草鱼自噬相关基因Beclin1的克隆及其在MC-LR胁迫下的表达特征

为评估微囊藻毒素-LR (MC-LR)对鱼类自噬的影响, 根据转录组测序结果得到的EST序列, 采用RACE技术获得了草鱼(Ctenopharygodon idella)自噬基因Beclin1 (CiBeclin1)的cDNA全长序列。该基因序列全长1590 bp, 包括1344 bp的开放阅读框, 编码447个氨基酸, 分子量为51.2 kD, 理论等电点为4.88。CiBeclin1包含1个BH3和1个ECD结构域。CiBeclin1氨基酸序列与其他物种的相似性为88%—98%, 构建的进化树显示CiBeclin1与稀有鲫(Gobiocypris rarus)的Beclin1亲缘关系最近。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测结果表明, CiBeclin1在肝、肾、脾等10种不同组织中均广泛表达, 但在肝脏组织中的相对表达量最丰富, 显著高于相对表达量最低的头肾组织(P<0.05)。在不同剂量(25和100 μg MC-LR/kg BW) MC-LR胁迫24h、48h、72h和96h后, 草鱼肝脏中CiBeclin1表达量均显著低于对照组的表达水平, 研究结果表明, MC-LR能抑制草鱼CiBeclin1的表达, 但MC-LR是否在该剂量下诱导了草鱼的自噬还有待于进一步研究。     

MC-LR对草鱼组织显微结构及HO-1、IL-10R1基因表达的影响

该项目主要研究微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)对草鱼机体的毒害作用。草鱼经腹腔注射微囊藻毒素-LR的剂量为100μg/kg, 0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h后对草鱼组织和血液采样,然后进行组织显微结构和基因HO-1和IL-10R1的表达分析。(1)通过光学显微镜观察,肠道组织病理变化表现为肠绒毛上皮细胞脱落,杯状细胞增多,上皮细胞的细胞核变形; 6 h实验组出现肠道充血; 12 h实验组和24 h实验组肠绒毛黏膜固有层分离,且有时间效应。(2)采用荧光定量PCR技术对HO-1和IL-10R1基因进行检测,结果显示草鱼鳃、肝脏、肠道、脾脏和心脏组织各实验组较对照组的HO-1基因表达量显著降低(P<0.05),同时草鱼脑、肝脏、肠道、脾脏组织和血液各实验组较对照组的IL-10R1基因表达量显著降低(P<0.05)。微囊藻毒素-LR导致草鱼肠道、肝脏和鱼鳃等器官的病理损伤和HO-1和IL-10R1基因表达量显著降低,可为MC-LR刺激草鱼的炎症反应与免疫反应提供相关理论依据。     

草鱼TP53INP1基因的克隆及微囊藻毒素对其表达的影响

为深入研究肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1(Tumor protein 53-induced nuclear protein 1, TP53INP1)的结构及其在微囊藻毒素-LR(MC-LR)胁迫下的表达变化,以MC-LR诱导的草鱼(Ctenopharygodon idella)肝脏转录组测序获得的unigenes序列为基础,扩增获得了TP53INP1基因的cDNA序列(GenBank登录号:MG797689),其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)为759 bp,编码252个氨基酸,属于β类型,具有4个PEST结构。氨基酸同源性分析结果表明, TP53INP1具有较高的保守性,其中与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)相似性最高。系统进化分析结果表明其与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)、斑马鱼(Danio rerio)等鱼类聚为一大支。采用荧光定量PCR分析发现TP53INP1基因在草鱼各组织中广泛分布,其中,在肝脏和血液等组织中表达丰富,显著高于在头肾组织中的表达(P<0.05)。采用Western blot检测分析不同剂量...     

内质网应激预处理条件下大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的建立

目的:通过建立了内质网应激预处理条件下的大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,探讨内质网应激预处理在体内的应用.方法:以衣霉素为内质网应激诱导剂,采用大鼠肝脏70%缺血再灌注损伤模型.按照不同给药剂量分为50μ g/kg组、100μ g,kg组、200μ g/kg组、对照组,观察不同给药剂量条件下,血清转氨酶水平的变化.结果:给药100μ g/kg体重、诱导5天条件下大鼠术后转氨酶水平显著低于对照组.其它组与对照组无统计学差异.肝组织病理切片证实该预处理条件对肝脏缺血再灌注损伤有显著保护作用.结论:在特定的给药剂量条件下,衣霉素诱导的内质网应激预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有显著的保护作用.     

罗非鱼微囊藻毒素去毒相关基因克隆与活体表达研究

可溶性谷胱甘肽S-转移酶(Soluble glutathione S-transferase,sGST)催化微囊藻毒素(Microcystins,MCs)与还原型谷胱甘肽(GSH)的加合去毒代谢过程,谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)为sGST的去毒反应提供GSH,解偶联蛋白2(Uncoupling protein 2,UCP2)则可抑制微囊藻毒素诱发活性氧导致的肝细胞凋亡。本研究从罗非鱼肝脏通过简并引物克隆sGST、GPX与UCP2基因cDNA核心序列,并应用5’RACE和3’RACE技术分别扩增罗非鱼肝脏sGST基因cDNA序列5’末端和3’末端序列而获得其cDNA全序列。罗非鱼肝脏sGST基因cDNA全序列长861 bp,其中5’非翻译区(5-’UTR)为25 bp,3’非翻译区(3-’UTR)为167 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码222个氨基酸,包含脊椎动物完整sGST的2个功能域:N-末端功能域(GSH结合位点)和C-末端功能域(底物结合位点)。罗非鱼sGST与真鲷、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)、斑马鱼同源性较高,达到64.3%—78.5%,而与人、大鼠、小鼠、牛、猪、鸡差异较大,氨基酸同源性为48.2%—55.9%。罗非鱼肝脏GPX、UCP2基因cDNA核心序列长280 bp、776 bp,分别编码92、258个氨基酸。罗非鱼GPX与条石鲷、虹鳟、斑马鱼、人、大鼠、小鼠、牛、猪GPX同源性均较高,达到69.6%—85.9%。罗非鱼UCP2与真鲷、斑马鱼、鲤鱼、欧洲白鲑(Leuciscus cephalus)、草鱼、人、大鼠、小鼠UCP2同源性更高,达到71.8%—93.8%。通过对罗非鱼(5—8 g)活体腹腔注射亚致死量MC-LR(50μg/kg bwt),发现微囊藻毒素对罗非鱼肝脏sGST基因表达有显著的诱导作用(p<0.05),注射微囊藻毒素24h后sGST基因mRNA表达水平上调80%。注射微囊藻毒素24h后,虽然罗非鱼肝脏GPX与UCP2基因mRNA表达水平亦出现明显的升高趋势,但两者均未出现显著性的变化(p>0.05)。本研究从基因表达调控的角度证实,罗非鱼肝脏sGST在微囊藻毒素去毒过程中可能发挥关键作用,同时也说明罗非鱼肝脏GPX、UCP2基因可能在微囊藻去毒过程中发挥协同作用。     

亚硝酸钠诱导的草鱼肝细胞凋亡中内质网应激IRE1通路的作用研究

为探究亚硝酸钠诱导草鱼肝细凋亡中内质网应激IRE1通路的作用, 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝细胞L8824分别置于亚硝酸钠浓度为0、5、20和50 mg/L暴露12h和24h。同时采用三磷酸肌醇受体拮抗剂2-APB和IRE1α抑制剂STF-083010分别和20 mg/L亚硝酸钠共同孵育L8824细胞24h。检测细胞凋亡以及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, jnk)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bcl-2 associated X protein, bax)、caspase9、caspase3、肌醇酶1α (inositol requiring enzyme 1α, ire1α)、X盒结合蛋白 1s (X-box binding protein 1s, xbp1s)和葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein78, grp78)基因的表达和细胞质内钙离子浓度。结果表明: 与对照组相比, 亚硝酸钠处理组细胞凋亡率显著上升, jnk、bax、caspase9、caspase3、ire1α、xbp1s和grp78 mRNA的表达显著升高, bcl-2 mRNA的表达量显著下降, 细胞质内钙离子浓度显著上升。与亚硝酸钠单处理组相比, STF-083010处理组细胞凋亡率显著下降, ire1α、xbp1s、grp78、jnk、bax、caspase3 mRNA表达量显著下降, bcl-2 mRNA表达量显著上升, 2-APB和STF-083010两个处理组细胞质内钙离子浓度均显著下降。结果显示, 高浓度的亚硝酸钠可诱导草鱼肝细胞凋亡和钙离子紊乱, 内质网应激IRE1通路发挥了作用。     

单宁酸联合顺铂增强肝癌HepG2细胞IRE1-XBP1通路的激活水平

本文主要研究单宁酸(TA)联合顺铂(CDDP)对肝癌HepG2细胞内质网应激IRE1-XBP1通路的影响。用180μM单宁酸、0.9μg/m L顺铂单独用药或者联合用药处理肝癌HepG2细胞24 h或48 h后,应用流式细胞技术测定HepG2细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR技术(q-RT-PCR)、蛋白免疫印迹(western blot)技术检测IRE1α和XBP-1分子的表达水平。MTT结果显示,单宁酸和顺铂均能显著抑制HepG2细胞的生长,且均呈剂量性依赖;二者联合用药能够显著增加HepG2细胞的生长抑制率;流式细胞术结果显示,单宁酸与顺铂联合用药能够显著抑制HepG2细胞的增殖,并诱导细胞凋亡的发生;q-RT-PCR及Western blot结果显示,单宁酸与顺铂联合用药能显著上调细胞IRE1α和XBP-1的表达水平。结果表明单宁酸能够联合顺铂增强肝癌HepG2细胞内质网应激IRE1-XBP1通路的激活水平,提示IRE1-XBP1通路可能是单宁酸和顺铂协同抗肝癌HepG2细胞的分子机制之一。     

腹腔注射微囊藻毒素-LR对鲢鱼肝脏HO-1和IL-10R1基因表达的影响

本研究首先通过分子生物学方法克隆了鲢鱼血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)和白细胞介素10受体1(interleukin-10 receptor 1,IL-10R1)2个基因的c DNA片段,然后在腹腔注射微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)0.25 h、0.5 h和1 h后的3个时间点进行鲢鱼肝脏样本的采集,并利用荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)分析肝脏组织中HO-1和IL-10R1基因表达量的变化。实验结果:(1)克隆得到的鲢鱼HO-1和IL-10R1基因c DNA片段大小分别为133 bp和182 bp,BLAST分析发现鲢鱼HO-1基因c DNA片段与鲤鱼、鲫鱼、斑马鱼的基因序列都有很高的同源性,比例分别为93%、92%、86%;克隆得到的鲢鱼IL-10R1基因c DNA片段与草鱼、鲫鱼和斑马鱼的基因序列的同源性比例分别为98%、91%、81%。(2)q PCR结果显示HO-1基因在注射MC-LR 0.25 h后表达量显著升高,在0.5 h时开始略有下降,在1 h时表达量继续升高。IL-10R1基因表达量在3个时间点均显著升高,并处于持续上升趋势。总结出,在MC-LR的刺激下,HO-1基因被诱导大量合成起到保护细胞的作用,而IL-10R1基因表达量的升高可能会引起IL-10基因发挥功能作用参与炎症及免疫反应,表明HO-1和IL-10R1基因在鲢鱼去MC-LR的过程中都发挥着重要作用,更为进一步研究鲢鱼MC-LR的解毒机制提供了理论依据。     

玉屏风多糖合生元对热应激草鱼免疫性能的影响

为研究不同浓度的玉屏风多糖合生元对热应激草鱼免疫性能的影响, 选360尾健康草鱼Ctenopharyngodon idella (20±2) g, 随机分为4组。其中Ⅰ组为对照组, 试验组(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组)在饲喂基础日粮的基础上分别添加0.08%、0.12%和0.20%玉屏风多糖, 并在饲喂前按复合益生菌体积(mL)/饲料重(g)为 1%的剂量添加复合益生菌拌料, 整个试验期为21d。在饲养试验结束后, 对草鱼进行热应激48h处理, 在0h、6h、24h和48h的4个时间点采集样品并测定血清、肝脏生化指标和肝脏相关基因表达量。结果表明: Ⅲ组草鱼血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)在各时间点均显著低于对照组(P<0.05); 同时, 草鱼肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽还原酶(GR)在各时间点均不同程度高于对照组, 其中SOD在0h和24h(P<0.05), GR在0h和 48h均显著高于对照组(P<0.05), 而MDA均低于对照组, 其中在24h和48h显著低于对照组(P<0.05); 草鱼肝脏中Nrf2、Cu/Zn-SOD、GSH-Px、GR、HSP70和MHC Ⅱ相对表达量在各时间点均不同程度高于对照组, 其中GR和MHC II相对表达量在各时间点均显著高于对照组(P<0.05), 而Keap1和IL-8在各时间点均在不同程度低于对照组, 其中Keap1在各时间点均显著低于对照组(P<0.05), IL-8均差异不显著(P>0.05)。总之, 随着热应激时间的延长, 草鱼的血清和肝脏生化指标、肝脏相关基因表达量均产生了不同程度的变化, 说明热应激后草鱼产生了强烈的应激反应。在饲料中添加0.12%的玉屏风多糖合生元最有利于提高草鱼的抗氧化应激能力, 有效缓解肝脏氧化损伤, 具有较好的免疫调节作用。     

IRE1通路与肿瘤

内质网应激是细胞内广泛存在的一种应激反应。研究表明,内质网应激与肿瘤的发生发展密切相关。针对内质网应激及其相应信号通路进行肿瘤的预防或治疗受到了广泛关注。IRE1(inositol-requiring enzyme 1)通路是内质网应激诱发的最保守的信号通路。研究证实,IRE1及其主要的下游效应分子剪切型X 盒结合蛋白1与肿瘤进展密切相关。本文对IRE1通路与肿瘤发生发展、血管新生、肿瘤转移、肿瘤耐药性和恶性程度的相关性进行了阐述,同时分析了IRE1在不同肿瘤样本中的突变率、突变类型与病人存活状态的关系。作为肿瘤治疗的有效靶点,针对IRE1通路的调控能够有效延缓肿瘤的发生发展。     

草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1基因的克隆和表达分析

成纤维细胞生长因子受体同源类似物1(fgfrhl-1)基因是目前仅在鱼类基因组中检测到的fgfr基因家族成员, 该序列在鱼类进化过程中高度保守。为研究fgfrhl-1基因的表达情况和具体的功能, 在亲缘关系较远的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)中克隆了fgfrhl-1的cDNA序列, 并通过半定量RT-PCR和冰冻切片原位杂交分析了该基因在成体不同组织中的表达情况。克隆结果的序列分析表明: 草鱼fgfrhl-1 cDNA序列全长为1472 bp, 5′-UTR长213 bp, 3′-UTR长56 bp, 开放阅读框长1203 bp; 翘嘴鲌fgfrhl-1 cDNA序列全长为1886 bp, 5′-UTR长298 bp, 3′-UTR长385 bp, 开放阅读框长1203 bp。在两种鱼类中该基因都编码400个氨基酸, 其预测的氨基酸序列同源性高达95.5%。蛋白二级结构预测表明Fgfrhl-1具有FGFRs家族蛋白的胞内酪氨酸激酶区, 跨膜的螺旋区和胞外配体识别结合区, 但其胞外区比FGFRs缺少了3个免疫球蛋白样结构域。通过RT-PCR方法在两种鱼类的心脏、鳃、肝、脾、尾鳍以及肌肉组织的肌间隔中均检测到了fgfrhl-1表达, 但在肌纤维中均没有检测到其表达。对这两种鱼类的肌肉组织、肝脏和脾脏进行的组织切片原位杂交表明fgfrhl-1只在这些组织和器官的结缔组织及导管中表达, 不在间质细胞结构中表达。这些结果说明: fgfrhl-1的成体组织特异性表达模式在不同鱼类中基本一致, fgfrhl-1在鱼类各组织和器官的结缔组织和导管的细胞中表达, 不在间质细胞中表达。因此, fgfrhl-1可能在鱼类结缔组织及导管分化调控或功能维持中有独特作用。     

Molecular characterization of heat shock protein 70 genes in the liver of three warm freshwater fishes with differential tolerance to microcystin-LR

Heat shock protein 70 (HSP70) protect cell from oxidative stress by preventing the irreversible loss of vital proteins and facilitating their subsequent regeneration. Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix), grass carp (Ctenopharyngodon idellus), and Nile tilapia (Oreochromis nilotica) are three warm freshwater fishes with differential tolerance to microcystin-LR (MC-LR). Full-length cDNAs encoding the HSP70 were cloned from the livers of the three fishes. The HSP70 cDNAs of silver carp, grass carp, and Nile tilapia were 2356, 2348, and 2242 bp in length and contained an open-reading frame of 1950 bp (encoding a polypeptide of 649 amino acids), 1950 bp (649 amino acids), and 1917 bp (638 amino acids), respectively. Like mammalian HSP70, the HSP70 of the three fish was also composed of an ATPase domain from residues 1 to 383 (44 kDa), substrate peptide binding domain from residues 384 to 544 (18 kDa), and a C-terminus domain from residues 545 to 649 (10 kDa). The relatively high conservation of HSP70 sequences among different vertebrates is consistent with their important role in fundamental cellular processes. Using beta-actin as an external control, RT-PCR within the exponential phase was conducted to determine the constitutive and inducible expression level of HSP70 gene among the three fishes (6-12 g) intraperitoneally injected with MC-LR (50 μg kg(-1) body weight). Both constitutive and inducible liver mRNA levels of the fish HSP70 genes showed positive relationships with their tolerance to MC-LR: highest in Nile tilapia, followed by silver carp, and lowest in grass carp. The differential expression pattern of liver HSP70 genes in the three fish indicated a potential role of HSP70 in the detoxification process of MC-LR.     

草鱼两个细胞因子信号抑制因子3基因序列及表达分析

细胞因子信号抑制因子3 (SOCS3)是一类调节免疫反应的蛋白, 为研究其在草鱼(Ctenopharyngodon idella)中的功能, 文章克隆了草鱼SOCS3b基因, 分析了SOCS3s基因在成鱼组织中的表达情况。序列分析结果显示, 草鱼SOCS3b基因全长2126 bp, 编码216个氨基酸。qRT-PCR结果显示, 草鱼SOCS3a和SOCS3b在成鱼11个组织中均有表达, 但表达略有差异。注射嗜水气单胞菌(Aerononas hydrophila)后, 草鱼SOCS3a和SOCS3b在肝、脾、肠、肾中的表达均有明显上升。以上结果表明SOCS3s基因在草鱼的组织生长调控中发挥着重要的作用, 且SOCS3s可以调节细菌诱导的免疫应答。研究将为后续草鱼SOCS3s基因的功能研究提供参考依据。     

草鱼Isthmin-1基因序列分析及转录水平的营养调控

为探讨Isthmin-1(Ism-1)在草鱼糖和脂类代谢中的作用,研究采用RT-PCR技术克隆草鱼Ism-1的开放阅读框(ORF),生物信息学分析Ism-1及其编码的氨基酸序列, RT-qPCR技术检测Ism-1在草鱼各组织中的分布特点,并在细胞和活体水平上分析不同营养条件下Ism-1 mRNA的表达变化。结果显示,成功克隆草鱼Ism-1的ORF区。序列分析表明,草鱼Ism-1基因开放读码框为1380 bp,编码459个氨基酸,预测该蛋白相对分子量为50.96 kD。氨基酸多序列比对和系统进化树分析显示,草鱼Ism-1与黑头软口鲦(Pimephales promelas)的进化关系最近(氨基酸相似度为96.51%)。Ism-1在草鱼各组织中均有表达,在红肌中表达量最高,其次是鳃、脑和白肌等组织。饥饿再投喂实验结果表明,饥饿14d后肝胰脏中Ism-1的表达量显著上调(P<0.05),恢复投喂后表达量降低,但仍显著高于对照组(P<0.05),白肌中Ism-1的表达量在饥饿和再投喂后均显著增加(P<0.05)。腹腔注射不同浓度的胰高血糖素显著下调草鱼肝胰脏中Ism-1的mR...     

赤眼鳟Mx1基因的cDNA克隆及表达特性

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)是否存在Mx1 (Myxovirus resistance)基因及参与抗病毒免疫反应, 研究利用RACE技术获得了赤眼鳟Mx1基因(ScMx1)的cDNA全长序列, 并对其进行了生物信息学分析; 采用荧光定量PCR技术, 检测了ScMx1在赤眼鳟健康组织中的表达情况以及感染GCRV后ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达特征。结果表明, ScMx1的cDNA全长为3000 bp, 包含5′非编码区124 bp, 开放阅读框1893 bp, 3′非编码区983 bp, 共编码630个氨基酸。预测的ScMx1蛋白包含GTP酶结合区域、中央核心结构域和GTP酶效应结构域。ScMx1与青鱼Mx1的相似性最高(97%), 与ScMx的相似性仅为50%。ScMx1在所检测的10种组织中均有表达, 其中在脾脏中表达量最高。经GCRV感染开始至168h, ScMx1和ScIFN-Ⅰ在肝脏和体肾中的表达量持续上调; 在脾脏和头肾中于感染后72h达到峰值。相关性分析显示脾脏中ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达水平呈显著相关(r=0.94, P=0.018)。研究发现赤眼鳟存在Mx1基因, 且可能参与了抗GCRV免疫应答反应。     

饲喂不同浓度黄曲霉毒素B1饲料对草鱼幼鱼生长和毒素积累的影响

以含不同浓度黄曲霉毒素B₁(AFB₁)(0、10、20、100、1000和5000 μg/kg饲料)的6种等氮等能(32.96%蛋白质, 14.55 kJ/g能量)配合饲料饲喂平均初始体质量为(2.90±0.16) g草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼84d, 探讨AFB₁对草鱼幼鱼生长、肝胰脏和肾脏组织结构以及鱼体肌肉中的毒素积累的影响。实验分为6个实验组, 每组3个平行。结果表明, 在整个实验过程中各实验组幼鱼的行为均未表现出异常, 各组幼鱼的存活率、终末体重、摄食率、特定生长率、饲料效率、肝体比、脏体比均无显著差异。饲料AFB₁水平对草鱼幼鱼血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均无显著影响。各毒素组和对照组肝胰脏、肾脏组织学观察中未发现病理变化。摄食AFB₁≤1000 μg/kg的草鱼幼鱼肌肉中未检测出AFB₁残留, 仅在5000 μg/kg实验组中检测出肌肉中含有(1.21±0.18) μg/kg的AFB₁, 低于FDA食品安全限定标准。由此可见, 草鱼幼鱼至少可耐受AFB₁含量达5000 μg/kg饲料(实测值: 4979.2 μg/kg饲料) 84d。