禽Ⅰ型副粘病毒f基因克隆及序列分析

用RT-PCR一步法对云南省不同禽类(鸡、鸽子)3株禽I型副粘病毒F基因进行扩增和克隆,并对其f基因片段核苷酸序列进行分析,结果表明,云南省禽I型副粘病毒各毒株同源性为88.1%～94.9%,与疫苗株LaSota和强毒株F48E9的同源性为85.6%.所分离两株新城疫病毒在F蛋白裂解位点区(112～117aa)的氨基酸序列与强毒株在这一区域的序列完全相同,表明为强毒株.鸽I型副粘病毒F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与PPMV ZQ98-1株在这一区域的序列完全相同,揭示为中强毒株.以1 662bp核苷酸绘制系统发育树,表明云南地方新城疫病毒属于基因Ⅶ型,鸽I型副粘病毒属于基因Ⅵ型.     

禽I型副粘病毒f基因克隆及序列分析

用RT-PCR一步法对云南省不同禽类(鸡、鸽子)3株禽I型副粘病毒F基因进行扩增和克隆,并对其f基因片段核苷酸序列进行分析,结果表明,云南省禽I型副粘病毒各毒株同源性为88.1%～94.9%,与疫苗株LaSota和强毒株F48E9的同源性为85.6%。所分离两株新城疫病毒在F蛋白裂解位点区(112～117aa)的氨基酸序列与强毒株在这一区域的序列完全相同,表明为强毒株。鸽I型副粘病毒F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与PPMV ZQ98-1株在这一区域的序列完全相同,揭示为中强毒株。以1 662bp核苷酸绘制系统发育树,表明云南地方新城疫病毒属于基因Ⅶ型,鸽I型副粘病毒属于基因Ⅵ型。     

鹅Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97-1株HN基因的克隆和序列分析

在华南地区进行鹅病病因的调查过程中,从患病鹅群中分离到一株对鹅和鸡都有致病力的病毒,初步判定该病毒属于Ⅰ型禽副粘病毒,命名为GPMV／QY97—1株。以GPMV／QY97—1毒株的基因组RNA为模板,通过RT—PCR方法,扩增出血凝素-神经氨酸酶(HN)基因3’端和5’端的cDNA片段,分别将其克隆至pGEM—TEasy载体中,对其进行序列测定。序列分析表明,HN基因的cDNA全长为2024nt,编码571个氨基酸。序列中含有13个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其HN基因及编码蛋白结构与新城疫病毒株相符。将GPMV／QY97-1株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫病毒株的HN基因相应序列做比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在89．6％～83．6％,氨基酸序列同源性在93．3％～87．9％。在同源性比较的基础上,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病学调查有着重要意义。     

鸽Ⅰ型副粘病毒F基因序列的扩增、序列测定及同源性分析

目的根据NDV的F基因保守区设计1对引物．用RT-PCR方法扩增出鸽Ⅰ型副粘病毒JS株融合蛋白基因(F基因)的部分片段,并测序。结果表明,JS株与现今国际上已发表的NDV的LaSota株F基因的同源性为96．6％,与F48E9株F基因的同源性为94．0%。     

鹦鹉源Ⅰ型禽副粘病毒F和HN基因序列测定与分析

禽副粘病毒(Avian paramyxovirus,APMV)属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属,现已确定有9个血清型(APMV-1～9).     

鹦鹉源Ⅰ型禽副粘病毒F和HN基因序列测定与分析

禽副粘病毒(Avian paramyxovirus,APMV)属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属,现已确定有9个血清型(APMV-1～9)。APMV-1血清型是禽类最重要的致病型,几乎所有禽种均对其敏感。该病毒是一种有囊膜的单股负链RNA病毒,由囊膜、核衣壳和核酸组成;基因组全长约15kb,     

鹦鹉源I型禽副粘病毒F和HN基因序列测定与分析

Virion RNA was abstracted from purified type I Avian paramyxovirus strain YN-PA01(isolated from parrot)and used as a template. The fragment containing the fusion gene(F) and hemagglutinin-neuraminidase gene(HN) of the isolate was amplified by RT-PCR and cloned to the pMD18-T Vector. Using primer walking method the complete sequence of F-HN genes was obtained finally.And the respective amino acid sequence was deduced. Through relative software the phylogenetic trees on F gene and HN gene were constructed between strain YN-PA01 and reference strains. The results showed that strain YN-PA01 comparing with reference strains displays 98.7%-83.2% nucleotide homology and 98.1%-86.2% amino acid homology on F gene; 97.4%-79.1% nucleotide homology and 97.2%-83.2% amino acid homology on HN gene. Additional 6 amino acids are encoded by the HN gene ORF of strain YN-PA01 comparing with national reference strains.The studied strain YN-PA01 exhibits highest identities with strain JS/5[O1/Go either analyzed on F gene or HN gene.     

禽Ⅰ型副粘病毒各种禽源分离株毒力及其相关基因的研究

用测定新城疫病毒(NDV)毒力的经典方法,即鸡胚平均死亡时间(MDT)和脑内接种致病指数(ICPI),对源于鸡、鸽、鹅、珍珠鸡、孔雀、鹌鹑和画眉鸟等7种禽(鸟)源的共14个禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)广西分离株,分别测定了毒力。同时对分离株F基因的N一端前段和HN基因的e末端片段进行扩增、测序和分析,并绘制系谱树。结果发现,分离株的MDT在36h～75h之间,除1株鸽源毒株gxp22的ICPI值为0外,其余分离株在1．09～1．95之间;除孔雀源的分离株gxpc52在F基因裂解位点附近的氨基酸序列为^112R-RQ-R-R-F^117之外,其它13株均为^112R-R-Q-K-R-F^117,都符合强毒株的特征。所有分离株与国内参考强毒株F48E8和国外参考强毒株HER／33在HN基因e末端终止密码子的位置相同,也符合强毒株的特征。根据F基因核苷酸序列绘制的系谱树发现,近几年来在广西流行的APMV-1毒株的基因型为Ⅶd亚型;根据HN基因核苷酸序列绘制的系谱树表明,广西各种禽源APMV-1分离株可分为2个群。研究的结果表明,根据F基因裂解位点附近的氨基酸序列和HN蛋白翻译的终止密码子的位置判定APMV-1毒力的结果,都与毒株在临床上的致病情况相符。因此,根据F基因和HN基因序列和结构的特征,均可以判定APMV-1临床分离株的体内致病性。     

鹅副粘病毒WF00 G分离株HN蛋白基因的测序与序列分析

用鹅副粘病毒凤阳分离株WF00G做9～10日龄SPF鸡胚的尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF00G病毒的HN基因,获得了1条约1．8kb的特异性条带。PCR产物回收纯化后测序。测序结果表明,扩增片段大小为1844bp,含有1个1716bp的开放性阅渎框,编码571个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：WF00G株与其他12株鹅副牯病毒的同源性为89．9％-99．2％,与国内外其他NDVHN基因的同源性为81．7％～95．7％,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为84．7％,说明WF00G与国内外的传统毒株有较大变异。与Taiwan95株和NL／96株的同源性为94．3％和95．7％,说明WF00G与Taiwan95株和NL／96株亲缘关系较近,具有较高的相似性。     

矛尾鱼Hoxa—11基因克隆及5′端序列分析

Hoxa-11基因调节鱼类鳍和四足动物肢的发育,在脊椎动物进化过程中起着重要的作用,利用人和鼠的Hoxa-11基因保守序列设计了两个兼并引物,通过PCR扩增到了矛尾鱼的Hoxa-11基因,经克隆和DNA序列分析,该片段为2065bp,包括绝大部分外显子Ⅰ,内含子和部分外显子Ⅱ,编码204个氨基酸,其氨基酸序列与人、鼠、鸡、蛙和斑马鱼的同源性分别为66.0%、67.6%、74.4%、72.8%和59.7%。外显子Ⅰ的长度从矛尾鱼到蛙、鸡、鼠和人呈现逐步上升趋势,人比矛尾鱼增长了16%,进一步分析,外显子Ⅰ可分为4个区域;两个高度保守区域,1个中度保守区域和1个可变区域,外显子Ⅰ的长度变化主要是由于可变区域内丙氨酸同聚物以及两侧富含甘氨酸和丝氨酸序列的累积。矛尾鱼只有1个由两个丙氨酸组成的同类物,蛙有1个由5个连续丙氨酸组成的同聚物,而鸡、鼠和人有3个丙氨酸同聚物,其中最大的同聚物由7个连续丙氨酸组成,而且在同聚物两侧出现了富含甘氨酸和丝氨酸序列。这表明可变区域可能与脊椎动物进化和鳍-肢转换过程中新功能的获得有关。同源异型盒所在的外显子Ⅱ区和剪接位点是高度保守的。内含子的长度变化较大,但在其内部也发现了两个高度保守的35bp和16bp的DNA片段,这两个片段在人、鼠、鸡、蛙和矛尾鱼中是完全相同的,这些序列的高度保守性提示其功能上的重要性。     

苹果蠹蛾线粒体DNA COⅠ基因克隆与序列分析

本研究采集新疆阿拉尔地区苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)幼虫,对其线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因进行了扩增、克隆和测序,并对COⅠ序列进行了分析。结果显示:苹果蠹蛾DNA扩增出的COⅠ基因序列片段长度为709bp,序列中A+T含量极高,占68.7%,而G+C的含量只有31.3%。经基因序列比对,与其它几种食心虫的同源性为85.4%～88.1%,遗传距离为0.130～0.162;采用NJ法构建了卷蛾科系统树,所得的聚类结果与传统的分类结果基本一致。本研究结果为苹果蠹蛾快速鉴定的DNA条形码技术研究提供重要基础。     

副粘病毒Tianjin株NP蛋白的表达及分析

1999年,本实验室从群体性暴发的急性呼吸道感染素致死的普通棉耳绒猴肺组织中分离到一株副粘病毒,命名为副粘病毒 Tianjin株.经研究发现该动物中心的工作人员都有此病毒抗体,且正常人群(献血员)抗体阳性率高达46%,急性呼吸道感染的患儿抗体阳性率为19.28%,提示此病原体与人类可能有密切的关系.     

可溶性CD14基因克隆及序列分析

针对人可溶性CD14(sCD14）的cDNA序列设计引物,通过反转录PCR技术,从U937细胞中,扩增出编码人可溶性CD14的基因序列,并将其克隆至质粒pGEM－T中,通过PCR、酶切及序列测定鉴定重组载体。结果表明获得了人可溶性CD14基因片段,为下一步进行CD14表达及生物学活性研究奠定了基础。     

赤链蛇Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列,设计一对兼并引物,采用PCR技术扩增了赤链蛇的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序,结果在雌雄个体中共筛选出三个Sox基因,其中有一个为雌雄共有,显示出性别差异性;三个Sox基因编码的氨基酸序列与人相应SOX3,SOX4,SOX22基因的相似性分别为96%,98%,96%。显示出Sox基因在进化上的高度保守性,本文为赤链蛇的性别决定机制研究提供了分子资料。     

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT—PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1．7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEM^R—T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株BHD衣壳蛋白基因片段长度为1740bp,共编码580个氨基酸。该核酸序列与其它国家报道的多株BHDV序列相互间同源性高达98．2％一99．0％,其推导的氨基酸序列同源性也达98．3％--99．1％,为极度保守片段。     

副鸡禽杆菌aroA基因克隆及序列分析

旨在建立一种方便、高效的同源保守基因克隆方法,并对副鸡禽杆菌aroA基因进行克隆和结构分析。本试验以副鸡禽杆菌国际标准株145(C-3)基因组DNA为模板,用CODEHOP软件设计针对aroA基因的兼并引物,并运用改进的染色体步移方法扩增aroA基因序列;对该核酸序列及其编码蛋白进行结构分析并与该菌其他血清型及相关细菌进行序列比对分析。结果显示,获得了完整的aroA基因,全长1 293 bp。该基因编码由430个氨基酸组成的多肽,具有2个功能位点和5个抗原表位位点。不同血清型间氨基酸序列同源性为88.1%-100%,与其他相关细菌核酸同源性为75%以上。首次将兼并PCR和改进的染色体步移技术结合起来对副鸡禽杆菌aroA基因全长进行扩增研究,得到了预期的结果。     

鸭副粘病毒WF01 D株F基因的测序与蛋白特性分析

用鸭副粘病毒凤阳分离株WF01 D作9～10日龄SPF鸡胚的尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF01 D病毒的F基因,获得了1条长约1．7kb的特异性条带。用PCR产物直接测序。测序结果表明,扩增片段大小为1782bp,含有1个1662bp的开放性阅读框,编码554个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：WF01 D株与国内外其他NDVF基因的同源性为84．5％～97．0％,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为86．6％,说明WF01 D与国内外的传统毒株有较大变异。与Taiwan95株和J株的同源性为93．6％和97．0％,说明WF01 D与Taiwan95株和J株亲缘关系较近,具有较高的相似性。F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117,表明为NDV的强毒株。蛋白疏水性和抗原性分析表明与标准强毒F48E9株相比没有太大的变异。     

虎纹蛙四个Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG－box保守区的序列,设计一对兼并引物,扩增了虎纹蛙的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果在雌雄个体中共筛选出四个不同的Sox基因,其序列与人相应SOX基因的相似性分别为92％、94％、985和98％。本研究为探索虎纹蛙的性别决定机制提供了分子资料。     

鹅副粘病毒WF（01）G株F基因的测序与蛋白特性分析

用鹅副粘病毒WF01G分离株进行9-10日龄SPF鸡胚尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF01G病毒的F基因,获得了1条长约1.7 kb的特异性条带。对PCR扩增产物测序。结果表明,扩增片段大小为1782 bp,含有1个1662 bp的开放性阅读框,编码554个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：WF01G株与其他7株鹅副粘病毒的同源性为84.8%-98.8%,与国内外其他NDV F基因的同源性为84.7%-93.8%,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为86.8%,说明WF01G与国内外的传统毒株有较大变异。与Tai-wan95株的同源性为93.8%,说明WF01G与Taiwan95株亲缘关系较近,具有较高的相似性。F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112Arg-Arg-G ln-Lys-Arg-Phe117,表明为副粘病毒强毒株。蛋白疏水性和抗原性分析表明与标准强毒F48E9株相比没有太大的变异。