Bt杀虫晶体蛋白基因及其转基因育种研究进展

本文简要介绍了Bt杀虫晶体蛋白及其编码基因,以及目前通过基因工程方法获得的转Bt杀虫晶体蛋白基因植物,着重分析和探讨了目前转Bt杀虫晶体蛋白基因植物及转基因育种研究中存在的一些问题,并就这些问题及合理持续利用Bt杀虫晶体蛋白提出了一些见解。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bt)产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白.第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3 534 bp,编码蛋白分子量为133 kD,含1 178个氨基酸,等电点为4.84.自此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向.本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用BtCry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解.     

Bt杀虫晶体蛋白基因及其转因育种研究进展

本文简要介绍了Ｂｔ杀虫晶体蛋白及其编码基因,以及目前通过基因工程方法获提地转Ｂｔ杀虫晶体蛋白基因植物,着重分析和探讨了目前转Ｂｔ杀虫晶体蛋白奇才志基因植物及转基因中存在的一些问题,并就这些问题及合理持续利用Ｂｔ杀虫晶体蛋白提出了一些见解。     

苏云金芽胞杆菌转座因子的类群和结构

苏云金芽胞杆菌的活性成分主要是杀虫晶体蛋白（ICPs）。已经证明,大多数编码这些蛋白的基因定位于质粒上,在结构上总是与插入序列和转座子相联系。这些具有转座活性的流动因子参与了杀虫晶体蛋白基因的转移,在苏云金芽胞杆菌ICPs基因的变异性上起着极其重要的作用。本文系统介绍苏云金芽胞杆菌转座因子的分类及结构等研究进展,为有目的地利用转座因子提供参考。     

转Bt基因玉米的生态安全性研究进展

随着转基因作物的应用和推广 ,转 Bt基因作物释放后对生态环境及其它方面产生的潜在影响越来越受到重视。分别从生物活性杀虫晶体蛋白在土壤中的残留特性、杀虫晶体蛋白对土壤中非目标生物的影响、转 Bt基因玉米植株体成分的变化、转Bt基因玉米花粉中杀虫晶体蛋白的表达特性及其在田间和马力筋叶片上的散积状况、花粉中表达的杀虫晶体蛋白对君主斑蝶的毒性、君主斑蝶幼虫暴露在 Bt花粉中的概率及综合风险评价估算等方面对转 Bt基因玉米产生的杀虫晶体蛋白与土壤生态环境的相互作用、花粉对非目标生物影响的研究现状进行了综述。通过对转 Bt基因作物生态安全性的科学评价和广泛宣传 ,以确保生物技术的健康发展。     

转Bt基因作物释放杀虫晶体蛋白对土壤生态安全的影响

随着转Bt基因抗虫作物的大面积推广种植,其环境安全性问题日益引起关注。转Bt基因作物在生长期内持续不断地向环境释放杀虫晶体蛋白,这些杀虫晶体蛋白积累一旦超过了昆虫的消耗及环境因子对其的钝化,就可能对非靶标昆虫或土壤微生物造成伤害。转Bt基因作物向土壤中释放杀虫晶体蛋白的途径主要有3种:根系分泌、花粉飘落和秸秆还田。释放到土壤中的Bt杀虫晶体蛋白能够迅速被土壤活性颗粒吸附,1～3 h就能达到吸附平衡。吸附态Bt杀虫晶体蛋白不易被土壤微生物或酶降解,导致杀虫活性持续时间显著延长。土壤微生物种群变化是衡量Bt作物对土壤生态影响的重要指标。研究表明,Bt作物根系分泌物或Bt生物体降解释放的杀虫晶体蛋白对于土壤蚯蚓、线虫、原生动物、细菌和真菌没有毒性,但可使丛枝菌根真菌(AMF)菌丝长度减小,不能形成侵染单元。Bt杀虫晶体蛋白对土壤酶活性的影响程度依这类蛋白的导入方式或Bt作物生育期的不同而呈现差异。土壤中Bt Cry1Ab蛋白能被部分后茬作物吸收,但不同的商品试剂盒检测结果存在差异。文章综述了Bt杀虫晶体蛋白在土壤中释放、吸附、残留特性及其对土壤动物、土壤微生物、土壤酶活性和后茬作物的影响,旨在为转Bt基因作物释放杀虫晶体蛋白的土壤生态安全评价提供参考依据。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白超量表达的机制

杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌主要杀虫成分,进一步提高杀虫晶体蛋白的表达量是苏云金芽杆菌高效工程菌构建的主要途径。本文讨论了ｃｒｙ基因启动子活性、ｍＲＮＡ稳定性、不同ｃｒｙ基因间的协同表达发及伴了孢晶体的形成等几个方面在转录水平或转录后水平上对杀虫晶体蛋白表达的影响。     

苏云金芽胞杆菌菌株YBT833含不同杀虫晶体蛋白基因转化子的特性

用电脉冲方法将含有苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙ１Ｃ的重组质粒ｐＢＭＢＬＣ转入野生菌株ＹＢＴ８３３,获得含不同杀虫晶体蛋白基因的４个转化子。质粒检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明它们均为菌株ＹＢＴ８３３含重组质粒ｐＢＭＢＬＣ的转化子。ＰＣＲ扩增表明,转化子ＹＢＴ８３３－１保留了原有的杀虫晶体蛋白基因;转化子ＹＢＴ８３３－２丢失了基因ｃｒｙ１Ａｂ;转化子ＹＢＴ８３３－３则丢失了所有的杀虫晶体蛋白基     

用单链和PCR相结合的方法合成绿豆胰蛋白酶抑制剂基因

本文报道用单链与PCR技术相结台的合成方法合成了胰蛋白酶抑制剂基因,包括氨基酸编码顺序、起始和终止密码子,上、下游两端的EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ限性酶识别顺序等全长共248个碱基对。合成基因的编码是参考其它植物的蛋白酶抑制剂基因的同源编码和植物基因的偏爱密码子来进行设计的。合成的基因双链经限制酶EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ在两端切出粘性末端后克隆到pUCl9中,克隆基因结构的正确性经过限制酶图谱和DNA序列分析得到完全的证明。     

苏云金芽胞杆菌cyt2Ba16基因的克隆表达

[目的]获得苏云金芽胞杆菌QL32-1中杀虫晶体蛋白基因,并分析其杀虫活性。[方法]采用cyt基因通用引物、两步法染色体步移的方法对QL32-1中cyt基因进行鉴定和全长克隆,再构建重组质粒pET-28a-2Ba16,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,最后对表达蛋白进行杀虫活性分析。[结果]克隆得到1个全长783 bp cyt2B基因,其编码260个氨基酸,推导分子量约29.69 kDa,此氨基酸序列与已知的Cyt2Ba1蛋白同源性最高,为92.4%。该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cyt2Ba16。杀虫活性分析表明:cyt2Ba16对双翅目的库蚊(Culex quinquefasciatus)具有显著的杀虫活性,LC50为9.73μg/mL。[结论]cyt2Ba16基因是一个对库蚊具有较高杀虫活性的新型cyt基因,为QL32-1菌株的应用提供理论基础。     

抗烟青虫转基因烟草的培育

烟青虫属鳞翅且(Lpidoptera)昆虫。前人研究表明,苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)中的Bt毒蛋白对其具有很强的毒杀作用。设法将Bt基因导入到烟草中,是防治这类虫害的一种有效途径。80年代后期以来,为了提高Bt基因在植物中的表达水平,在编码区密码子的优化、编码顺序的改进和高效启动子的选配方面．都有了很快的发展。有些经过部分改进或人工全合成的Bt基因,还被先后导入到番茄〔1.2〕、烟草〔2-4〕、棉花〔5.6〕、玉米〔7〕、水稻〔8〕等重要作物中。迄1995年止．在美国获准可供商业用的Bt毒蛋白转基因作物已有槔花、玉米和马铃薯等〔9〕。在烟草中迄今未见有Bt毒蛋白转基因株达到生产实用水平的报道。本实验试图通过农杆菌介导法,将密码子经过优化的Bt基因cryIA(b)及cryIA?〔10〕叫导入离体培养的烟草叶片,然后使之再生,形成转基因植株,再从其后代中选育出既保留原品种优良农艺性状,又具有对烟青虫稳定抗性的转基因株,以期提高该品种的稳产性,降低杀虫农药成本。保护烟田的良好生态环境。     

苏云金芽孢杆菌毒蛋白发掘方法的研究进展

自上世纪初发现苏云金芽孢杆菌对昆虫有杀虫活性以来,如何发掘利用苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白服务于农业生产和人类的卫生防控就成为一个重要课题。从早期的分离菌株使用菌体的复合物喷施到使用分子手段转化植物特定表达,人类在苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的利用精准度上在不断提高,但随之而来就是抗性的产生。因此不断发掘可使用的新的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因资源就是一个很重要的话题。本综述就苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的发掘方法研究做一系统论述。     

转基因棉种植对土壤水解酶活性的影响

转Bt基因棉和转Bt＋cpTI基因棉种植面积不断扩大,它们种植后杀虫晶体蛋白在土壤中的残留特性及对土壤水解酶活性的影响是环境风险评价的重要组成部分,本文采用盆栽实验的方法对此进行了初步研究。结果表明,转基因棉出苗后生长到30天时可向土壤中释放Bt杀虫晶体蛋白,而双抗棉种植时CpTI杀虫晶体蛋白的释放量与品种有关;转基因棉出苗后30天时,与等价基因系非转基因棉（各对照）相比,转Bt基因棉（“中30”）和双抗棉A（转Bt＋CpTI棉“中41”）的种植并未使脲酶、蛋白酶和磷酸单脂酶活性发生显著变化,而双抗棉B（转Bt＋CpTI棉“双抗321”）的种植使土壤磷酸单脂酶活性显著下降。从杀虫晶体蛋白的释放和对酶活性的影响来看,双抗棉A的种植对土壤的生物活性扰动更小。     

Sigma因子和启动子上游区在苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因表达调控中的作用

苏云金芽胞杆菌质粒编码的杀虫晶体蛋白基因的转录与芽胞形成σ因子密切相关,启动子的重叠是原毒素合成的一种机制,并且启动子上游区以及宿主细胞中σ因子的竞争对原毒素合成均具有转录调控作用。     

土壤中对甲虫有活性苏云金芽胞杆菌的筛选

近几年来,甲虫已成为十字花科蔬菜的头号害虫。本文采集了湖北省各地区192份土壤样品,分离到苏云金芽胞杆菌(简称Bt)菌株74株,以甲虫代表——黄粉虫为靶标昆虫筛选了15株典型Bt,得到一株对甲虫有活性的Bt L1;生物测定该菌的半致死浓度(LC50)为221.20μg·g-1;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示L1至少具有3个杀虫晶体蛋白;PCR扩增杀虫晶体蛋白基因,测序发现Bt L1中含有cry1Ac,cry1Aa,cry1Ia基因,推测Bt L1中对甲虫活性的杀虫晶体蛋白基因为cry1Ia。     

合成编码蛋白质基因的设计

 本文以牛生长激素基因为例,对合成编码蛋白质基因的微机设计原理进行了探讨。微机程序的编制采用高级BASIC语言,在IBM-PC微机上完成。设计合成编码蛋白质基因的要点为:(1)按照宿主系统中高表达蛋白质基因对密码子的使用频率选用氨基酸密码子,以期合成基因得到高效表达;(2)对较大的合成基因设计有能够进行分段克隆的酶切位点,从而将一个大的基因分解成为多个基因片段的合成,减少了酶促连接化学合成DNA片段的步骤;(3)对于酶促连接化学合成DNA片段有干扰的重复顺序和互补顺序,则利用变换简并密码子的办法予以消除。     

黄毛纺蚋线粒体基因组全序列测定与分析

利用PCR步移法对黄毛纺蚋的线粒体基因组全序列进行了测定和分析。黄毛纺蚋线粒体基因组全长15904 bp(Gen Bank序列号KP793690),包括13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因以及长度为939 bp的非编码区。A、T、C、G碱基含量分别为39.1%、35.8%、10.4%、14.7%。9个蛋白编码基因和14个tRNA基因在J链编码,其余4个蛋白编码基因和8个tRNA基因在N链编码,基因排列顺序与其它已知双翅目昆虫相同。13个蛋白编码基因中除COI以TTG作为起始密码外,其余蛋白质基因均以ATN作为起始密码子,终止密码子多数为典型的TAA、TAG,只有COI和ND4L以单独的T作为终止密码子。在所测得的22个tRNA基因中,除tRNASer(AGN)缺少DHU臂外,其余tRNA均能形成典型的三叶草结构。     

植物抗早基因工程研究进展

从植物抗虫基因工程的研究历史出发,论述了第一代抗虫基因、第二代抗虫基因,重点介绍了B.t．杀虫晶体蛋白基因、胆固醇氧化酶基因和营养杀虫蛋白基因,并对植物抗虫基因工程中所遇到的问题和解决办法进行了探讨。     

5种中国苏云金芽孢杆菌的伴孢 晶体蛋白基因分析

利用聚合酶联反应(PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分析了5种中国苏云金杆菌制剂菌株的伴孢晶体蛋白及其基因组成。结果发现,5种菌株均含有cry1Aa和/或c和/或d和/或b基因,只有Bt+Virus菌株含有cry1Ab基因,cry1A基因编码的伴孢晶体蛋白分子量约为130 kD;仅有JS-Bt C菌株含有cry1B基因,其编码的伴孢晶体蛋白分子量约为138 kD;除HB Bt C菌株外,其余4个菌株均含有cry2Aa和/或b基因,这类基因编码分子量为70 kD的伴孢晶体蛋白;所有5个菌株都含有cry1I基因,其编码的伴孢晶体蛋白分子量应为81.2 kD,但实验中未曾检测到cry1I基因的表达;所有的菌株都不含有cry1C和cry1D基因。     

表达昆虫特异性神经麻痹毒素AaIT的杀虫杆状病毒的构建

根据杆状病毒核多角体基因及植物基因的密码子选择偏向、G+C含量和密码子第三位碱基的G+C含量,同时综合在真核系统中影响基因转录、翻译及影响mRNA稳定性等因素,在不改变所编码的氨基酸序列的基础上,设计并人工合成了昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因。合成的AaIT基因与合成的gp67信号肽DNA序列正确融合后通过杆状病毒转移载体pSXIV VI⁺X3体内重组到粉纹夜蛾多角体病毒(Trichoplusia ni nuclear polyhedrosis virus,TnNPV)上,得到重组病毒TnNPV-AaIT。经Southern blotting验证了AaIT基因整合在TnNPV基因组中,SDS-PAGE证明AaIT基因在重组病毒中的表达。通过用重组病毒口服感染供试昆虫,证明了含AaIT基因的重组病毒能显著缩短杆状病毒的杀虫时间,提高杀虫效率。这是迄今为止我国构建的第一株具有实用价值和应用前景的基因工程病毒。