猪2型圆环病毒ORF2基因在塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的新型真核表达载体中的表达

猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应用PCR方法从该毒株感染的PK 15细胞中扩增出完整的ORF2基因 ,将此基因克隆于本实验室此前构建的塞姆利基森林病毒 (SemlikiForestvirus,SFV)RNA复制子衍生的新型真核表达载体Psfv1cs中的BamHⅠ位点 ,获得重组质粒pSFV1CS Cap。用pSFV1CS-Cap分别转染BHK-21细胞和293T细胞 ,经间接免疫荧光试验检测表明 ,PCV2 ORF2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验表明 ,该重组质粒能诱导小鼠产生特异性抗体.     

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。     

昆津病毒复制子——一种新型病毒载体

病毒复制子 (Replicon) 是指来源于病毒基因组的能够自主复制的RNA分子,保留了病毒非结构蛋白基因,而结构蛋白基因缺失或由外源基因替代。昆津病毒 (Kunjun virus) 为黄病毒科黄病毒属成员,其复制子具有表达效率高、细胞毒性低、遗传稳定等特点,在病毒基因组复制调控机制、外源蛋白表达、新型疫苗和基因治疗等领域得到了广泛应用。以下就昆津病毒复制子系统的构建、特性及应用方面的研究进展作一综述。     

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFV-helper2为骨架, 用CMV IE和T7启动子替换SP6启动子并在3′ UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。     

基于DNA的Semliki森林病毒复制子载体体内外高水平表达外源基因

基于DNA的复制子载体显著地提高了复制子载体的应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因,大规模制备重组病毒颗粒,在体内可用于复制子疫苗和基因治疗载体研究.将复制子RNA的cDNA置于RNA聚合酶Ⅱ启动子和转录终止子控制下时,基于RNA的复制子载体可转变为基于DNA的复制子载体.当DNA载体转染细胞后,第一阶段,RNA聚合酶Ⅱ启动子在核内起始合成RNA,经过加工和修饰后运输到细胞质中,相当于复制子RNA,第二阶段,该RNA自我复制及表达外源基因,相当于病毒RNA复制循环.在成功地构建了基于DNA和RNA的双功能复制子表达载体pSCTA和辅助载体pSHCTA的基础上,为了获得高效的基于DNA的复制子载体,对其进行改进而构建了共4种不同的基于DNA的semliki森林病毒复制子,通过对表达载体和相应的辅助载体表达报告基因及对制备重组病毒颗粒的能力进行比较,获得了复制能力提高的复制子载体pSCAR和pSHCAR.该表达载体pSCAR可高水平表达外源基因,与辅助载体pSHCAR共转染可制备高滴度的重组病毒颗粒,并且也能表达抗原基因.另外,报告基因在DNA复制子载体注射的小鼠体内得到了高水平表达,并且DNA免疫小鼠后也诱导产生高滴度特异性抗体以及细胞免疫反应.结果表明,经过改造SFV复制子载体,获得了高效的基于DNA的SFV复制子载体.该复制子载体增强了原复制子载体应用能力,并有潜力作为复制子疫苗和基因治疗载体.     

黄病毒属病毒复制子载体研究进展

RNA复制子是一种能自主复制的RNA载体,保留了病毒非结构蛋白(复制/转录酶)基因,而结构蛋白基因缺失或由外源抗原基因替代,复制/转录酶可控制载体RNA在细胞质中高水平复制以及外源基因的高水平表达。在黄病毒属病毒感染性克隆基础上,其复制子载体得到了成功的构建。黄病毒属病毒复制子为病毒基因组结构功能研究、表达载体构建、假病毒包装及新型疫苗制备等提供了新的技术平台。本文综述黄病毒属病毒复制子的构建原理、方法及应用。     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗的免疫效力评价

此前已构建了基于Semliki Forest病毒（Semliki Forest virus,SFV）复制子载体的表达猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）E2基因的新型猪瘟DNA疫苗pFV1CS-E2,通过动物试验证实,该疫苗以600μg/头的剂量免疫3次,免疫猪能抵抗致死剂量猪瘟强毒的攻击。为进一步评价该疫苗在较低的免疫剂量和较少的免疫次数情况下的免疫效力,将DNA疫苗pSFV1CS-E2和空载体pSFV1CS按100μg/头的剂量,接种猪只2次,然后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,pSFV1CS-E2免疫组（n=5）所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了短期体温升高外,未出现任何其它临床症状,部分猪出现短期轻微病毒血症,个别猪的部分脏器出现轻微病变;而空载体免疫组（n=3）猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全都出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,有2头猪分别于攻毒后第10和11d死亡,剖检时可见典型猪瘟病理变化。结果表明,基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗有望成为具有开发价值的猪瘟标记疫苗。     

基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗的免疫效力评价

此前已构建了基于SemlikiForest病毒(SemlikiForestvirus,SFV)复制子载体的表达猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)E2基因的新型猪瘟DNA疫苗pFV1CS-E2,通过动物试验证实,该疫苗以600μg/头的剂量免疫3次,免疫猪能抵抗致死剂量猪瘟强毒的攻击。为进一步评价该疫苗在较低的免疫剂量和较少的免疫次数情况下的免疫效力,将DNA疫苗pSFV1CS-E2和空载体pSFV1CS按100μg/头的剂量,接种猪只2次,然后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,pSFV1CS-E2免疫组(n=5)所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了短期体温升高外,未出现任何其它临床症状,部分猪出现短期轻微病毒血症,个别猪的部分脏器出现轻微病变;而空载体免疫组(n=3)猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全都出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,有2头猪分别于攻毒后第10和11d死亡,剖检时可见典型猪瘟病理变化。结果表明,基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗有望成为具有开发价值的猪瘟标记疫苗。     

基于Semliki Forest病毒RNA复制子的猪瘟RNA疫苗初步研究

将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测显示,CSFV E2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验结果表明,10μg或100μg pSFV1CS-E2可诱导小鼠产生猪瘟特异性抗体。     

A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原, 构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus, SFV)复制子表达载体。RNA和DNA复制子载体转染BHK21细胞后, 经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测, 结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达; 而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒, 该重组病毒颗粒感染细胞后, 也都能表达Hc抗原。以上结果表明, 基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得, 为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础, 从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。     

XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

Electroporation-Mediated Delivery of Nucleolar Targeting Sequences from Semliki Forest Virus Nucleocapsid Protein

Abstract

Electroporation was used as a powerful and simple method to probe to the intracellular distribution and trafficking of signal sequences. By coupling synthetic peptides to carrier reporter groups, specific amino acid sequences responsible for nucleolar targeting of Semliki Forest virus (SFV) Core (C) protein were found out. In the N-terminal part of the C protein the sequences ⁶⁶KPKKKKTTKPKPKTQPKK^{83 92}KKKDKQADKKKKP¹⁰⁵ are able to situate BSA or KLH as reporter proteins in the nucleolus, suggesting that SFV C protein contains at least two independent nucleolar targeting sequences.     

Large scale transient 5-HT3 receptor production with the Semliki Forest Virus Expression System

The expression of recombinant proteins with the Semliki Forest Virus (SFV) system has been scaled up to bioreactor scale. As a model protein for this study the human 5-HT₃ receptor was chosen. The gene for the receptor was subcloned into the SFV expression plasmid pSFV1. Virus production by in vivo packaging and production of the recombinant protein was scaled up, the latter to a reactor volume of 11.5 l. A Vibromix^TM agitation system was chosen to overcome aggregation problems of BHK cells in suspension. In the process, cells were first grown to a density of 10⁶ cells/ml, the medium was then exchanged with fresh medium and the culture was infected with the recombinant virus at an estimated multiplicity of infection of 30. 24 h post infection we measured an expression level of 3 million functional 5-HT₃ receptors per cell. For harvesting, the cells were pelleted by centrifugation. The receptor protein was purified in a single step (Hovius et al., 1998) by exploiting the hexa-His tag at minimal protein loss (51% yield). Experiments to optimise expression resulted in yields up to 8 million receptors per cell, when the pH of a suspension culture was controlled at pH 7.3. Rapid virus generation and protein production, high protein yields as well as successful large scale application have made the SFV expression system attractive to produce large quantities of recombinant protein in a very short time. After optimisation of the expression conditions (in particular by setting the pH at 7.3), yields were increased twofold.