过量表达棉花CBF2基因提高转基因拟南芥抗旱耐盐能力

CBF/DREB是一类植物中特有的转录因子,在植物抵抗逆境胁迫过程中发挥重要功能。本研究从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)Coker 312中克隆获得1个棉花CBF/DREB基因,命名为Gh CBF2,该基因编码一个由216个氨基酸组成的CBF蛋白。序列分析结果显示,Gh CBF2与其他植物的CBF蛋白类似,含有AP2转录因子典型的保守结构域。干旱或高盐胁迫处理明显增加了Gh CBF2基因的表达量。亚细胞定位分析结果发现Gh CBF2定位在细胞核中。将Gh CBF2基因构建到由35S启动子调控的植物表达载体p MD上并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),结果表明,在干旱和盐胁迫条件下,过量表达Gh CBF2基因拟南芥的成活率显著高于野生型,并且游离脯氨酸和可溶性糖含量也高于野生型,说明转Gh CBF2基因提高了拟南芥的耐盐抗旱能力。采用实时荧光定量PCR方法分析胁迫相关标记基因COR15A、RD29A和ERD6的表达情况,结果显示转基因株系中的表达量显著高于野生型,说明Gh CBF2参与调控拟南芥干旱和盐胁迫相关基因的表达。     

海岛棉GbCBF6基因克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

该研究根据棉花生物信息数据库,采用PCR方法从棉花(Gossypium barbadense L.)中克隆了1个CBF/DREB转录因子基因,命名为GbCBF6(GenBank登录号为KR233255)。GbCBF6基因开放阅读框为753bp,编码251个氨基酸,预测分子量为27.82kD,等电点为7.68。氨基酸多重序列比对结果表明,GbCBF6基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的同源性,含有1个AP2功能结构域和2个特征序列基序;与棉花已经克隆的4个GhCBF基因的氨基酸序列差异较大,是1个新的棉花CBF基因。系统进化树分析表明,GbCBF6基因属于DREB亚家族中的A-1亚组。RT-PCR分析表明,GbCBF6基因表达受干旱胁迫下调,而受4℃低温上调,在高盐(200mmol/L NaCl)处理下其表达量先下降,后增加。推测GbCBF6基因在棉花非生物胁迫的调控中起重要作用。     

棉花中一个类DREB1/CBF基因(GhDREB1L)的分子克隆及其功能分析

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界环境胁迫上起到非常重要的作用, 而且对于利用基因工程技术来提高植物的抗逆性也非常有用. 从棉花中分离出一个编码DREB1/CBF类蛋白(GhDREB1L)的cDNA, 并对该蛋白质的序列特性、DNA结合特性及转录本的表达特征进行了分析. GhDREB1L含有一个保守的AP2/ERF结构域, 其氨基酸序列与其他植物中DREB家族的DREB1/CBF组成员高度相似. 采用Ni-NTA亲和层析技术, 成功纯化了在BL21 (DE3)菌株中表达的GhDREB1L蛋白的DNA结合区. 凝胶滞留实验揭示, 纯化的GhDREB1L融合蛋白能够特异性地与已经得到鉴定的DRE元件(核心区, ACCGAC)以及胚胎发育晚期丰富蛋白基因LEA D113启动子区中的类DRE元件(核心区, GCCGAC)结合. 半定量RT-PCR显示GhDREB1L基因在棉花子叶中受到低温、干旱以及NaCl处理的诱导. 这些结果暗示了棉花GhDREB1L转录因子可能是通过与DRE元件的结合, 在低温、干旱及高盐的应答途径中起重要作用.     

拟南芥转录因子CBF的冷调控机制研究进展

拟南芥中CBF(C-repeat binding factor)转录因子在抗寒性方面起重要作用,低温可诱导CBF转录因子的表达。CBF转录因子能够特异结合启动子中含有CRT/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)的顺式元件,激活COR等基因的表达,从而增强植株抗寒能力,对调控逆境诱导基因的表达具有非常重要的作用。对CBF转录因子的结构特点、功能、表达调控以及与CBF相关的其它低温调节途径进行了综述,为提高植物综合抗逆性的研究提供参考。     

梅花CBF转录因子的克隆及表达

根据GenBank中与梅花同属的桃、甜樱桃等已发表CBFs转录因子序列设计简并引物,采用PCR和RT-PCR方法,从梅花基因组DNA和cDNA中克隆CBF转录因子片段。结果表明,两种途径获得的CBF基因序列一致,基因全长821bp,编码238个氨基酸,其氨基酸序列具有典型的CBF蛋白特征,包含保守的AP2/EREB DNA结合结构域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR)。氨基酸相似性分析结果表明,该基因与欧洲甜樱桃、矮扁桃等CBF转录因子相似性较高。相对荧光定量PCR结果显示,4℃低温胁迫下,其表达量符合CBF转录因子表达特点,随着胁迫时间的增长表达量呈上升趋势,8h时达峰值,说明该基因在低温胁迫下上调表达。     

& 转录因子CBF在植物抗寒中的重要作用

低温能够诱导植物许多基因的表达,从而使植物具有抗寒性,这种现象称为冷驯化。对于植物冷驯化的分子机理,目前研究的最多的是CBF转录因子调控的信号转导途径,其作用途径可归纳为：CBF(C-repeat Binding Factor)转录因子→CRT/DRE(C-repeat /Dehydration Responsive Element)基序→COR基因表达→植物抗寒性增加。研究CBF转录因子在抗寒中的作用机制,能为提高植物的抗寒性,培育抗寒作物品种提供新方向。      

植物低温诱导转录因子CBF研究进展

植物在低温驯化过程中能诱导许多基因的表达。其中CBF转录因子是目前植物抗寒分子生物学领域研究的热点之一。它通过与低温诱导基因启动子区域中的CRT/DRE调控元件结合,调控一系列低温诱导基因的表达,从而提高植物的抗寒性。对植物低温诱导CBF转录因子的结构、功能及其表达调控等方面的研究进展进行了综述。     

植物冷驯化相关信号机制

植物经过非致死温度的处理可以获得更强的抗冷能力叫做冷驯化,主要包括寒驯化和冻驯化 .在冷驯化过程中,质膜首先感受冷信号,调节胞质中IP3的含量,诱导胞质Ca2+浓度的升高,从而激活CBF基因的表达.至今已经克隆了大量的冷调控基因,组成了复杂的信号传导网络,其中ICE1-CBF-COR通路在植物的冷驯化过程中起到重要的作用.ICE1基因编码一个MYB类型的碱性螺旋 环-螺旋（bHLH）转录因子,在上游调节CBF和 其它转录因子的表达,提高抗冷性. HOS1蛋白通过泛素化介导的蛋白降解负调控ICE1,另外,CBF还通过转录的自我调控保持恰当的表达水平.基因的分析研究证明,RNA修饰和核质转运在植物的抗冷过程中也具有重要作用.在不依赖于CBF的途径中,转录因子HOS9和HOS10在调节抗冷有关基因的表达和提高抗冷能力方面具有至关重要的作用.     

中国樱桃CBF/DREB转录因子PpcCBF的克隆与表达分析

低温诱导中国樱桃(Prunus pseudocerasus)花芽休眠解除是一个非常复杂的过程。研究花芽响应低温的分子生物学机制将是揭示这一问题的关键。CBF/DREB转录因子在植物低温响应过程中发挥着重要作用。为此,本研究从"短柄"樱桃中克隆了一个CBF/DREB转录因子,命名为PpcC BF。生物信息学分析表明,Ppc CBF基因的开放阅读框为720 bp,编码239个氨基酸。Ppc CBF具有典型的CBF/DREB转录因子的结构特征,AP2结合域高度保守,聚类分析发现李属植物CBF/DREB转录因子亲缘关系较近。实时定量表达分析发现,Ppc CBF受低温诱导表达,且不依赖ABA。在花芽休眠解除过程中,随着低温积累而表达上调,休眠解除临界期之后下调表达,与花芽休眠解除具有极大相关性。     

过表达秋茄C2H2型锌指蛋白基因KcZFP提高烟草耐盐性

基因转录调节是植物对非生物胁迫适应机制的一个重要方面,转录调节因子在胁迫信号转导途径中调节下游基因的表达,在建立植物对胁迫适应性过程中起到重要作用.锌指蛋白是功能多样的转录调节因子蛋白家族,家族成员在植物响应非生物胁迫方面扮演着重要角色.本研究以秋茄C2H2型锌指蛋白编码基因KcZFP为目的基因,在烟草中过表达KcZFP,分析C2H2型锌指蛋白在植物耐盐性中的作用.研究结果显示:转基因株系中,KcZFP表达量显著提高.过表达KcZFP的烟草植株的耐盐性明显提高,在200 mmol/L NaCl处理的条件下,KcZFP过表达烟草中脯氨酸水平远高于野生型植株.对光合作用参数比较分析显示,在KcZFP过表达植株中净光合速率受盐胁迫的影响小于野生型植株,光合系统在一定程度上得到了保护.研究结果说明KcZFP作为转录调节因子参与了植物的渗透调节,对植物的耐盐性具有贡献.     

拟南芥中CBF对COR基因表达的调控

拟南芥中COR基因的启动子含有CRT／DRE元件,转录激活因子CBF蛋白与之结合,促进COR基因的表达,CBF基因超表达不需要低温刺激就能促进COR基因的表达而增加植物的抗寒性,显示其调节COR基因表达的能力,作者对CBF基因和CBF蛋白的特性,CBF基因表达与植物抗寒性之间的关系以及CBF调节COR基因表达的机理进行了介绍。     

低温胁迫下拟南芥CBF1超表达突变体胞质中Ca^2＋浓度的变化

低温严重影响植物的生长,低温刺激可引起植物细胞中Ca^2＋浓度迅速升高。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1超表达突变体为材料,研究了低温处理时CBF1基因的表达情况及胞质Ca^2＋的浓度变化。结果表明,CBF1本身可受低温诱导。同时将水母发光蛋白基因转入该拟南芥突变体中并检测Ca^2＋的浓度变化,发现低温刺激时突变体细胞质中Ca^2＋的浓度变化幅度明显高于野生型,但液泡的胞质而两侧Ca^2＋的浓度变化相似。用EGTA和LaCl3处理拟南芥后,胞质Ca^2＋的浓度升高被抑制,并且CBF1突变体及对照胞质中的Ca^2＋浓度下降到同一水平。上述结果表明,Ca^2＋参与了CBF1应答低温信号的转导过程,并且CBF1超表达突变体可能是通过提高胞质Ca^2＋浓度来提高植物的抗低温胁迫能力。     

茶树CBF1基因密码子使用特性分析

转录因子CBF(C-repeat-binding factor)广泛存在于各种植物中, 是植物抗逆过程中一个重要的调节因子。文章运用CHIPS、CUSP和CodonW在线程序对茶树(Camellia sinensis)CBF1基因(CsCBF1)序列进行分析, 并与茶树基因、模式植物基因组和其他植物CBF基因进行比较, 对了解CsCBF1基因密码子使用特性, 并为其选择合适的表达系统具有重要意义。结果表明：CsCBF1基因与70个茶树基因对密码子的使用有明显的差异, CsCBF1基因偏好使用以G/C结尾的密码子, 而筛选的70个茶树基因偏好使用以A/T结尾的密码子。在密码子使用频率上, CsCBF1基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tobacum)的差异小于与小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)的差异; 因此, 拟南芥、烟草更适合作为CsCBF1基因的外源表达宿主。通过分析40种植物CBF基因编码特点可知大部分CBF基因偏好使用以G/C结尾的密码子, 这可能与基因的特殊功能有关。     

拟南芥中CBF对COR基因表达的调控1

拟南芥中COR基因的启动子含有CRT/DRE元件,转录激活因子CBF蛋白与之结合,促进COR基因的表达.CBF基因超表达不需要低温刺激就能促进COR基因的表达而增加植物的抗寒性,显示其调节COR基因表达的能力.作者对CBF基因和CBF蛋白的特性、CBF基因表达与植物抗寒性之间的关系以及CBF调节COR基因表达的机理进行了介绍.     

山葡萄CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响

为了研究山葡萄CBF基因调节植物对盐胁迫的应答机理,分别构建了山葡萄Va CBF1、Va CBF2和Va CBF3的植物过表达载体。经酶切及琼脂糖电泳检测证实3个基因均插入到p BASTA中,表明表达载体构建成功。然后,分别将3个植物过表达载体转入农杆菌EHA105中,并通过浸花法浸染拟南芥。利用除草剂筛选获得3个基因的拟南芥过表达株系。最后,对野生型拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理,发现OE-CBF2转基因植株的主根伸长长度显著长于其它植株,3个转基因株系的侧根长度也明显长于野生型植株。上述结果表明山葡萄CBF基因可能在植物盐胁迫中对根部生长发育起到非常重要的调控作用。     

低温胁迫下拟南芥CBF1 超表达突变体胞质中Ca2+ 浓度的变化

低温严重影响植物的生长, 低温刺激可引起植物细胞中Ca²⁺浓度迅速升高。以拟南芥(Arabidopsis thaliana) CBF1 超表达突变体为材料, 研究了低温处理时CBF1基因的表达情况及胞质Ca²⁺的浓度变化。结果表明, CBF1本身可受低温诱导。同时将水母发光蛋白基因转入该拟南芥突变体中并检测Ca²⁺的浓度变化, 发现低温刺激时突变体细胞质中Ca²⁺的浓度变化幅度明显高于野生型, 但液泡的胞质面两侧Ca²⁺的浓度变化相似。用EGTA和LaCl₃处理拟南芥后, 胞质Ca²⁺的浓度升高被抑制, 并且CBF1突变体及对照胞质中的Ca²⁺浓度下降到同一水平。上述结果表明, Ca²⁺参与了CBF1应答低温信号的转导过程, 并且CBF1超表达突变体可能是通过提高胞质Ca²⁺浓度来提高植物的抗低温胁迫能力。     

沙冬青CBF/DREB1转录因子cDNA的克隆及序列分析

CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration resistance element binding protein 1)是一类抗逆相关的转录因子,它们的表达可以激活下游一系列抗逆应答基因的表达,从而提高植株的抗逆性.沙冬青(A mmopiptanthus mongolicus)主要生长在中国西北荒漠和半荒漠地带,是典型的旱生资源植物,具有突出的抗寒、抗旱、耐盐碱特性.本文以沙冬青为实验材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列,并对其进行了序列分析.结果表明:沙冬青CBF/DREB1转录因子基因序列全长为991 bp,包括624 bp的开放阅读框(ORF),起始密码子ATG,终止密码子TAA,114 bp的5UTR和253 bp的3UTR,以及加尾信号AATAAA及poly(A)_(11).生物信息学预测其演绎的氨基酸序列具有AP2结构域,且AP2结构域的两端拥有CBF家族特有的PKK/PPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段短多肽序列,属于CBF家族.沙冬青CBF/DREB1转录因子的克隆为进一步研究植物抗逆和获得抗性基因提供了新的候选基因,也为进一步从分子水平上验证其功能,深入理解植物适应干旱、低温和高盐机制奠定基础.     

扁桃CBF1转录因子的克隆及原核表达分析

为了探明CBF转录因子在扁桃中的抗寒分子机理,以新疆栽培扁桃‘矮丰’叶片为材料,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1转录因子,命名为AF-Pd CBF1,Gen Bank登录号为KM245570。序列分析表明,该基因开放阅读框为729bp,编码242个氨基酸,推测蛋白质分子量为27.405 k D,并且该蛋白没有信号肽。进化树分析表明,AF-Pd CBF1与甜樱桃和中国梅的亲缘关系最近。将该基因片段连接到原核表达载体p ET-32a(+)中,构建融合表达质粒p ET-Pd CBF1,转化到E.coli Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期大小一致,分子量大小约为47.8 k D。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白p ET-Pd CBF1在IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4 h时,其表达量最佳。试验结果可为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定基础。     

拟南芥CBF1与植物对低温和干旱的抗性

对冷驯化过程中基因表达差异的认识,使抗冻基因(COR)的克隆及其功能的分析成为研究冷驯化过程的主要目标。在拟南芥和其他抗冻植物中,分离了许多COR基因,这些基因对植物抗冻起着非常重要的作用。在拟南芥COR调控的研究中,发现了CBF转录因子的基因家族,其中CBF1能调控一组COR基因的表达。近年来,在冷敏植物如番茄和玉米中也发现了CBF类似基因,拟南芥CBF1基因在转基因番茄中的过量表达提高了植株的抗寒和抗旱性。这一研究结果展示了拟南芥CBF1类似基因的应用可能为冷敏植物抗寒和抗旱性的品种改良提供一条新的途径。