东亚飞蝗虫病原褪色沙雷氏菌的鉴定与检验

病原褪色沙雷氏菌的有效分离与鉴定对控制由褪色沙雷氏菌引起的养殖东亚飞蝗感染病均具有一定的参考与应用价值,同时将为对蝗灾的生物防治研究提供借鉴。对从发病死亡的养殖东亚飞蝗中分离的10株细菌,进行了表观分类学指征、16S r RNA基因序列与系统发育、人工感染的致病作用等方面的检验与分析。结果表明为沙雷氏菌属的褪色沙雷氏菌,对供试养殖东亚飞蝗显示强致病性。褪色沙雷氏菌对东亚飞蝗有强致病性,是蝗虫养殖的重要致病菌。     

东亚飞蝗病原褪色沙雷氏菌的分型分析

对东亚飞蝗的致病性菌褪色沙雷氏菌进行分型研究,为东亚飞蝗的生物学防治研究或可构建基因工程菌的候选菌株。利用血清型分型与脉冲场凝胶电泳分型方法对不同地区及个体的病死蝗虫中分离的10株细菌与模式菌株(ATCC 13880)进行了分析。结果显示,由不同地区及个体中分离得到的褪色沙雷氏菌同源性存在差异性,基因分型相似性在64%~100%之间,存在不同程度的亲缘关系。本试验丰富了褪色沙雷氏菌的生物学性状内容,也为对褪色沙雷氏菌的检验与进一步深入研究提供了具有参考价值的资料。     

一株牙鲆源黏质沙雷氏菌YP1的分离鉴定及致病性分析

黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是引起人类、动物及植物感染的重要条件致病菌,但其作为鱼类致病菌却鲜有报道。【目的】本研究以从患病牙鲆(Paralichthys olivaceus)病灶处分离的一株黏质沙雷氏菌YP1为研究对象,分析黏质沙雷氏菌对鱼类的致病性及对疾控的影响。【方法】利用形态学、分子生物学及生理生化实验综合鉴定菌株YP1;利用菌株YP1进行人工感染实验、组织病理实验及药敏试验,研究其感染症状、组织病理学、毒力和药物敏感性。【结果】分离自患病牙鲆体表溃疡病灶处的菌株YP1鉴定为黏质沙雷氏菌。感染实验结果显示,牙鲆和斑马鱼的半数致死量(LD₅₀)分别为3.44×10⁷CFU/g和6.28×10⁵CFU/g,除牙鲆外菌株YP1对其他鱼类也具有高致病性;菌株YP1主要导致牙鲆腹水,同时伴有呼吸急促、摄食减弱、脱肛、白便、鳃缺血及多脏器膨大出血等症状,并随着感染时间的延长对脏器损伤呈加重趋势。病理组织切片结果显示,菌株YP1对牙鲆鳃、肠、肝、脾、肾、心均造成损伤。药敏试验结果表明,YP1对左氧氟沙星、诺氟沙星等14种药物敏感;但对氨苄西林、头孢拉定等19种药物具有耐药性。【结论】本研究结果证实了黏质沙雷氏菌是能导致牙鲆腹水病的一种病原菌,同时对其他鱼类也具高致病性,为该菌感染鱼类导致疾病的检测、鉴别和防治提供科学依据。     

粘质沙雷氏菌AS-1中SpnR功能及卤化呋喃对其群体感应的抑制

通过分泌和感知一系列信号分子,细菌能够根据自身菌体密度的变化调控基因的表达,从而控制一系列重要的表现型,包括毒力因子的产生,生物膜的形成以及菌体发光等.这种广泛存在的信号机制被称为群体感应.在沙雷氏菌种中已经发现了多套群体感应机制.粘质沙雷氏菌AS-1从土壤中分离,其中含有LuxI/LuxR的同类蛋白,被称为SpnI/SpnR.粘质沙雷氏菌AS-1合成AHLs分子N-hexanoy1-L-homoserinelactone(C6-HSL)和N-(3.oxohexanoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C6-HSL)作为其信号分子,通过群体感应感知菌体密度来控制基因的表达.通过基因替代的方法制得了spnR基因破坏的变异株,命名为粘质沙雷氏菌AS-1R.对粘质沙雷氏菌AS-1R的研究表明SpnR蛋白消极的调控沙雷氏菌红色色素的产生,运动性以及生物膜的形成等一系列由群体感应控制的性状:另一方面,作为一种天然的群体感应抑制剂,卤化呋喃能够有效的抑制粘质沙雷氏菌AS-1的群体感应,但并不干扰AHL-SpnR的相互作用.为运用粘质沙雷氏菌群体感应调节抑制其致病性提供了方法和依据,同时也为卤化呋喃对群体感应抑制机理的研究提供了新的思路.     

丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin1对东亚飞蝗酶学免疫的影响

Serpins是东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis体内具有免疫调节功能的一类丝氨酸蛋白酶抑制剂.前期研究发现Serpin1能够降低绿僵菌Metarhizium对蝗虫的杀虫效果,本研究旨在从酶学角度明确Serpin1蛋白抑制绿僵菌毒力的原因,进一步揭示Serpins的功能与作用机制.本实验采用饵剂饲喂的方法进一步明确Serpin1蛋白对绿僵菌侵染东亚飞蝗的抑制效果;测定绿僵菌侵染东亚飞蝗过程中,添加Serpin1蛋白对东亚飞蝗体内保护酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、酚氧化酶PO)、解毒酶(多功能氧化酶MFO、谷胱甘肽转移酶GSTs、乙酰胆碱酯酶AchE)共6种酶的影响,以明确Serpin1对东亚飞蝗酶学免疫的调节作用.结果表明,Serpin1能够显著降低绿僵菌对蝗虫的杀虫效果;将Serpin1与绿僵菌混合后处理东亚飞蝗,12 d后其死亡率为63.5％,显著低于绿僵菌单独处理(死亡率为80.6％).酶活测定结果显示,将绿僵菌IMI330189与Serpin1蛋白混合处理后,与绿僵菌处理组相比,东亚飞蝗体内保护酶SOD和PO的活力总体表现为上调,而POD的活力呈现降低的趋势;解毒酶MFO、GSTs的活性呈现升高趋势,AChE的活力呈现先升高后降低的趋势.上述结果表明,Serpin1蛋白能够增强东亚飞蝗体内解毒酶和保护酶的活性,提高东亚飞蝗的酶学免疫,增强对绿僵菌侵染的抵御能力,从而降低东亚飞蝗的死亡率.本研究为进一步揭示Serpins的功能提供了参考.     

黏质沙雷氏菌AHPC29对松树萎蔫病的防治效果及其增菌条件

【目的】从松材线虫的媒介天牛蛹室及其气管中获得的黏质沙雷氏菌Serratia marcescens AHPC29对松材线虫具有致病能力,本研究旨在探究黏质沙雷氏菌AHPC29对松材线虫引起的松树萎蔫病的防治效果以及该菌株在实验室的增菌条件。【方法】通过对温室内人工感染松材线虫的松树灌溉菌剂,分析黏质沙雷氏菌AHPC29对松树萎蔫病的作用效果;通过单组分筛选和正交实验确定培养基组分和培养条件对其生长的影响,探究黏质沙雷氏菌AHPC29的最佳增菌条件。【结果】对于感染松材线虫的松树,灌溉黏质沙雷氏菌AHPC29菌液的处理组生长状态优于对照组,并且树内松材线虫含量显著降低;黏质沙雷氏菌AHPC29增菌的最佳培养基配比为0.1%乳糖、0.5%复合氨基酸、0.5% KNO₃、1.5% MgSO₄,其中影响最大的组分为氮源;培养时其菌液最佳接种量为7%,最佳装液量为40%,最佳转速为180 r·min^-1,最佳温度为30 ℃,最适培养时长为36 h。【结论】本研究获得了黏质沙雷氏菌AHPC29的最佳增菌条件,并证实该菌具有良好的松树萎蔫病防治应用潜力,为其作为生防菌的应用提供了理论基础。     

一株蝗虫病原菌的鉴定及其毒力和病理研究

从蝗虫自然病死虫尸中分离到一株病原菌HR_3,其纯培养物的致病性被科赫原理证明。为确定该菌在分类学上的地位,经生理生化测定和分子鉴定,此病原菌为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。通过口服感染测定了该菌对蝗虫的毒力,毒力回归方程为y=1.067+0.809x,致死中浓度LC50=1.164×108cfu/mL。为探讨HR_3对蝗虫致病的作用机理,对HR_3感染蝗虫后的组织病理进行了研究,结果表明感染初期蝗虫的中肠上皮细胞受到破坏,继而出现局部变性坏死。感染48h后,消化细胞层大部分区域被空泡状物充盈。     

一株产耐高温DNA 酶和蛋白水解酶的沙雷氏菌FS14 (Serratia sp. FS14) 的分离与鉴定

通过组织分离法从白术病害样品的茎秆部位分离到一株产红色色素的细菌FS14,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》,根据其形态学特征、生理生化特性,同时结合16S rDNA序列分析结果,发现该菌属于沙雷氏菌属。研究还发现,从白术茎秆中分离到的这株中温型沙雷氏菌FS14能分泌耐高温的DNA酶和蛋白水解酶,甚至在100 oC预处理30 min后仍有活性。沙雷氏菌能分泌耐高温的DNA酶和蛋白水解酶还未见报道。     

粘质沙雷氏菌杀虫试验

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)属沙雷氏菌族,也称灵菌,是昆虫的一种病原菌,能感染许多昆虫的幼虫和成虫。国外早有研究,然而作为水稻害虫病原菌加以研究,尚未见到报道。近年来我们在这方面做了一些工作,分述如下。     

东亚飞蝗肠道细菌的研究

目的从微生态学角度研究东亚飞蝗的营养生理活动。方法从东亚飞蝗自然种群的雌、雄成虫肠道环境中分离、纯化、培养,获得细菌16个属的菌株,对菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化反应进行系统研究。结果上述16个细菌菌株分别属于沙雷菌属(Serratia)、短状杆菌属(Brachybacterium)、预研菌属(Yokenella)、肠杆菌属(Penterobacter)、微杆菌属(Microbacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、沙门菌属(Salmonella)、棍状杆菌属(Clavibacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、米勒菌属(Moelleralla)、不动杆菌属(Acinetobacter)、埃希菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、克吕沃尔菌属(Kluyvera)、克雷伯菌属(Kleb-siella)。结论东亚飞蝗雌性成虫肠道环境细菌种类为12个,雄性为10个,其中6个菌株相同;数量之间存在明显差异。     

柑橘黄龙病罹病植株显症差异组织内生细菌群落结构分析

【目的】分离鉴定同株罹病柑橘黄龙病植株不同显症状况组织的内生细菌,寻找与黄龙病菌[‘Candidatus Liberibacter asiaticus’(Ca.Las)]相互作用的优势菌株。【方法】利用基于16S rDNA的PCRDGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)分析同一柑橘黄龙病罹病植株的显症和未显症组织内生细菌多样性,并用定量PCR方法,对果、枝、叶3种组织黄龙病菌、优势菌株及细菌总数进行检测。【结果】结果显示显症和无症组织所带黄龙病菌差异很大,显症部位病菌量明显高于无症部位。分析显症和无症组织内生细菌DGGE图谱显示,同一组织内生菌群结构基本相同;对图谱中17条明显条带回收克隆测序,发现其中8个条带均属于沙雷氏菌属(Serratia),占总条带数的47.06%。序列分析显示这8条序列为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)不同的菌株(序列相似性为99.63%)。定量分析各差异显症部位单位组织内的粘质沙雷氏菌和细菌总数,发现相同部位的总细菌量差异不显著,但粘质沙雷氏菌与黄龙病菌的量呈负相关。【结论】柑橘黄龙病病株中,各部位所带病菌量不均匀,是否显症与组织内柑橘黄龙病菌的量呈正相关,内生菌群总量与显症无相关性,但粘质沙雷氏菌与黄龙病菌的量呈负相关。粘质沙雷氏菌与黄龙病菌在韧皮部细胞内增殖过程中的相互作用值得深入研究。     

不同食料植物对东亚飞蝗肠道细菌状况的影响

目的比较在相同的环境条件下不同食料植物对东亚飞蝗肠道细菌状况的影响。方法以墨西哥玉米、野生马唐为食料植物饲喂东亚飞蝗,在其成虫肠道内和粪沙中分离纯化细菌,获得22株菌株,分别对其培养性状、菌体形态、染色反应和生理生化性状进行系统研究。结果上述22个菌株分别属于稀有杆菌属（Rarobact-er）、短状杆菌属（Brachybacterium）、棒杆菌属（Corynebacterium）、棍状菌属（Clavibacter）、葡萄球菌属（Staphylococ-cus）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、埃希菌属（Eschrichia）、气微杆菌属（Aercmicrobium）、沙雷菌属（Serratia）、克雷伯菌属（Klebsiella）、沙门菌属（Salmonella）、志贺菌属（Shigella）、口腔球菌属（Stomatococcus）、短杆菌属（Brevibacteri-um）、地杆菌属（Terrbacter）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、皮杆菌属（Dermabacter）、短小杆菌属（Curtobacterium）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、微杆菌属（Microbacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和凝结芽胞杆菌属（Bacilluscoag-ulans）。结论不同食料植物对东亚飞蝗肠道细菌种类和数量有很大的影响。     

栖北散白蚁致病菌的分离鉴定与特性研究

[目的]了解散白蚁头部发红且死亡的原因,探究致病菌特性.[方法]从头部发红的散白蚁中分离菌株、培养并纯化,通过显微形态、革兰氏染色及16S rRNA基因序列分析鉴定菌株种类.进一步探究菌株产生红色素的条件并通过液相色谱和质谱联用等方法鉴定发酵产物.[结果]散白蚁鉴定为栖北散白蚁Reticulitermes speratus.从该白蚁头部分离得到一株产红色素的革兰氏阴性细菌RS.16S rDNA序列分析表明RS菌株为黏质沙雷氏菌Serratiamarcescens.RS菌株不同于其它大多黏质沙雷氏菌,在37℃仍然产生红色素.HPLC检测分析红色素为灵菌红素.[结论]本文首次报道从栖北散白蚁分离纯化一株产生灵菌红素的黏质沙雷氏RS菌,研究结果为灵菌红素的生产及散白蚁生物防治技术的研发提供了新的思路.     

一株新的耐辐射菌WGR702的分离鉴定及耐辐射特性

从辐射污染的土壤中分离到一株新的耐辐射菌WGR702.该菌为革兰氏阳性球菌,直径1.5 μm～2.5μm.菌体呈粉红色、能运动、兼性厌氧及不产孢子.其生长温度和pH范围分别为10℃～35℃和pH 5.0～10.0.(G C)mol%含量为60.5%.UV和γ射线辐射检测表明WGR702具有很强的耐辐射性.16S rDNA序列(EU315117)分析表明,菌株 WGR702与沙雷氏菌属(Serratia)菌株16S rDNA序列有很高相似性(94.79%～98.53%),但与沙雷氏菌属已报道菌株最大不同点是菌株WGR702细胞为球状,且革兰氏阳性.结合形态、生理生化特征分析表明菌株WGR702可能是沙雷氏菌属(Serratia)的一个新种.     

一株基因克隆干扰菌的鉴定及其发酵液降解DNA活性分析

旨在寻找导致基因克隆失败的原因,检测整个电泳环境中是否存在对DNA有强降解力的菌株。依据菌体形态,革兰氏反应以及16S rDNA序列对DNA降解菌株进行鉴定,琼脂糖凝胶电泳分析菌株对DNA的降解活性。结果显示,从DNA电泳槽中分离到了一株菌,革兰氏染色鉴定为阴性菌,对该菌进行液体培养,利用质粒pUC19作为底物,检测该菌发酵液对DNA的降解能力,发现该菌发酵液能够迅速并彻底地降解DNA,其最佳降解温度为45℃,将该菌命名为DD(DNA degrading)。对该菌的16S rDNA进行测序比对后,发现其与粘质沙雷氏菌(Serrtia marcescens)的16S rDNA序列同源性高达100%。结合菌体形态,革兰氏反应以及16S rDNA序列结果,DD菌株为一株粘质沙雷氏菌,DNA降解活性分析显示其具有很强的DNA降解能力。     

从临床感染中分离的九株粘质沙雷氏菌

从临床化脓性感染中分离到九株革兰氏阴性产生脂溶性红色素的小杆菌。经详细鉴定(20种生化反应,120种底物利用试验及G+C mol%测定)为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。其中两株能利用3,4-二羟基苯甲酸盐为唯一的碳源而生长,证明此试验适用于本属的种型鉴定。9株菌中有7株细菌属于粘质沙雷氏菌A₂型。药敏试验显示青霉素及其它作用于细胞壁的抗生素对这些菌无效而所试验的氨基糖苷类抗生素几乎全有效。红霉紊、链霉素和复方增效磺胺则各株间的敏感性不同;磺胺虽     

医院感染重要革兰氏阴性菌的耐药谱分析

应用Ｋ－Ｂ氏纸片扩散法测定了５年间本院分离的４种２４５１株革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌、沙雷氏菌、铜绿假单胞菌、醋酸钙不动杆菌对临床常用１１～１４种抗生素的敏感性,４种菌对受试抗菌素均有不同程度的耐药性,且对多种抗菌素的耐药率有逐年增加的趋势,表明细菌耐药性在医院内感染中有着越来越重要的作用。     

一株产红色素菌株及对其红色素结构的鉴定

从土壤中分离到一株产红色素的细菌H31,根据该菌株的16S rDNA序列与GenBank中已有序列比对的结果,并结合菌落形态和常规生理生化鉴定方法对该菌株进行鉴定,结果表明:该菌在细菌分类学上属于肠杆菌科,其与黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)同源性最高,但该菌株生理生化实验中的赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及精氨酸双水解酶实验与报道的S. marcescens的结果不一致,为一株新的黏质沙雷氏菌S. marcescens H31。通过紫外光谱、质谱和核磁共振等方法分析,确定其产生的红色素为灵菌红素。     

东亚飞蝗主要过敏原的分析、鉴定与纯化

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)的蛋白质组分并测定其分子量,收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western—blotting)法鉴定其过敏原成分,通过凝胶过滤层析对东亚飞蝗过敏原进行分离纯化。结果表明:东亚飞蝗蛋白粗提液条带大概有30条左右,其中主带大约有10条,相对分子量约为13、15、25、28、40、45、55、70、100、110ku,其中蛋白含量最丰富的约在70ku左右。免疫印迹结果显示,蝗虫过敏条带主要有5条,相对分子量分别约为19、29、38、70、130ku。通过凝胶过滤层析对东亚飞蝗过敏原进行分离纯化,得到了一个高纯度相对分子质量约为70ku东亚飞蝗过敏原,并且发现了一个相对分子质量约为130ku的蝗虫新过敏原。本研究为临床上蝗虫食物变态反应性疾病的诊断和治疗奠定基础。     

XRE家族转录因子XrpA调控粘质沙雷氏菌的耐酸能力

【背景】工业菌株的耐酸能力是发酵过程中的一大挑战。粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)作为肠杆菌科的一种细菌,可生成2,3-丁二醇、乙偶姻和灵菌红素等高附加值产品。然而目前对于粘质沙雷氏菌酸耐受能力的分子机制尚不清楚。【目的】通过对转录调控因子XrpA的挖掘以及对其功能的研究,探究粘质沙雷氏菌酸耐受能力的分子机制,为改善工业菌株耐酸能力提供新的策略。【方法】通过对粘质沙雷氏菌进行转座子插入突变,构建了一个Tn5G转座子插入突变文库,利用文库筛选了一株酸敏感型突变株,并对其进行测序鉴定;同时还对突变菌株中与耐酸相关关键基因的转录水平以及细胞膜通透性、细胞膜完整性和H+-ATPase的活性变化进行检测。【结果】发现了一个响应酸胁迫的转录调控因子BVG90_23400,其属于XRE超级家族转录调控因子,命名为XrpA。在酸性条件下,与野生型菌株(JNB5-1)相比,xrpA被阻断后导致了粘质沙雷氏菌多种表型的变化,其中包括生物量显著下降、H+-ATPase活性降低、细胞膜的通透性以及完整性受到破坏。【结论】 XrpA影响粘质沙雷氏菌耐酸能力的分子机制是通过对细胞膜通透性、细胞膜完整性以及H+-ATPase活性的正向调节来维持细胞在酸性条件下的内环境稳态。同时,XrpA可以通过调节酸性应激反应基因的转录水平来影响细胞内环境稳态,从而调控粘质沙雷氏菌对低pH的耐受能力。