .RT- PCR可检测到外源性 VLDL受体基因的表达 .受体与配体结合研究表明 ,转染全长 VLDLR重组体的 CHO细胞结合β- VLDL的能力明显高于转染 VLDLR缺失重组体的 CHO细胞 ,表明人VLDL受体在 CHO细胞中能有效表达 ,而缺失 5个重复序列的 VLDL受体基本失去了结合β-VLDL的能力     

博尔纳病病毒X基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)X蛋白真核表达载体,为BDV X蛋白的功能研究奠定基础。方法从BDV持续感染的人少突胶质瘤细胞(oligodentrocyte,OL)的总RNA中,通过逆转录和PCR获得BDV X基因的完整序列,将其连接到pc DNA6-myc-His(A)载体上,转化至E.coli感受态细菌后,提取质粒筛选阳性克隆,通过PCR法和DNA测序进行鉴定,并转染至OL细胞,通过Western blot方法验证重组蛋白的表达。结果测序鉴定目的基因序列正确插入至pc DNA6-myc-His(A)载体的酶切位点,PCR扩增的基因片段大小与目的基因相同,Western blot证明转染至OL细胞后可表达BDV X-His融合蛋白。结论成功构建了博尔纳病病毒X基因真核表达载体pc DNA6-myc-His(A)-BDV X。     

AcMNPV核衣壳的形态发生

报道了缺失多角体蛋白基因的AcMNPV在sf9细胞内核衣壳的形态发生过程。病毒衣壳蛋白首先装配成许多呈束状排列的直径为34nm中空长管状结构,然后是病毒DNA进入管内,装有DNA的长管按一定的长度间隔断开,形成成束的核衣壳,每个核衣壳的大小约34×260nm,最后成束的核衣壳被囊膜包被形成完整的多粒包埋型病毒粒子。