人乳头状瘤病毒复制机制的研究进展

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)DNA以游离和整合两种形式存在于感染细胞中。游离形式HPVs的复制依赖于上皮细胞的分化,病毒E1、E2蛋白和复制起始位点(origin,Ori)为复制必需元件,E1和E2蛋白与Ori结合起始病毒DNA的复制。随后,病毒DNA通过E2蛋白与Brd4(bromodomain-containing protein 4)等细胞蛋白的互作而与染色体结合,并随细胞分裂平均分配到子代细胞中。在肿瘤中,高危型HPVs的基因组通常以整合形式存在,并随细胞的增殖而复制。     

病毒酶的研究及其进展

病毒的主要生物学特性之一是只有一种类型的核酸为其基因组(RNA或DNA),并必须在活细胞中增殖。虽然病毒复制需要细胞组分参与,但病毒基因编码的酶在病毒复制中的作用已日益受到重视。各种不同的病毒具有不同的病毒酶,包括复制核的酶、整合人细胞染色体的整合酶、引发(priming)DNA     

大肠杆菌中整合的F′质粒带动细菌染色体复制需要recA基因

大肠杆菌的dnaA46突变能被F′质粒整合抑制。整合抑制的菌林(Sin菌株)在通过转导引入了recA56突变后又变得不能在40℃中生长。标记转移、吖啶橙敏感性,F′质粒消除和mini-染色体质粒转化等实验说明,Sin菌株中F′质粒始终处于整合状态,并且在40℃中细菌染色体的复制由整合状态的F′质粒所带动。比较了Sin recA~ 和Sin recA~-菌株在不同温度中的DNA、蛋白质的生物合成情况。实验结果说明recA基因在DNA复制过程中起作用。前人的工作证明了recA基因在DNA重组和DHA损伤应急修复(SOS)过程中是一个关键的基因。本文的工作为recA基因的功能提供了新的认识。     

腺相关病毒的衣壳装配和DNA衣壳化机制

重组腺相关病毒载体 (rAAV) 是基因治疗临床应用载体的选择之一。在简述野生型AAV基因组结构和复制机制的基础上,阐述了AAV包装过程中两个主要事件：衣壳蛋白的装配和基因组DNA的衣壳化。虽然对AAV的包装机制总体上已有一定的认识,但其详细的分子机制、构效关系仍需完善和充实。AAV病毒本身相关机制的深入研究有助于改善rAAV载体的制备技术,促进rAAV基因药物研发。     

利用锁核酸化学偶联FokⅠ核酸酶靶向切割HBV基因的体外实验

乙肝病毒(HBV)是有缺口的双链DNA病毒,侵入人体肝细胞后形成共价闭合环状DNA(ccc DNA)持续复制,并在逆转录过程中随机整合入宿主基因组。慢性乙型肝炎感染者平均每个细胞中含有33个ccc DNA拷贝,半衰期长达35~57 d,很难从体内彻底清除。利用锁核酸抑制HBV转录,是乙肝治疗的新策略。此外,利用基因组编辑技术靶向切割HBV基因组,有望从源头治愈乙型肝炎。基于锁核酸与双链DNA形成三股螺旋的能力、抵御核酸酶及聚合酶的稳定性以及对单碱基错配的敏感性,本研究以靶向切割乙型肝炎病毒为例,设计构建锁核酸修饰的寡核苷酸作为DNA结合域,有效增强对靶基因的特异性识别;同时利用FokⅠ核酸酶分子量小、二聚化时才具有酶活等特点,设计构建FokⅠ切割域二聚体重组蛋白作为DNA切割域;进而通过双功能交联剂GMBS,建立了5′端氨基(-NH2)修饰的锁核酸与N端巯基(-SH)修饰的FokⅠ核酸酶定向化学偶联的方法,并在体外验证了新型工具对HBV基因的靶向切割。该方法为此后在体内进行高特异性、无整合风险的抗病毒基因治疗提供了全新的技术思路。     

腺相关病毒Rep78/68蛋白功能的研究进展

Rep78/68是腺相关病毒(AAV)基因组编码的具有多种调控功能的非结构蛋白。主要参与了AAV DNA定点整合到人类19号染色体,抑制病毒的生物活性,如腺病毒、类猿病毒SV40等,调节AAV DNA的复制和转录等。重点阐述了定点整合的作用机制,Rep78/AAV ITR/ICP8复合物的形成机制以及Rep68蛋白的寡聚化特性,Rep78蛋白对p53核输出的限制,AAV Rep78蛋白与人乳头瘤病毒(HPV)E1蛋白相互作用从而促使Rep78和ITR DNA的结合,Rep78对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制。这些作用的详细机制仍需完善和充实,对Rep78/68蛋白的相关作用机制的深入研究有助于rAAV基因药物的研发。     

蛋白质起始的DNA病毒复制机制

DNA聚合酶在DNA合成过程中需要的引物包括RNA引物、DNA自我引物和蛋白质引物3种类型。新DNA链(如冈崎片段)的复制多是在DNA模板上合成一段RNA引物,细小病毒利用其基因组末端的反向末端重复序列(ITRs)自我折叠成DNA引物,而一些DNA、RNA病毒及真菌质粒起始复制反应的引物则是蛋白质。以感染原核生物的噬菌体Phi29和真核DNA病毒腺病毒为例,从复制过程所涉及的蛋白质、对复制原点的识别、复制起始反应、新链的延伸、复制终止过程等方面详细阐述DNA病毒由蛋白质引发的复制机制,并对已商品化的Phi29 DNA聚合酶产品多重置换扩增及单细胞测序等的应用以及基于噬菌体Phi29蛋白质起始的最小复制系统体外扩增异源DNA等最新的应用研究作相关总结介绍。     

腺相关病毒介导基因组来源的基因转移与整合

构建一个带β-珠蛋白基因组序列的腺相关病毒载体AV53HS2Δβ2Neo.经包装成重组腺相关病毒后,转导红系细胞.DNA印迹证实包含红系增强子、β-珠蛋白基因和筛选标志基因的前病毒基因组完整整合于红系细胞基因组中.结果说明腺相关病毒载体能介导基因组序列来源的目的基因稳定整合于受体细胞基因组中.     

植物线粒体DNA质粒研究进展

本文列出了已发现的高等植物中的线粒体DNA质粒,按分子形状分为线粒体环状DNA质粒和线粒体线状DNA质粒,环状线粒体DNA质粒的特征是分子较小, 序列中有正向/反向重复序列,ORF一般较小。线状线粒体DNA质粒的特征是分子较大,末端有重复序列,5'端与蛋白质共价结合,有较长的ORF。还分别介绍了它们的复制机制、转录和起源。质粒间及质粒与核基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组的同源性也作了介绍。最后,综述了植物线粒体DNA质粒与植物的细胞质雄性不育（CMS）之间的关系。     

病毒感染条件下家蚕ORC的表达变化

DNA复制原点识别复合体(origin recognition complex,ORC)识别并结合在DNA复制原点上,募集其他相关的复制因子组成复制前复合体(pre-replication complex,pre-RC)。ORC各个独立的亚基还具有非复制相关的功能。利用荧光定量PCR技术监测感染核型多角体病毒(BmNPV)后,家蚕五龄起蚕脂肪体组织中ORC各个亚基的表达的变化。在感染早期,ORC的拷贝数有所下降,随后表达量增加,并出现两个峰值。病毒感染36 h后,ORC各个亚基的表达量均下降。家蚕感染病毒后,脂肪体组织中ORC的表达趋势与病毒DNA复制的趋势相近,推测BmORC参与了病毒DNA的复制。     

新生霉素抑制拓扑异构酶Ⅱ对多瘤病毒DNA合成的影响

本文报告了Ⅱ型拓扑异构酶抑制剂——新生霉素对多瘤病毒DNA合成的抑制作用,发现新生霉素对细胞和病毒DNA的体外合成具有不同的抑制曲线。新生霉素在复制过程中抑制复制中间物转变成成熟的病毒DNA分子的过程,同时影响病毒DNA分子的负超螺旋密度。本文结果提示Ⅱ型拓扑异构酶是病毒DNA复制末期所必须的酶。     

H_(18)细胞中Epstein-Barr病毒DNA复制的抑制和恢复

采用~(32)P标记的EBV DNA BamH Ⅰ-W片段为探针,通过细胞点杂交测出每个H_(18)细胞中EBV基因组拷贝数约207个。在PAA存在下,这些病毒基因组数快速下降。每毫升细胞培液中加75γPAA后第11天,每个细胞中EBV基因组平均拷贝数降到17个,只占未处理细胞的8%,而后既使继续处理也稳定地维持在该水平。然而EBV-VCA的合成被完全地抑制了,只是EBV-EA的合成不受影响。如去除PAA,第3天时细胞中EBV基因组数可恢复到对照组的29%,而第40天则可恢复到90%。但是在去除PAA处理的同时加n-BA处理则明显地抑制这种恢复。一般认为EBV附加体DNA的复制由宿主细胞DNA多聚酶催化,病毒线状DNA由病毒诱导的PAA敏感的DNA多聚酶复制。由于n-BA能有效地阻碍宿主的DNA复制功能,因而我们的实验结果提示,宿主细胞和病毒诱导的DNA多聚酶??可能都参与了去除PAA处理后的H_(18)细胞中EBV DNA的恢复。     

病毒相关环状DNA研究进展

环状DNA作为生命遗传物质存在形式之一,在多种生命活动中发挥重要作用。部分病毒基因组DNA以环状形式存在,不仅可以作为承载遗传信息的病毒基因组通过滚环复制的方式进行复制,也可以作为附加体建立持久感染或者潜伏感染,还可以帮助逆转录病毒整合到染色体形成前病毒逃避细胞沉默机制。无论是人-病毒杂交形成的染色体外环状DNA,还是转座整合形成的转座子,都能通过特定癌基因产生高拷贝转录本,影响宿主的生物学功能。随着研究的不断深入,环状DNA更多的功能和生物学特性被挖掘,有助于乙肝病毒清除策略制定、逆转录病毒相关疫苗研制、或抑制肿瘤形成新靶点确定等多种医学问题的解决。     

乙型肝炎病毒持续感染患者细胞内病毒复制的研究

用Southern blot技术对乙肝病毒感染肝脏和外周血白细胞的情况进行了对比研究,发现白细胞的阳性率为44％,肝组织的阳性率为46％,两者无统计学差异。根据琼脂糖凝胶电泳速度可将病毒DNA分子分为游离型、整合型和混合型,配对检查两者亦无明确相关性,说明外周血白细胞是乙肝病毒攻击的靶细胞,亦是病毒复制的场所。白细胞中病毒DNA游离型与血清学指标HBeAg( ),HBV DNA斑点杂交( )关系密切,而整合型除与上述指标有关外,还和抗-HBe( )有关,表明病毒在乙肝发病过程中复制和部分静止的差异。     

中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ缺失突变体与异源病毒的互作研究

与一些单组份双生病毒伴随的卫星DNAβ是辅助病毒在自然寄主上引起典型症状所必需的致病相关分子。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都含有一个位置和大小保守的βC1基因。对中国番茄黄化曲叶病毒的缺失βC1基因的DNAβ突变体(DNAΔC1β)与异源病毒接种后的致病性及稳定性进行了研究。PCR和Southern杂交证实该突变体能利用赛葵黄脉病毒、烟草曲茎病毒、中国胜红蓟黄脉病毒、假马鞭曲叶病毒等多种异源双生病毒复制并系统侵染本氏烟。接种后65 d内的PCR检测和序列分析显示,该突变体与其它辅助双生病毒接种后在寄主细胞中的复制是稳定的。     

腺相关病毒载体介导siRNA抑制HBV的表达与复制

目的：构建并制备能够有效抑制HBV mRNA表达的siRNA重组腺相关病毒。 方法：将筛选到的siRNA片段克隆入骨架质粒pAAVMCS中,与pAAVRC和pHelper质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组腺相关病毒,将纯化后的重组病毒直接感染Hep G 2.2.15细胞,通过酶联免疫法和荧光定量PCR法检测重组腺相关病毒的抑制效果。结果：重组腺相关病毒显著降低HBV 分泌的相关抗原蛋白以及DNA和RNA水平。结论：重组腺相关病毒载体介导的siRNA能够有效抑制HBV的表达与复制。     

细菌中RNase HI介导RNA降解的研究进展

在细菌细胞中,为了维持基因组稳定和正常的生命活动,RNase HI通常以降解RNA/DNA杂合链中RNA的方式来防止复制中引物的积累以及转录中R环的形成。RNase HI对底物的识别主要依赖于DNA与RNA结合槽,对底物的催化主要依赖于DEDD基序和位于活性位点附近柔性环中的一个组氨酸。以Mg²⁺为代表的金属离子在催化过程中发挥了至关重要的作用。杂交双链中ssDNA突出部分的类型决定了RNase HI的作用模式：在没有突出或在ssDNA的5′端存在突出部分的情况下,RNase HI作为一种非序列特异性核酸内切酶随机地降解RNA;当ssDNA的3′端存在突出部分时,RNase HI依靠5′核酸外切酶活性对RNA进行连续切割。RNase HI、Rep、DinG和UvrD通过与单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein, SSB)的C端尾部的6个残基相互作用被招募到复制叉附近,并可能以协作的方式解决复制-转录冲突。RNaseHI的缺失或活性降低将引起DNA结构不稳定、基因突变、转录装置回溯和复制不协调等一系列有害后果。RN...     

miR373和miR542-5p调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制

研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。为了揭示miRNAs是否参与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的感染与复制,研究了miRNAs对EV71病毒在宿主细胞内复制的影响。构建miRNAs靶基因筛选系统,在双荧光素酶报告体系的pMIR载体插入病毒基因,如果插入的基因序列能被细胞内的miRNAs靶向调控,报告基因的表达将发生变化。实验发现EV71病毒5′-UTR基因可能是miRNAs的作用靶标。随后利用miRNAs在线分析软件预测并验证可能作用于5′-UTR基因片段的miRNAs。为了研究miRNAs分子对5′-UTR基因的调控作用是否可以体现在EV71病毒的复制过程中,在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miRNAs mimics,利用Western blotting和real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。实验结果表明,miR373和miR542-5p可以通过作用于EV71病毒5′-UTR基因从而抑制病毒在RD细胞中的复制和表达。细胞内miR373和miR542-5p可以调控EV71在宿主细胞中的复制过程。研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

去泛素化酶USP11在细胞中的功能作用及其研究进展

Ubiquitin-specific protease 11(USP11)属于半胱氨酸蛋白酶,是去泛素化酶家族(deubiquitinating enzymes,DUBs)的重要成员之一。近年来研究表明USP11能调节细胞内众多蛋白底物的稳定性及功能,包括DNA修复蛋白、病毒RNA复制相关蛋白、TGFβ和NF-κB信号转导通路相关蛋白等,在疾病的发生发展中起着重要的作用。主要综述了USP11的结构、在细胞中的分子功能以及与肿瘤和病毒性疾病的关系,探讨了USP11作为治疗分子靶标的可能性。     

锤头状核酶在HepG2.2.15细胞内的抗HBV特性

乙型肝炎病毒 (HBV)C基因区的 3′端序列在HBV各亚型中是高度保守的 ,它编码的多肽链都富含精氨酸 ,同时与前基因组RNA的包装和病毒DNA的复制有关。因此 ,HBV中C基因的 3′端保守区是核酶介导的抗病毒研究的理想靶位点。针对上述位点设计了锤头状核酶RzC ,同时作为对照 ,设计了相应的突变型核酶dRzC。HepG2 .2 .15细胞系是由头尾相接的HBVayw亚型基因组转染肝癌细胞系HepG2而建立的一株能稳定分泌HBV各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系。因而用HepG2 .2 .15细胞进行核酶的抗病毒研究更接近于疾病的治疗过程。为此 ,把体外转录的核酶RzC和dRzC以及核酶表达载体pCRzC和 pCdRzC直接转染HepG2 .2 .15细胞。初步结果表明 ,体外转录的核酶RzC对HBV复制的抑制很弱 ,这可能是由于核酶在细胞内快速被RNA酶降解造成的 ;而通过内源性传递产生的核酶RzC能够明显地抑制HBV的复制。结果说明 ,锤头状核酶RzC在HepG2 .2 .15细胞内显示抗病毒感染的能力 ,有可能作为HBV基因治疗的一种手段