分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA 片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac 插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~r Tc~s lac~ 转化体,得到另一个lac 重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac 控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac 的表达作了分析。     

大肠杆菌棉子糖操纵子a-半乳糖苷酶表达的调节控制

大肠杆菌棉子糖操纵子(raf)位于质粒,其第一结构基因rafA编码的a-半乳糖苷酶为诱导酶。Rat操纵子比乳糖操纵子(lac)或蜜二糖操纵子(mel)对诱导物有更严格的结构特异性。该酶被蜜二糖或棉子糖诱导,也被D-半乳糖微弱诱导,但不受乳糖、PNPG等结构相近糖所诱导。A-半乳糖苷酶的酶诱导形成能力在对数生长末期出现高峰。Rat 操纵子基因结构组成及调节与乳糖操纵子相似。以阻遏物为中介的负调控在raf操纵子调节中起主要作用,同时以环腺苷一代谢降解物基因激活蛋白(cAMP-CAP)为中介的正调控也参与调节。当0．4％葡萄糖加入到其它碳源培养基时,该酶表达水平下降至原活力的1／2—1／3。无论诱导或组成型酶的葡萄糖抑制均未见瞬时抑制。腺苷环化酶(cya)缺失或环腺苷受体蛋白(crP)和cya双缺陷菌株的酶表达则分别下降到原活力的9％和2．5％。Cya突变株或葡萄糖对raf操纵子表达的抑制可被cAMP解除,但cya和crP双缺陷菌株仍有葡萄糖抑制,而且这种抑制不为cAMP抵消,表明通过降低cAMp而影响cAMP-CAP复合体形成还不能解释代谢降解物抑制的全部机制。尚无证据说明吲哚类小分子化合物和低浓度尿素对raf操纵子表达的明显作用。     

高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO

目的:构建含有IL-1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验 证pHisSUMO表达载体的高效可溶性表达.方法:以质粒pMD18-T-IL-1为模板,利用PCR获得I L-1基因克隆并将其与表达载体pET、pTYB、pHisSUMO连接,重组质粒经鉴定后转化到大肠杆 菌DH5α中,并检测其蛋白表达情况.结果:仅在pHisSUMO表达系统获得了IL-1融合蛋白的 高效可溶性表达.利用Ni-NTA纯化后的融合蛋白经SUMO蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟 蛋白且不残留任何氨基酸残基.结论:实验证明pHisSUMO表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量.     

大肠杆菌启动基因的重组和表达 Ⅰ.不同启动基因对β-半乳糖苷酶结构基因表达的影响

质粒pKL6带有β-半乳糖苷酶结构基因(lacZ),启动基因突变失活,lacZ不能表达。在lacZ前插入外源DNA片段,观察lacZ的表达,可以研究启动基因的功能作用。我们用大肠杆菌染色体DNA的HindⅢ片段与pKL6重组,获得一批重组体,对这些重组体的β-半乳糖苷酶的活力水平和限制性图谱作了分析,对它们用作表达载体的可能性进行了讨论。     

铜锌超氧化物歧化酶的重组研究——Ⅰ.铜锌的去除和重组

在制备去Cu、Zn的酶蛋白方法上作了改进并提出新的制备途径,在此基础上对牛红细胞铜锌超氧化物歧化酶进行金属辅基去除和重组研究。通过对酶活性、吸收光谱、圆二色谱和电子自旋共振波谱变化的观察,比较系统地探究了天然酶(Holo-SOD),去Cu、Zn后的酶蛋白(Apo-SOD)和加入Cu~(2+)、Zn~(2+)重组后的酶(Reco-SOD)的性质,以及Cu和Zn对酶活性及功能方面的作用,其主要结果有以下几点:1.用改进法制备去除Cu、Zn的酶蛋白样品可以避免EDTA-Cu~(2+)络合物的污染,残存酶活力仅为天然酶的0.4%,在pH3.8～4.2条件下,加入Cu~(2+)、Zn~(2+)重组后,不仅酶活性可以恢复到98%,而且其UV、CD和ESR图谱均可以恢复到天然酶的状态。2.Cu为酶催化活性所必需。当过量的Zn~(2+)先加入酶蛋白中,然后再补加Cu~(2+),重组酶的活力恢复有所下降。而Zn~(2+)和Cu~(2+)单独加到酶蛋白中去时,Zn~(2+)对酶蛋白的UV图谱没有影响,Cu~(2+)则引起UV吸收大幅度上升。3.同时去除Cu、Zn后的酶蛋白(E_2E_2-SOD)比单独只去Cu后的酶蛋白(E_2Zn_2-SOD)的重组恢复更加困难。     

流行性感冒病毒重组的研究——Ⅰ.高产株和表面抗原重组株的选育

本文报告了甲型流感病毒重组高产株、血凝素单价抗原重组株及神经氨酸酶单价抗原重组株的选育和鉴定方法。实验证明利用灭活病毒和活病毒两株亲本株混合感染,在鸡胚系统中重组,经过抗血清中和选择,再经终末纯化,可以简便、快速而又准确地获得重组株。     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ用pET_(31)b载体的表达和纯化

化学全合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因在大肠杆菌中被表达 ,采用pET31b载体 ,表达产物N端为大肠杆菌酮基立体异构酶的融合蛋白 ,经亲和连续 6个组氨酸的亲和柱层析后 ,溴化氰切割融合蛋白 ,再经高效液相色谱反相柱纯化 ,得到了重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ .质谱分析及N端测序表明 ,rHWTX Ⅰ系正确表达产物 .还原复性的rHWTX Ⅰ表现出与天然HWTX Ⅰ一致的生物学活性     

乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达

对用乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组产朊假丝酵母尿酸酶基因在E.coli JM109(DE3)中表达进行了研究,拟建立一种高效低成本的生产重组尿酸酶的工艺路线。通过摇瓶试验对诱导所采用的乳糖浓度,诱导时机和诱导持续时间进行了优化,并考察在乳糖诱导下的目的产物表达动力学,随后在5 L发酵罐上进行扩大化培养以验证摇瓶优化的结果,进一步将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为5 g/L,最佳诱导时机是对数生长期中后期,诱导持续时间为9~10h;按照优化的条件在摇瓶和5 L发酵罐上进行分批培养,重组尿酸酶最大表达量可达菌体总蛋白的26%左右,可溶性蛋白的36%左右,略高于IPTG的诱导效果;高密度发酵过程菌体终密度达到OD600值40以上,尿酸酶表达量占菌体总蛋白25%左右。     

痘苗病毒通用表达载体pGJP-5的组建

我们从弱毒的痘苗病毒广-9株出发,构建了一个通用的痘苗病毒表达载体pGJP-5。广-9株的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因既作为表达载体与痘苗病毒基因组体内重组的同源顺序,又作为重组病毒的筛选标记。在TK结构基因中插入了编码痘苗病毒7.5K蛋白基因的启动基因(P_(7.5)),它可以有效地启动外源基因在痘苗病毒中表达。同时启动基因P_(7.5)的3′末端有BamHⅠ、SmaⅠ、SacⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点可供外源基因插入。     

乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响

将重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素3(GM-CSF/IL-3)融合蛋白表达菌BL21(DE3)(pFu)作为研究对象,对于以乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律进行了深入的研究。分析比较了不同培养基中,不同生长阶段进行诱导对于产物表达的影响。对诱导所需的乳糖浓度、诱导持续时间长短等因素亦进行了研究。实验结果表明,在对诱导条件进行优化控制的前提下,利用乳糖作为诱导剂可以达到与IPTG类似的诱导效果。随后的研究中,将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。这些研究结果为乳糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。     

特异性向肝细胞表达和复制的EB病毒载体系统的组建

发展了一种高效的、能将推带外源基因的质粒型ＥＢ病毒载体特异性导入肝细胞表达的方法,将ＥＢ病毒复制子载体ｐＤＲ２经改造得到携带外源基因的ｐＥＢｌｕｃ质粒,将ｐＥＢｌｕｃ与人工制备的、既保留了ＤＮＡ结合活性又有为为肝细胞受体识别并内在化的半乳糖基化组蛋白的ｆｌ组分结合形成ｐＥＢｌｕｃ－半乳糖基化组蛋白复合物。该复合物通过脱唾液酸糖蛋白受体介导的内吞进入肝并表达。ｐＥＢｌｕｃ质粒在细胞内能稳定存在并自主     

特异性导向肝细胞表达和复制的EB病毒载体系统的组建

发展了一种高效的、能将携带外源基因的质粒型ＥＢ病毒载体特异性地导入肝细胞表达的方法。将ＥＢ病毒复制子载体ｐＤＲ２经改造得到携带外源基因的ｐＥＢｌｕｃ质粒。将ｐＥＢｌｕｃ与人工制备的、既保留了ＤＮＡ结合活性又能为肝细胞受体识别并内在化的半乳糖基化组蛋白的ｆｌ组分结合,形成ｐＥＢｌｕｃ－半乳糖基化组蛋白复合物。该复合物通过脱唾液酸糖蛋白受体介导的内吞进入肝细胞并表达。ｐＥＢｌｕｃ质粒在细胞内能稳定存在并自主复制。该系统具有应用于以肝细胞为靶组织的基因治疗的前景。     

腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备

利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD (可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白) 蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量 (MOI) (0~1 000) 感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI (0~1 000) 感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFa的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学活性的sTNFRII-gAD融合蛋白。该表达系统的特点是生产规模易于放大,适应无血清培养,可以反复多次收获目标蛋白。     

无性繁殖芽孢杆菌和链霉菌用的运载体

运载体是由一个编码某一核糖体特异结合位点的DNA序列,来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Veg。促进子和一个编码所需蛋白的基因组构起来的,许多芽孢杆菌和链霉菌就利用了这样一些运载体生产出了外源蛋白质。这些运载体的优点,形体小,全能性表达。利用枯草芽孢杆菌和链霉菌代替大肠     

高效可溶性重组蛋白表达载体的构建

本研究构建了两种高效表达可溶性重组蛋白的原核表达载体。一种载体由HisSUMO序列与pET30a(+)载体连接而成(命名为HisSUMO Express),表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化,用SUMO蛋白酶I切割后可获得不留任何残基的重组蛋白。SUMO-蛋白酶I价格较贵,为减少表达蛋白的成本,第二种载体即在His-SUMO和目的序列之间加入羟胺切割位点(命名为HisSUMO Economic)。在HisSUMO Economic中表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化,羟胺液切割后可获得仅留一个甘氨酸残基的重组蛋白。以在常规表达载体中难以表达的鼠源成纤维细胞生长因子-21(mFGF-21)为例,经葡萄糖消耗实验检测其活性,验证两种表达载体的效果。结果表明mFGF-21在两种载体中均获得了高效表达,融合蛋白占菌体总蛋白的40%以上,Ni-NTA纯化后的融合蛋白分别利用羟胺切割液和SUMO蛋白酶I切割,纯化的mFGF-21成熟蛋白回收量约为54mg/L,回收率约为6%。经两种载体表达后的mFGF-21蛋白均具有生物学活性,可促进脂肪细胞消耗葡萄糖,为进一步研究提供了基础。     

构建表达Flag-GPI的重组乙型肝炎病毒载体

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是小型的嗜肝DNA病毒,能够特异性地感染人肝实质细胞。HBV的易感性可以归于多个方面,包括细胞表面的受体以及细胞内的蛋白或其他因子,目前对HBV易感性的了解还有待深入。本课题利用课题组原有的HBV 5c3c载体和糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)的特性,构建了重组HBV载体5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI,转染Huh7细胞后可以将Flag标签锚定在细胞膜上,且可利用Flag抗体通过流式细胞术对其进行分选。在回补HBV包膜蛋白的情况下,5c3cT-Flag-GPI能包装形成完整的重组HBV颗粒。本研究为后续优化重组HBV的包装效率,进而为HBV易感性研究提供工具并奠定基础。     

草莓离体无性繁殖的研究——Ⅰ.影响草莓离体繁殖的因素

基本培养基对草莓的离体快速繁殖有重要影响。通过试验筛选出一个比目前常用的MS和White培养基分别高5.53倍和2.3倍的F培养基(总氮量15mM,其中硝态氮10mM,铵态氮5mM,其它成份同MS)。相同浓度的BA与不同的基本培养基配合作用效果相差悬殊。由于草莓茎尖在MS培养基上生长缓慢,本文探讨了在室温条件下进行草莓种质保存的可能性。还讨论了由花药培养获得再生植株在快速繁殖中的应用问题。     

DNA体外重组的载体——质体和病毒

引言 “人类的历史,就是一个不断地从必然王国向自由王国发展的历史。”人们对生物遗传变异主要环节不断了解和应用,在生物的改造和利用方面获得了愈来愈多的自由。近年来遗传工程和生命合成的发展,突出地说明了这个真理。 遗传工程的主要内容是对遗传物质功能单位的综合,更自由的创造新的动、植物和微生物品系。这是由于人们使用了化学和物理操作的新技     

自噬标志分子MAP1LC3的重组载体构建及表达分析

目的:为深入研究细胞自噬的发生过程及机制,克隆人微管相关蛋白1轻链3-β(microtubule associated protein 1 light chain 3,MAP1LC3,简称LC3)基因,并构建原核和真核重组质粒用于后续的研究.方法:首先RT-PCR方法从人食管癌9706细胞基因组中克隆LC3基因,并分别连接到pET-32a载体和pEGFP-N3载体上,形成重组质粒.前者用IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导表达,后者进行细胞转染实验.结果:IPTG诱导原核重组质粒在E.coli内实现表达,pEGFP-N3-LC3转染到A549人肺癌细胞36h和鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)后,均检测到明显的绿色荧光信号,且在细胞质和胞核内均有分布.结论:成功构建了人源LC3重组表达载体,为研究高等和低等脊椎动物细胞自噬机制及机理过程提供了很好的研究工具.     

SARS病毒N蛋白的原核重组载体的构建和表达

将SARS病毒N蛋白的基因克隆到原核表达载体 pGEX KG上 ,使其在大肠杆菌DH5α菌株中以与GST蛋白融合的形式表达。采用GluthathionSepharose 4B亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,并用SDS PAGE和WesternBlot对表达的融合蛋白进行分析鉴定。结果表明 ,本实验成功地构建了高效表达SARS病毒N蛋白的重组表达载体 ,所获得的融合蛋白可以直接用于SARS抗体的检测 ,可用于SARS的早期诊断及SARS疫苗的研究。