Heterologous expression of the AtDREB1A gene in chrysanthemum increases drought and salt stress tolerance

DNA cassette containing an AtDREB1A cDNA and a nos terminator, driven by a cauliflower mosaic 35S promoter, or a stress-inducible rd29A promoter, was transformed into the ground cover chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum) ‘Fall Color’ genome. Compared with wild type plants, severe growth retardation was observed in 35S:DREB1A plants, but not in rd29A:DREB1A plants. RT-PCR analysis revealed that, under stress conditions, the DREB1A gene was over-expressed constitutively in 35S:DREB1A plants, but was over-expressed inductively in rd29A:DREB1A plants. The transgenic plants exhibited tolerance to drought and salt stress, and the tolerance was significantly stronger in rd29A:DREB1A plants than in 35S:DREB1A plants. Proline content and SOD activity were increased inductively in rd29A:DREB1A plants than in 35S:DREB1A plants under stress conditions. These results indicate that heterologous AtDREB1A can confer drought and salt tolerance in transgenic chrysanthemum, and improvement of the stress tolerance may be related to enhancement of proline content and SOD activity.     

Heterologous expression of the AtDREB1A gene in chrysanthemum increases drought and salt stress tolerance

DNA cassette containing an AtDREB1A cDNA and a nos terminator,driven by a cauli- flower mosaic 35S promoter,or a stress-inducible rd29A promoter,was transformed into the ground cover chrysanthemum(Dendranthema grandiflorum)'Fall Color'genome.Compared with wild type plants,severe growth retardation was observed in 35S:DREB1A plants,but not in rd29A:DREB1A plants.RT-PCR analysis revealed that,under stress conditions,the DREB1A gene was over-expressed constitutively in 35S:DREB1A plants,but was over-expressed inductively in rd29A:DREB1A plants.The transgenic plants exhibited tolerance to drought and salt stress,and the tolerance was significantly stronger in rd29A:DREB1A plants than in 35S:DREB1A plants.Proline content and SOD activity were increased inductively in rd29A:DREB1A plants than in 35S:DREB1A plants under stress conditions.These results indicate that heterologous AtDREB1A can confer drought and salt tolerance in transgenic chrysanthemum,and improvement of the stress tolerance may be related to enhancement of proline content and SOD activity.     

拟南芥热激转录因子AtHsfA2调节胁迫反应基因的表达并提高热和氧化胁迫耐性

越来越多的证据表明热胁迫和氧化胁迫间存在着内在联系. 最近的研究发现, 热激转录因子(Hsfs)在联系热和氧化胁迫信号反应中具有重要的作用. 对拟南芥热激转录因子AtHsfA2在热激和氧化胁迫反应的功能进行了分析和鉴定. 利用Northern blot和定量RT-PCR的方法, 我们发现AtHsfA2的表达不仅被热激诱导, 同样也受到氧化胁迫诱导. 对AtHsfA2敲除突变体和超表达植株进行功能分析表明, 突变体降低了基础性和获得性耐热能力以及氧化胁迫耐性, 而超表达植株却增强这些耐性, 并且这些表型的改变与APX1和一些热激蛋白基因的表达, 离子渗漏水平, H2O2的水平和膜过氧化伤害程度的变化相关联. 以上结果表明, 拟南芥热激转录因子AtHsfA2通过调节胁迫反应基因的表达而提高热和氧化胁迫耐性. 因此, 我们提出热激转录因子AtHsfA2在联系热和氧化胁迫信号反应中具有重要的作用.     

羽衣甘蓝胁迫应答基因BoRS1转化烟草的初步研究

将克隆于羽衣甘蓝的胁迫应答基因BoRS<、I>1连入中间载体p35S 2 30 0 ::gus ::noster相应位点,成功地构建了含BoRS1基因的植物双元表达载体p35S 2 30 0 ::BoRS1::noster,并通过农杆菌介导法对烟草进行了遗传转化。PCR检测结果表明目的基因BoRS1已成功地导入并整合到烟草基因组中。RT PCR分析显示,在不同的转基因烟草植株中BoRS1表达量存在差异。转BoRS1烟草的耐干性和甘露醇胁迫研究表明,BoRS1基因的表达对提高植物抗干旱胁迫能力有一定的作用。     

抗逆调节转录因子DREB1B基因转化多年生黑麦草的研究

以逆境诱导型启动子rd29B为驱动,分别构建了含有抗逆调节转录因子DREB1B基因的表达载体pBAC123、pBAC128,选择标记为bar基因.用高压氦气基因枪PDS1000/He分别将表达载体和p35SIH3导入多年生黑麦草(Lolium perenne)品种Topgun成熟胚的愈伤组织.经除草剂Bialaphos抗性筛选和植株再生,获得了62株转基因植株.经PCR、Dot-blotting分子检测,DREB1B基因已整合到多年生黑麦草部分转基因株系的基因组中.用5种不同浓度的除草剂涂抹黑麦草叶片,非转基因植株表现为不抗,而转基因植株最高可以抗135~200 mg/L.脯氨酸含量测定表明,使用15%PEG8000处理后,转基因植株的叶片脯氨酸含量比非转基因植株提高1倍左右.经25 d人工温室干旱处理,有5棵转基因植株存活;复水后,有3棵植株恢复正常生长.结果表明,利用逆境诱导型启动子(rd29B)来增强外源DREB1B基因的表达,能显著改良黑麦草的抗旱能力.     

干旱响应转录因子DREB1A基因导入水稻光温敏核不育系的研究

以成熟胚诱导的愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料,将诱导型启动子rd29A驱动的拟南芥DREB1A基因导入粳型光温敏核不育系水稻4008S,共获得67株再生苗.再生苗经0.75 mg/L除草剂草铵膦涂布筛选,有62株再生苗表现出对草铵膦抗性.PCR检测抗性苗中DREB1A基因,结果全为阳性.挑选部分进行Southem检测.结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中.在干旱胁迫下,转基因水稻当代(T1代)植株的电导率显著低于非转基因对照植株(P＜0.05),脯氨酸含量显著高于对照植株(P＜0.05),证明DREBIA基因能提高水稻对干旱胁迫的耐受性.     

烟草tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响

烟草DNA结合蛋白TGA1a可特异地作用于CaMV35S增强子的激活序列as-1(-83~-63), 并表现为转录激活功能. 为了研究tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响, 将它置于维管束特异性启动子rolC下游, 并与CaMV35S启动子控制的报道基因串联成一种反式调控系统, 构建了植物表达载体, 同时, 以CaMV35S和rolC分别控制的报道基因构建植物表达载体为阳性对照. 通过农杆菌介导方法转化烟草和分子鉴定, 证明报道基因存在于转化烟草基因组中, 分别测定了不同转基因单株的GUS活性, 结果表明: rolC控制下的tga1a的表达显著增强了CaMV35S控制下的报道基因表达, 其GUS活性明显高于CaMV35S或rolC单独调控报道基因的转化植株, 单株的最高GUS活性达到两个阳性对照的10倍以上. 组织化学定位证实该串联系统使GUS蛋白主要集中在维管束组织. 这一研究结果为提高外源基因在转基因植株中的表达水平和外源基因的组织特异性表达创立了一个新模式.     

Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因转化马铃薯的研究

为获得抗旱性强、生长正常的转基因马铃薯植株,以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥Rd29A(responsive to dehydration)基因ATG上游+83bp至-1 441bp共1 524bp的启动子区域,其DNA序列与已知拟南芥Rd29A 5'端启动子序列同源性为100%;构建了Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的植物表达载体pCHFRd-CDPK1。以马铃薯品种‘费乌瑞它’的试管微型薯为材料,利用农杆菌介导法,将构建成功的pCHFRd-CDPK1载体转入马铃薯中,经筛选与植株再生,获得抗性再生植株。通过PCR和Southern blot检测显示,Rd29A启动子驱动的AtCDPK1基因已整合在马铃薯的基因组中。利用PEG模拟干旱胁迫后,经RT-PCR分析证实,当用20%的PEG胁迫转基因马铃薯植株时,Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的转基因马铃薯各个株系中AtCDPK1基因表达量明显增强,而在无胁迫的条件下,植株中AtCDPK1基因基本不表达;同时发现35S控制AtCDPK1转基因植株在PEG胁迫前后,基因转录未见明显差异。形态学观察还表明,在30%PEG胁迫下,转基因植株能正常生长,其长势优于未转基因的对照,且对照植株略有萎焉。该结果可为进一步利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在农作物中的表达研究及其遗传改良提供依据。     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

拟南芥ICEl基因转化水稻的进一步研究

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将由启动子(35S和rd29A)调控的拟南芥ICEI基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中.潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传;抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照;脯氨酸含量测定结果表明,低温处理后T1代植株脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照;上述结果表明,转ICEl水稻提高了抗寒能力.     

拟南芥ICE1基因转化水稻的进一步研究

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将由启动子（35S和rd29A）调控的拟南芥ICE1基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中。潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传;抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照;脯氨酸含量测定结果表明,低温处理后T1代植株脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照;上述结果表明,转ICE1水稻提高了抗寒能力。     

转DREB基因烟草悬浮细胞系(BY-2)的建立及其几个与抗盐和抗渗透胁迫相关指标的检测

用基因枪法将DREB基因和诱导型启动子rd29B构建的载体pBAC128F转入烟草悬浮细胞。通过除草剂抗性筛选、PCR和PCR-Southern检测,获得转DREB基因的细胞系。以300mmol·L-1NaCl和15%PEG6000处理14d后,转基因细胞系存活并生长,而野生型则接近死亡。转基因细胞系的脯氨酸含量和超氧物歧化酶活性普遍高于野生型的,而丙二醛含量则相反。     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

不同启动子调控转GhCDPK1基因烟草的抗逆性研究

为探究不同启动子对陆地棉GhCDPK1基因抗逆功能的影响,该研究克隆了长度为824bp和1 524bp的2个拟南芥RD29A的启动子序列,分别构建了35S启动子和2个RD29A启动子驱动的GhCDPK1融合表达载体,并利用农杆菌介导法转化烟草,分析了其驱动的转GhCDPK1基因烟草,在逆境胁迫处理后的表型变化,叶绿素、丙二醛(MDA)和脯氨酸含量,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及细胞膜透性的生理变化。结果显示:RD29A启动子驱动的转GhCDPK1基因烟草,比35S启动子驱动表现出更强的耐逆性,其叶绿素含量、脯氨酸含量以及POD、SOD活性都高于35S启动子,而MDA含量与细胞膜的通透性低于35S启动子,且1 524bp的RD29A2启动子片段驱动转GhCDPK1基因烟草的耐胁迫能力比824bp启动子片段更强。     

高效Bt抗虫基因表达结构的构建及其在转基因烟草中表达行为的研究

构建了高效植物表达载体pBinMoBc,其携带有超强表达复合启动子OM及Ω因子控制下的CryIA?基因,作为对照,本实验构建了含有CaMV35S启动子控制下的CryIA?基因的植物表达载体pBinoBc。分别使用两个植物表达载体转化烟草,ELISA检测表明,在pBinMoBc转基因烟草中CryIA?基因的平均表达水平是pBinoBc的2.44倍,最高可达可溶蛋白的0.255%。抗虫检测结果表明,pBinMoBc转基因烟草与pBinoBc转基因烟草相比,具有更强的抗棉铃虫效果。上述结果表明,OM启动子比CaMV 35S启动子更具有实际应用价值,此结果在植物抗虫基因工程研究中具有重要意义。     

一个棉花生殖器官优势表达基因的启动子功能分析

用棉花生殖器官优势表达启动子替代CaMV35S启动子是解决目前转基因抗虫棉存在“前期抗虫性强, 后期抗虫性弱”这一生产实践问题的关键. 运用反向PCR技术从陆地棉中分离到一个棉花生殖器官优势表达基因——腺苷酸核糖基化作用因子1 (Arf1)基因的启动子序列. 该启动子具有独特的结构特征, 不仅同时包含有转录起始子(initiator), TATA box, CAAT box和GC box这四种特异元件, 而且还包含有一个5′非翻译区的内含子. 通过构建四个启动子缺失突变体, 定向替换植物表达载体pBI121上的CaMV35S启动子, 并与GUS基因融合, 构建了4个植物表达载体. 用花粉管通道技术将它们导入到棉花中, 转基因棉花后代的GUS染色和荧光定量分析结果表明: Arf1启动子是一个典型的棉花生殖器官优势表达启动子, 它为棉花生殖器官性状的分子设计和抗虫棉的再创新提供了有用的工具.     

转果聚糖蔗糖转移酶基因(Sac B)美丽胡枝子的获得

采用农杆菌介导的遗传转化方法,将来自枯草杆菌的果聚糖蔗糖转移酶基因(Sac B) 导入美丽胡枝子,以提高胡枝子抵御干旱胁迫和盐胁迫的能力。以美丽胡枝子子叶节为外植体,通过与含有植物双元表达载体pKP的农杆菌LBA4404 共培养,将Sac B 基因导入美丽胡枝子基因组。经卡那霉素筛选后,共获得62 株卡那霉素抗性植株。经PCR特异性扩增和PCR-Southern杂交,证明有5株再生植株基因组DNA 中整合了Sac B 基因。通过RT-PCR分析,结果表明SacB 基因均获得表达。经过200 mmol/L NaCl和5% PEG模拟胁迫,发现转基因植株美丽胡枝子中,可溶性糖含量在任何时候均高于未转化植株,并比对照拥有更高的抗干旱胁迫和盐胁迫能力。     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

拟南芥、荠菜DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

用PCR方法从拟南芥和荠菜中分别克隆了DREB1A基因.序列分析发现从拟南芥中克隆的AtDREB1A基因与已发表的AtDREB1A基因序列(DQ372533)的同源性为99.69%.首次从荠茱中克隆的CbDREB1A基因序列(EF156749)与DQ372533的同源性为99.54%.利用这两个基因分别构建了两个诱导表达载体(prd29A/AtDREB1A,prd29A/CbDREB1A)和两个组成型表达载体(pCaMV35S/AtDILEBlA,pCaMV35S/CbDREB1A),以便进一步开展植物抗旱基因工程研究.     

风信子AGL6同源基因在拟南芥中异位表达引起提早开花和器官同源转化

本文对风信子(Hyacinthus orientalis L.)与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AGL6的同源MADS盒基因HoAGL6进行了功能研究. 基因表达分析结果显示, HoAGL6 mRNA在花序芽、花被、心皮和胚珠中积累, 但未出现于雄蕊、营养器官的叶和鳞片中. 这说明HoAGL6参与了风信子花的形成, 以及花被和子房的发育. HoAGL6在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中异位表达, 转基因植株表现为株型矮小, 极度提早开花, 并失去花序的不确定性. 因此, HoAGL6参与了开花时间调节. 另外, 35S::HoAGL6转基因拟南芥植株频繁出现器官同源转化, 包括花萼、花瓣和叶片转化为心皮状结构或子房结构, 且雄蕊缺失或数目减少. 此结果表明, 在转化植株中HoAGL6参与了花器官特性决定. 进一步的研究表明, 在35S::HoAGL6的拟南芥转化植株中显著提高了开花时间调节基因SOC1和花分生组织特征基因LFY的表达水平, 并且HoAGL6的异位表达也在叶片中激活了花器官特征基因AG和SEP1的表达. 这些结果支持在拟南芥中HoAGL6通过促进SOC1和LFY的表达来调节开花时间, 以及通过激活AG和SEP1参与了花器官发育.