大豆诱导型启动子驱动类受体蛋白激酶GmSARK转基因植物分析

植物LRR型类受体蛋白激酶在植物生命活动中发挥着重要作用。前期研究发现, 大豆(Glycine max)LRR型类受体蛋白激酶基因GmSARK可能参与调控大豆叶片的衰老过程。利用CaMV 35S启动子驱动组成型过表达GmSARK基因可导致转基因植株出现致死表型, 据此构建了可诱导型启动子GVG驱动GmSARK基因过表达的双元表达载体, 转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)并获得了多株转基因植株。研究结果表明, 外源施加诱导物地塞米松可引起GmSARK基因在转基因植株中过表达, 并导致转基因植株出现叶片变黄下卷和生长受抑制等表型; 外源细胞分裂素处理可以抑制GmSARK的表达, 但是不能逆转GmSARK过表达所引起的上述变化。     

棉花曲叶病毒互补链基因启动子功能区的缺失分析

棉花曲叶病毒(CLCuV)互补链基因启动子是一种新型的启动子,它能驱动外源基因在植物体内高效表达.为了研究其最佳启动子区域,对启动子5′端进行了一系列缺失,得到5种不同长度的启动子片段与gus 基因融合的植物表达载体.继而导入根癌农杆菌,采用叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi),并检测转基因植株的GUS活性.实验结果表明,自启动子5′端缺失至转译起始位点上游-287,-271时启动子活性分别是全长启动子的5倍,3倍.-271～-176元件对启动子在韧皮部的表达活性起重要作用.自-176缺失至-141时,启动子的活性降低至全长启动子的1/30～1/20,启动子在根中失去表达活性,但在叶、茎中仍有微弱的活性.对棉花曲叶病毒互补链基因启动子的功能区进行了分析比较,发现缺失负调控元件的启动子比全长启动子具有更强的活性,平均活性是CaMV 35S启动子的12倍,暗示该启动子具有巨大的应用潜力.研究结果也为进一步了解双生病毒基因表达调控机制及病毒-植物间的相互作用提供了新的线索.     

马铃薯Sgt1基因启动子的结构及功能分析

糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloids,SGAs)是一类存在于茄科和某些百合科植物的重要次生代谢物,与植物的抗逆性和产品品质有密切关系．茄啶半乳糖基转移酶（solanidine galactosyltransferases,SGT1）是SGAs合成代谢途径的末端关键酶之一,研究其编码基因的启动子序列对于SGAs生物合成代谢调控有重要的作用和意义．研究采用染色体步移技术(Genome walking),首次克隆到马铃薯Sgt1基因起始密码子上游2 183 bp的启动子序列,已注册到GenBank（注册号：KC759163）．构建该启动子驱动融合报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304Sgt1p,转化野生型烟草获得Sgt1p::gfp::gus转基因植株,通过GUS组织化学染色分析Sgt1p::gfp::gus转基因植株中Sgt1p启动子的活性．结果表明,gus基因在转基因烟草的根、茎和叶中均表达,在叶中Sgt1p启动子的活性低于CaMV35S启动子,而在根和茎中二者基本相同;光诱导结果显示,光照处理明显增强了Sgt1p::gfp::gus转基因烟草叶片中Sgt1p启动子的活性,表明庄薯3号马铃薯 Sgt1p启动子是一种光诱导型启动子．     

ocs/mas|一个受损伤和植物激素诱导的嵌合启动子的构建与功能分析

选择适宜的转录调控序列以提高启动子的转录效率,增强外源基因在转基因植株中的表达,对改良作物的抗病虫性具有重要意义。将甘露碱合成酶基因(mas)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)增强子杂合而成的嵌合启动子ocs/mas与GUS报告基因连接,构建了植物表达载体pOMS-GUS。对照载体pMAS-GUS仅携带mas启动子驱动的GUS基因。利用根癌农杆菌介导法,将以上植物表达载体分别转化烟草。应用半定量RT-PCR和GUS荧光定量分析法分别检测不同胁迫条件下启动子驱动的GUS基因表达量的变化。结果显示,未诱导处理的转基因植株GUS基因仅有微弱表达。伤害处理1h后,mas启动子驱动的GUS活性是未诱导处理的1.8倍,而嵌合启动子ocs/mas的诱导表达活性是未处理的5.7倍。植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)处理也诱导了较高水平的ocs/mas嵌合启动子活性;而且SA和MJ联合作用时呈现叠加效应,转基因烟草的GUS活性明显高于伤害处理后的GUS表达水平。以上结果表明,ocs/mas嵌合启动子是一种强诱导型启动子,可以接受多种刺激因子的诱导,从而为更有效地改良作物抗病虫的能力提供新的候选高效启动子元件。     

大豆诱导型启动子驱动类受体蛋白激酶GmSARK转基因植物分析

植物LRR型类受体蛋白激酶在植物生命活动中发挥着重要作用。前期研究发现,大豆（Glycine max）LRR型类受体蛋白激酶基因GmSARK可能参与调控大豆叶片的衰老过程。利用CaMV35S启动子驱动组成型过表达GmSARK基因可导致转基因植株出现致死表型,据此构建了可诱导型启动子GVG驱动GmSARK基因过表达的双元表达载体,转化野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）并获得了多株转基因植株。研究结果表明,外源施加诱导物地塞米松可引起GmSARK基因在转基因植株中过表达,并导致转基因植株出现叶片变黄下卷和生长受抑制等表型;外源细胞分裂素处理可以抑制GmSARK的表达,但是不能逆转GmSARK过表达所引起的上述变化。     

核基质结合区在番茄转基因表达调控中的应用

核基质结合区（matrix attachment region,MAR）的应用是提高植物基因转化和表达效率的有效方法之一。将烟草（Nicotiana tabacum）核基质结合区TM2构建在植物表达载体pBI121上报告基因GUSA表达盒和选择标记基因NPTII表达盒的两侧翼,利用农杆菌介导的子叶浸染转化番茄（Lycopersicon esculentum）。结果表明,MAR序列能够显著提高转基因植株的转化效率和转基因的表达水平。不同长度的CaMV35S启动子比较表明,TM2的调控活性依赖于启动子的存在,并且具有一定的功能重叠。热诱导型启动子的研究表明,TM2仅提高热诱导的表达强度,而不改变启动子的热诱导表达调控特性。TM2的表达调控特性符合转基因的表达要求,该MAR序列可广泛应用于各种植物的基因工程中。     

表达Harpin蛋白的转基因马铃薯降低晚疫病斑生长率

以苹果火疫病菌 (Erwiniaamylovora)的Harpin蛋白基因和马铃薯 prp1 1基因启动子为主要元件 ,探索了以利用病原侵染诱导植物过敏性反应为目标的抗病基因工程新策略 .通过构建Harpin蛋白基因的 3个植物表达载体和遗传转化 ,获得68个转基因马铃薯植株 .Southern ,Northern和Westernblot分析证明 ,Harpin蛋白基因实现了在转基因植株中的插入、转录和蛋白表达 ,用Phytophthorainfestans复合生理小种测定表明 ,Harpin蛋白在转基因植株中的组成型表达和病原侵染诱导表达均能降低病斑的扩展速率 ;在病原侵染诱导Harpin蛋白基因表达的转基因植株中 ,发现有 2个植株共 3 0个接种叶片上无菌丝形成 ,病斑局限于接种点内 ,表明过敏性反应的遗传操作在植物抗真菌病基因工程中具有广阔的应用前景 .     

Harpin_(Xoo)及其功能域片段启动病原物诱导性启动子在转基因拟南芥中的活性(英文)

从烟草(Mcotiana tabacum L.)中克隆了3个病原物诱导性启动子PPP1、PPP2和PPP3,它们都含受细菌诱导的反应元件PPP1和PPP2,另外含有受生物激发子及水杨酸(SA)诱导的元件;PPP1内部还含串联重复的两段111bp的序列,而在PPP2中,这个重复序列中的一个111 bp的片段被定点删除。分别构建了含这三个启动子及花椰菜花叶病毒35S启动子的转化单元,用它们分别转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),获得了转基因植株。PCR证明,几个启动子和所带的gus基因(uidA)已经整合到拟南芥基因组中。用青枯病菌接种转基因第二代植株,组织染色表明三个PPP启动子在拟南芥中都可以受青枯病菌诱导,说明克隆的PPP启动子是有活性的。随后分别用SA、来自水稻白叶枯病菌的蛋白质激发子halpinXoo以及hatpinXoo的3个具有不同功能的片段DEG(促进生长)、DIR(诱导抗虫)、DPR(诱导抗病)喷雾处理转基因植株,通过GUS的荧光定量分析,检测了启动子的活性。结果显示,青枯病菌诱导的PPP1、PPP2和PPP3活性分别为35S启动子活性的53、39和25倍。PPP1和PPP2可以受SA、harpinXoo、DEG、DIR和DPR的诱导,而PPP3则不能。这些结果说明了有关元件的可能作用。另外,PPP1的活性比PPP2高3倍,表明111bp的重复序列可以影响启动子活性水平。     

獐茅HAK基因表达调控区的分离及其在水稻中的功能分析

獐茅高亲和性K+转运蛋白基因(AlHAK1)是从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆,对于细胞营养和离子渗透调节起关键作用。为了进一步了解AlHAK1基因的表达调控机制,文章采用基因组步移法分离了AlHAK1基因转录起始位点上游长度约1.3 kb的启动子区域。启动子顺式元件分析显示该序列具有典型的TATA和CAAT盒,以及一些与植物生长发育和环境响应相关的顺式元件。为了明确AlHAK1启动子的功能,将其与GUS基因融合构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,通过农杆菌介导转化法导入水稻中。对转基因植株进行GUS组织化学染色,结果显示在转化AlHAK1启动子水稻的根、茎、叶、花药和内外稃部位均检测到GUS活性。GUS荧光定量分析显示AlHAK1启动子调节GUS表达活性低于组成型启动子CaMV35S和Ubiquitin,但其根部和茎部的GUS活性相对较高。对转化植株进行不同胁迫处理后检测GUS活性,结果表明受到ABA、干旱、高温的诱导后其茎部和根部GUS活性有所提高,推测位于该启动子-682 bp的HSE元件和-1 268 bp的MybBS元件可能在高温、ABA和干旱诱导的表达调控中起作用。     

甘蔗茎杆特异表达基因启动子的克隆及初步分析

甘蔗茎秆是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官,构建能在甘蔗茎秆中高水平表达异源蛋白质的表达载体是非常有意义的。而一个高效表达的载体,启动子则是其最重要元件之一,因此,茎秆特异性启动子的获得是甘蔗作为生物反应器的前提。利用染色体步移法克隆到甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a 5′端上游的一段长1968bp的序列（ Ppst2a ）,经序列测定及软件分析表明,该序列具有典型的启动子结构。此序列置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV 35S启动子,构建植物表达载体,命名为pCAMBIA1900,该启动子下游为gus基因。利用基因枪法转化甘蔗的茎和叶,对gus基因的瞬时表达进行测定,结果表明所获得的己糖转运蛋白基因启动子只在甘蔗茎中驱动gus基因瞬时表达,该启动子具有茎秆特异性。     

人工合成启动子SAR在拟南芥中的表达分析

利用植物防御基因中的病原诱导响应元件和最小35S启动子(-62～+1),人工合成了启动子SAP,并以GUS基因为报告基因,在转基因拟南芥中分析了合成启动子的表达特性.通过对转基因拟南芥GUS组织染色的分析表明:SAR启动子在子叶、毛刺、根茎交接处和根系中优势表达,在老叶中的表达量高于幼叶,说明SAR启动子具有组织和发育表达特异性.     

病原物诱导型植物启动子的研究方法

植物启动子是控制基因转录的DNA序列之一,按其表达方法可分为组成型(或非特异性)表达和诱导型(或特异性)表达启动子两种类型.当受到病原物侵染时,植物通常通过诱导型启动子中的W-box、RAV1 AAT和WRKY等元件/位点、调控下游基因的表达,作出相应的应答反应.近年来,通过计算机预测与试验测定方法的有效结合,发掘和鉴定出了一些病原物诱导型启动子,并进行了调控功能的解析.此外,在通过转基因方法改良植物抗病性的途径中,利用病原物诱导型启动子可以实现对抗病功能相关基因表达的精准控制,避免由组成型启动子持续驱动基因表达、对植株本身带来的负效应.结合本室对水稻启动子OsBTF3-p的研究结果,重点对近年来国内外有关病原物诱导型启动子及其调控元件/位点的研究方法和应用进展作一综述.     

Pib启动子中茉莉酸和乙烯响应元件的转基因分析

水稻Pib基因的表达受茉莉酸、乙烯等激素诱导, 为了确定该基因启动子响应茉莉酸和乙烯诱导的必需区域, 进一步阐明茉莉酸和乙烯响应分子元件, 文章用PCR制备了Pib全长启动子-3 572~2 bp及3个5′端有不同长度缺失的Pib启动子片段-2 692~2 bp、-1 335~2 bp、-761~2 bp。4个不同长度Pib启动子分别置换掉双元质粒中gus基因上游的35S构建为重组质粒, 经农杆菌介导转入水稻获得转基因植株。转基因水稻中gus活性的蛋白质水平和mRNA水平的定性和定量分析结果表明, 全长Pib启动子(-3 572~2 bp, pNAR901)启动活性最强, 茉莉酸或乙烯诱导6 h后, 其驱动gus基因在转基因植株各部组织中的表达量明显上升。而-3 572~-2 692 bp区段序列缺失后不但Pib启动子启动活性显著降低而且也丧失了对茉莉酸和乙烯的诱导活性。pNAR902(-2 692~2 bp),pNAR903(-1 335~2 bp)和pNAR904(-761~2 bp)中的Pib启动子序列的缺失长度相差达2倍和3倍以上, 但其对茉莉酸和乙烯的诱导响应没有区别。这些结果显示3个Pib启动子缺失体构建中, 其共同缺失序列即-3 572~-2 692 bp区域是Pib启动子茉莉酸和乙烯诱导响应的必需区域。软件检索证实, Pib启动子序列中只在上述共同缺失区段之内的-2 722 bp处有一个GCCGCC基序。文章报道的转基因实验表明GCCGCC基序可能是Pib基因中有关茉莉酸和乙烯诱导响应的顺式分子元件。     

TaNHX2基因植物表达载体的构建及在拟南芥中的功能分析

将TaNHX2基因重组于质粒pBIN438的CaMV 35S启动子下游,构建含TaNHX2基因的植物双元表达载体pBIN438-TaNHX2。采用根癌农杆菌介导的真空渗透法转化拟南芥,得到T0代转基因拟南芥种子。经含Kan的平板筛选及PCR鉴定,获得54株阳性植株,选取生长一致的转基因阳性植株进行耐盐、耐旱分析,结果表明TaNHX2能够提高转基因植株的耐盐性和耐旱性。     

烟草tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响

烟草DNA结合蛋白TGA1a可特异地作用于CaMV35S增强子的激活序列as-1(-83~-63), 并表现为转录激活功能. 为了研究tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响, 将它置于维管束特异性启动子rolC下游, 并与CaMV35S启动子控制的报道基因串联成一种反式调控系统, 构建了植物表达载体, 同时, 以CaMV35S和rolC分别控制的报道基因构建植物表达载体为阳性对照. 通过农杆菌介导方法转化烟草和分子鉴定, 证明报道基因存在于转化烟草基因组中, 分别测定了不同转基因单株的GUS活性, 结果表明: rolC控制下的tga1a的表达显著增强了CaMV35S控制下的报道基因表达, 其GUS活性明显高于CaMV35S或rolC单独调控报道基因的转化植株, 单株的最高GUS活性达到两个阳性对照的10倍以上. 组织化学定位证实该串联系统使GUS蛋白主要集中在维管束组织. 这一研究结果为提高外源基因在转基因植株中的表达水平和外源基因的组织特异性表达创立了一个新模式.     

pib基因启动子及其诱导启动性初探

将pib基因上游5.7 kb区段取代pCAMBIA1301中gus基因上游的35S启动子构建了pib拟启动区-GUS+ 35S-hpt 基因表达载体pNAR604。经农杆菌介导转化水稻成熟胚愈伤,获得了转基因抗潮霉素愈伤和36株转基因水稻植株。 转基因抗性愈伤和转基因植株根的组织化学GUS活性检测表明,光照培养下的抗性愈伤和转基因植株根不能使X-gluc显色,而暗处理24 h后的抗性愈伤和定植后转基因植株的根能使X-gluc显色。转基因植株GUS荧光定量分析结果表明,GUS表达具有器官特异性,黑暗处理前根的GUS活性最高、茎次之,分别是是叶片的7倍和3倍,叶片中仅有痕量本底。24 h黑暗处理后根、茎、叶中GUS活性都有增加,且叶片中的增加比例最大,其活性仅次于根。5 mmol/L水杨酸和0.3 mol/L NaCl叶面喷施转基因植株24 h后叶片中GUS活性分别为处理前的2.7和3.6倍。初步确定pib拟启动区是一个诱导型启动子。黑暗、水杨酸和NaCl能诱导该启动子启动活性。     

大麦β-1，3-葡聚糖酶基因（GIII）启动子在转基因水稻中的诱导表达

将大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因(GIII)启动子(PGIII)与其报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过衣杆菌介导法转化水稻。PCR、DNA印迹法结果显示,构建的pGIII-gus表达载体已整合到水稻基因组DNA中。GUS组织化学染色、RNA印迹法及荧光法结果显示,该启动子驱动的gus在水稻叶片中为低水平表达;而用水扬酸(SA)与稻瘟菌来源的激发子处理,可诱导gus的高水平表达。T1代种子的GUS组织化学染色结果也表明,SA与激发子可以诱导高水平的PGIII活性。这些结果表明PGIII是一种强诱导型启动子,并可能是一种病原菌诱导型的启动子。     

大麦β-1,3-葡聚糖酶基因(GⅢ)启动子在转基因水稻中的诱导表达

将大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因(GⅢ)启动子(PGⅢ)与其报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻.PCR、DNA印迹法结果显示,构建的pGⅢ-gus表达载体已整合到水稻基因组DNA中.GUS组织化学染色、RNA印迹法及荧光法结果显示,该启动子驱动的gus在水稻叶片中为低水平表达;而用水扬酸(SA)与稻瘟菌来源的激发子处理,可诱导gus的高水平表达.T1代种子的GUS组织化学染色结果也表明,SA与激发子可以诱导高水平的PGⅢ活性.这些结果表明PGⅢ是一种强诱导型启动子,并可能是一种病原菌诱导型的启动子.     

根癌农杆菌介导的乙肝表面抗原基因对烟草的转化

构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于农杆菌的转化;通过冻融法将重组质粒pBRSAg转入根癌农杆菌LBA4404中,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,经筛选培养获得烟草植株。抗性植株经GUS染色和PCR检测为阳性,初步表明乙肝表面抗原基因在烟草中得到表达。     

不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性的研究

以pBI121为出发质粒, 利用烟草泛素启动子Ubi.U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,通过叶盘转化法转化烟草叶片, 检测瞬时表达活性, 研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明: CaMV35S启动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍; 双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当; 烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序列的1.5倍; Ubi.U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高, 其表达效率是双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍, 为CaMV35S独立作用时的10倍。