巴西橡胶树HbCMT1的克隆与表达分析

通过PCR和RACE技术克隆获得了巴西橡胶树染色质甲基化酶(CMT,chromomethylase)基因(Hb CMT1)。Hb CMT1全长2697 bp,含有2556 bp的阅读框,编码851个氨基酸。推测Hb CMT1分子量为95.67 k D,等电点为5.38,氨基酸序列与可可、烟草、葡萄、黄瓜、鹰嘴豆和拟南芥等CMT家族成员的同源性分别为66%、51%、50%、56%、53%和50%。定量PCR分析表明Hb CMT1在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在叶中表达量最高,在胶乳中表达量最低。此外Hb CMT1在橡胶树自根幼态无性系胶乳中的表达量比老态无性系胶乳中的低。     

巴西橡胶树HbAIH基因的克隆及表达分析

鲱精胺亚胺水解酶(Agmatine iminohydrolase,AIH)是植物通过精氨酸途径合成多胺过程中的重要酶之一。本研究首次从巴西橡胶树中克隆了AIH基因HbAIH。序列分析结果表明HbAIH全长1 462 bp,开放阅读框长为1 137 bp,编码378个氨基酸。预测 HbAIH 蛋白的分子量是42.28 kD,等电点为5.09,是一个亲水性蛋白。氨基酸相似性比对结果表明HbAIH与大戟科木薯MeAIH、蓖麻RcAIH和麻风树JcAIH等具有很高相似性,且含有植物AIH中高度保守的与酶活性位点形成和参与底物结合的11个氨基酸位点。qRT-PCR 分析表明,HbAIH表达无组织特异性,在雌花中表达量最高,树皮、茎尖、胶乳、叶片和雄花中表达量依次降低。HbAIH在不同发育时期叶片中的表达存在变化,稳定期表达量最低,淡绿期最高,说明HbAIH可能参与橡胶树叶片发育过程。此外,低温、干旱、高盐、过氧化氢、乙烯利、茉莉酸甲酯处理以及橡胶树死皮的发生均能引起HbAIH表达变化。这些结果说明HbAIH可能参与了橡胶树生长发育、产排胶调控及逆境应答过程。     

巴西橡胶树HbCMK基因的克隆及表达

根据植物CMK(4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol Kinase,CMK)的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的CMK基因,命名为HbCMK.序列分析表明HbCMK长1 415 bp,编码388个氨基酸,该氨基酸序列与长春花(Catharanthus roseus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜菊(Stevia rebaudiana)、丹参(Salvia miltiorrhiza)、烟草(Nicotiana benthamiana)和水稻(Oryza sativa)的CMK相似性分别达到72.6%、72.5%、71.9%、70.9%、69.0%和66.9%.半定量RT-PCR结果显示,HbCMK的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达,乙烯诱导胶乳HbCMK的表达,伤害对HbCMK的表达几乎没有影响.本实验结果为进一步了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和天然橡胶生物合成的调控奠定了基础.     

巴西橡胶树HbPEPRK1的克隆和表达分析

根据先前获得的EST序列,从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了一个编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶相关激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase-related kinase,PEPRK)的基因HbPEPRK1。HbPEPRK1编码区c DNA长度为1 401 bp,编码466个氨基酸。HbPEPRK1蛋白具有典型的的丝/苏蛋白激酶结构特征的结构特征,和其他植物中的类似蛋白具有很高的同源性。对HbPEPRK1启动子区域进行分析,发现含有众多应答激素和环境胁迫信号元件。实时荧光定量分析结果表明,HbPEPRK1在所检测的组织中均有表达,其中在胶乳的表达量显著高于其他组织;乙烯刺激后HbPEPRK1在胶乳中的表达量明显增加。     

巴西橡胶树HbCRK1的克隆及表达分析

钙离子依赖蛋白激酶相关激酶(CDPK-related kinase, CRK)在植物对生物和非生物胁迫抗性中具有重要作用。为了揭示CRK家族成员在橡胶树抗逆机制中的作用,本研究从巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆了一个CRK基因,其推导氨基酸含有特征性STKc_CAMK结构域,命名为HbCRK1。该基因在树皮、花、叶片和胶乳中均有表达,在叶片中的表达量最高;在干旱、机械伤害、白粉菌侵染和激素处理下均显著上调。本研究结果表明HbCRK1受逆境反应诱导,参与橡胶树抗逆响应的生理和分子机制,为揭示HbCRK1基因的功能和橡胶树抗逆响应的研究提供理论指导。     

巴西橡胶树HbCMT的克隆与表达分析

通过PCR和RACE技术克隆了巴西橡胶树中一个染色质甲基化酶(Chromomethylase, CMT)基因（HbCMT）。HbCMT长2697 bp,含有2556 bp的阅读框,编码851个氨基酸。推测HbCMT分子量为95.67 KD,等电点为5.38,氨基酸序列与可可、葡萄、黄瓜、鹰嘴豆、番茄、拟南芥CMT家族成员的同源性分别为77％、74％、72%、67%、64%和52%。定量PCR分析表明HbCMT在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低,此外HbCMT在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。     

巴西橡胶树HbMKK4基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MKK)基因HbMKK4。该基因全长cDNA序列1 580bp,编码框1 059bp,编码352个氨基酸,含有S_TKc结构域,其编码蛋白的分子量为38.83kD,理论等电点为9.36。实时荧光定量PCR结果显示,HbMKK4在橡胶树的根、树皮、胶乳及叶片中均有表达。割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中HbMKK4基因的表达,基因相对表达量分别在割胶后2h、茉莉酸甲酯处理8h和乙烯利处理4h后达到最高。研究结果推测HbMKK4可能通过MAPK信号途径参与茉莉酸信号途径的响应,可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用。     

巴西橡胶树HbNTL1基因启动子的克隆与序列分析

膜结合NAC转录因子(NTLs)是植物NAC转录因子家族中一类C端具有跨膜结构域(transmembrane motifs,TMs)的转录调控因子,在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中具有重要的功能。根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)膜结合类NAC转录因子HbNTL1基因cDNA序列,利用基因组步移的方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbNTL1基因上游1 718 bp的调控片段。序列分析表明,该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点A位于起始密码子上游206 bp处。该启动子序列除了含有多个TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还存在赤霉素、茉莉酸和脱落酸等激素响应元件以及大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box和MYCCONSENSUSATHSE等反应元件,表明HbNTL1转录因子可能是一个逆境胁迫相关NAC转录因子,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要功能。     

巴西橡胶树HbNAC1基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,利用RACE技术从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了1个NAC类转录因子基因HbNAC1,其cDNA全长为1419 bp,含有完整的开放阅读框,编码309个氨基酸。推导的氨基酸序列含有1个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的相应氨基酸序列的同源性分别达79%、80%、57%和60%。聚类分析表明,HbNAC1属于NAC家族Ⅱ亚族。半定量RT-PCR分析表明,该基因在胶乳中的表达较丰富,经乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量明显增加。     

橡胶树DELLA基因HbRGL1的克隆与表达分析

DELLA蛋白属于植物特异性GRAS家族,是植物生长的负调控因子。为揭示橡胶树DELLA基因在橡胶树生长发育中的分子调控机制,本研究从橡胶树热研7-33-97中克隆HbRGL1的cDNA全长序列,含1 851 bp的ORF,编码616个氨基酸。生物信息学分析表明HbRGL1属于不稳定的亲水蛋白,定位在细胞核上,含有DELLA和GRAS保守结构域。系统进化关系分析表明HbRGL1与橡胶树HbGAIL、木薯MeGAIL、蓖麻RcGAI、麻风树JcGAI聚为一类。qRT-PCR分析表明HbRGL1在橡胶树不同组织中的表达量差异显著,在花中的表达量最高。在生长素（IAA）、乙烯利（ET）和脱落酸（ABA）等不同激素处理叶片中HbRGL1表达量均呈现显著上调趋势,尤其对赤霉素（GA3）的应答具有反应快速且上调表达倍数最高。本研究为进一步阐明HbRGL1在橡胶树生长发育中的功能奠定理论基础。     

巴西橡胶树 HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5’调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

巴西橡胶树HbMYB62转录因子基因的克隆和表达分析

R2R3-MYB类转录因子参与包括逆境胁迫反应等多种生物反应。为鉴定橡胶树中MYB转录因子的结构与功能,从橡胶树叶片中克隆HbMYB62全长的cDNA序列。该基因片段大小为1 013 bp,包含945 bp的ORF,编码314个氨基酸残基。其推导的氨基酸序列具有植物HTH_MYB的特异性结构域,并与拟南芥AtMYB62具有高度相似性。qRT-PCR发现HbMYB62主要在橡胶树花中表达,而在树皮、叶和乳胶中表达量较少。其叶片表达量在过氧化氢（H₂O₂）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）等处理下显著上调。表明HbMYB62与橡胶树的抗逆反应和激素信号传导过程有关,为进一步研究其结构和功能打下基础。     

巴西橡胶树HbHEV3基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,通过RT-PCR获得了一个编码橡胶素前体的基因,命名为HbHEV3。HbHEV3编码区cDNA长度为630bp,编码209个氨基酸。预测的HbHEV3蛋白包含1个信号肽,1个具有几丁质结合特性的Hevein结构域和1个Barwinn结构域,HbHEV3与橡胶树及其他植物中类似蛋白具有很高的同源性。分离获得了HbHEV3起始密码子上游1 050bp的启动子序列,该序列含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量PCR分析结果表明,HbHEV3在所检测的组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高,乙烯诱导能显著上调胶乳中HbHEV3的表达。研究表明,HbHEV3可能参与了橡胶树乙烯介导的防御反应,并在橡胶凝集过程中具有重要功能。     

巴西橡胶树 HbERFB4-1 基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,利用RACE技术分离了巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的1个AP2/ERF类基因,命名为HbERFB4-1。该基因cDNA全长732 bp,含有完整的开放阅读框架,编码147个氨基酸,不含内含子。推导的HbERFB4-1氨基酸序列与杨树(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆(Glycine max)中相应蛋白氨基酸序列的一致性分别为78%、71%、62%和55%,具有典型的AP2类蛋白结构特征。聚类分析表明,HbERFB4-1属于ERF家族B4亚族。半定量RT-PCR分析结果表明,该基因在胶乳中的表达量相对较低,但乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量迅速增加,推测该基因可能参与了胶乳中乙烯信号的转导。     

巴西橡胶树HbbZIP40转录因子基因的克隆与分析

bZIP转录因子普遍存在于真核生物中,参于多种生物学过程。为分析橡胶树bZIP转录因子的结构功能,本研究克隆了1个bZIP基因家族成员,命名为HbbZIP40(登录号:KY807075)。该基因属于bZIP转录因子基因家族A亚族,全长1 110 bp,包含一个长为900 bp的完整开放读码框,含bZIP结构域,是bZIP基因家族成员。q RT-PCR技术检测分析发现,HbbZIP40在草甘膦和干旱处理下显著上调表达,推测HbbZIP40与橡胶树干旱、草甘膦药害胁迫相关。研究橡胶树bZIP转录因子,对弄清其在橡胶树抗逆机制中的作用与机制具有重要意义。     

巴西橡胶树鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

鲨烯合酶(SQS )是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。以巴西橡胶树为试验材料,提取胶乳总 RNA,利用 RT-PCR 以及 RACE 的方法克隆橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区片段,并进行序列分析。结果表明：橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区为1239 bp,编码413个氨基酸,命名为 HbSQS 。荧光定量分析表明鲨烯合酶基因在不同组织里表达水平存在明显差异,且受乙烯调控。     

巴西橡胶树HbCOI1基因5'调控序列的克隆及分析

利用GenomeWalker方法获得了巴西橡胶树HbCOI1的5'调控序列.通过分析表明,在该序列中除了含有真核生物典型的核心启动子区域(879～928 bp,TATA box存在于886 bp)外,一些与真核生物顺式调控元件相似的序列也存在其中,如在63、85和604 bp等处具有CAAT序列;在212、385和427 bp处有5'UTR Py-richstretch元件;在96 bp处有1个与茉莉酸应答相关的元件TGACG;在43 bp处存在1个与水杨酸应答相关的TCA-element;在145 bp处存在1个与抗性和胁迫应答相关的TC丰富重复序列.此外,在626、745、834和864 bp处分别有ACGTT-box、GATA-box、ARR1AT和I-box等顺式作用元件.     

巴西橡胶树HbCOI1基因5′调控序列的克隆及分析

利用GenomeWalker方法获得了巴西橡胶树HbCOI1的5′调控序列。通过分析表明,在该序列中除了含有真核生物典型的核心启动子区域(879~928 bp,TATA box存在于886 bp)外,一些与真核生物顺式调控元件相似的序列也存在其中,如在63、85和604 bp等处具有CAAT序列;在212、385和427 bp处有5′UTR Py-richstretch元件;在96 bp处有1个与茉莉酸应答相关的元件TGACG;在43 bp处存在1个与水杨酸应答相关的TCA-element;在145 bp处存在1个与抗性和胁迫应答相关的TC丰富重复序列。此外,在626、745、834和864 bp处分别有ACGTT-box、GATA-box、ARR1AT和I-box等顺式作用元件。     

巴西橡胶树死皮病相关基因HbMyb1的结构分析及表达

对与死皮病有密切关系的HbMybl基因进行了克隆和结构分析。该基因含有一个344bp的内含子和2个外显子。利用Genome Walker的方法获得了1．2kb的5′前年序列核心启动子,分析表明该启动子可能是富含GC和依赖于起始子(Inr)的非典型启动子。Southern杂交分析表明,HbMybl在橡胶树基因组中为2个拷贝。HbMybl在树皮中表达最强,在叶片中最弱。     

橡胶树DELLA蛋白编码基因HbGAI的克隆与表达分析

该研究采用RT-PCR与RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因HbGAI(GenBank登录号为KT696439)。HbGAI全长cDNA序列2 050bp,包含1个长1 842bp的完整开放阅读框。序列分析显示,HbGAI基因编码613个氨基酸,其推导的蛋白含有DELLA和GRAS结构域,分子量为66.476kD,理论等电点为5.19,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白。进化树分析表明,HbGAI蛋白与其他植物中DELLA蛋白具有较高的相似性,与麻疯树JcGAI和蓖麻RcGAI亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,割胶和茉莉酸甲酯处理下调胶乳中HbGAI基因的表达,乙烯利处理4h内显著上调胶乳中HbGAI基因的表达,表明HbGAI基因可能在橡胶树割胶、茉莉酸、乙烯响应中发挥作用。