枯草芽孢杆菌中的分子克隆和单体杂种质粒转化的研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的质粒转化与质粒的分子构型有关。用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化的pUB110质粒DNA单体是很少或没有转化活性的。在pUB110质粒DNA上插入一段受体菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体可以转化感受态细胞,但受体菌必须是重组型的。转化效率和插入片段的大小有关,片段愈大转化活性愈高,片段小于0.6kb,就和pUB110DNA单体一样,几乎没有转化活性。在pUB110质粒DNA上插入一段解淀粉芽孢杆菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体转化效率都很低。本文还讨论了用鸟枪法在枯草芽孢杆菌中进行分子克隆的一些问题。     

植病生防菌成团泛菌电击转化条件的研究*

研究了植病生防菌成团泛菌（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）的电击转化条件。结果表明受体菌固体培养、生长到对数早期时的细胞转化效果最好;质粒ＤＮＡ分子量增加１０培,转化效率降低１００倍;质粒ＤＮＡ浓度在０．０１－１μｇ／μＬ范围内其变化与转化频率呈正比,与转化效率成反比;从成团泛菌中提纯的质粒ＤＮＡ比从大肠杆菌中提纯的相同质粒ＤＮＡ转化成团泛菌的效率高出３０倍;最佳电击条件为场强１５ｋＶ／ｃ     

应用电激法在大肠杆菌中导入外源性DNA

本文报道用国产基因导科脉冲仪(LN－101型),采用高压脉冲电场,将质粒DNA和噬菌体DNA成功地转化或转导人大肠杆菌。该电场单次电压脉冲范围1．Okv一2．5kv(初电场强度2,8kV／cm一16kV／cm)、电容范围5—20μF,用质粒pUC18和受体菌株DH5α,获得10　9－10　10转化子／μgDNA。电场强度、电容及脉冲时间等不同的因素影响转化效率。转化率与DNA的强度呈线性关系,与受体细胞密度成正比。 DNA和受体菌混合物在电激前,后的孵育时间,对转化效率影响不明显。用噬菌体M13mp 19 RF及受体菌株JMl09,同样可获得较高的转化效率。     

一种简单、快速制备与转化大肠杆菌受体细胞的方法

用TSB溶液取代常规的CaCl2溶液,制备大肠杆菌受体细胞。在菌体处于对数早期时离心收集细胞,用TSB缓冲液悬浮后,即可用于质粒DNA的转化。转化效率可达107～108转化子／μgDNA。     

不同质粒电转三种乳酸菌的比较研究

为比较研究不同质粒针对不同乳酸茵的电转效率的差异,分别以乳酸乳球菌NZ9000、干酪乳杆菌LC2W和植物乳杆菌WCFS1三种乳酸菌为受体,以七种不同质粒为载体,进行电转实验.结果表明在乳酸乳球菌NZ9000中,转化效率最高的是pIB 184质粒,达到了1.53×107 cfg/μgDNA,在干酪乳杆菌LC2W中,pSIP403质粒的电转化效率最高,达到了6.42×105 cfg/μgDNA,在植物乳杆菌WCFS1的电转化中,是pNZ44质粒达到8.68×105 cfg/μgDNA的最高转化效率.其中质粒pIB184和pNZ44在三种菌株中均有较高的电转化效率,超过了103 cfg/μgDNA,另一方面T-pAMS100、pSIP403、pSIP409三个质粒在干酪乳杆菌与植物乳杆菌中的电转化效率明显高于乳酸乳球菌.不同质粒针对不同乳酸茵的转化效率为乳酸茵的高效电转和表达栽体的选择与构建提供了可行依据.     

第十四届国际微生物学大会的情况介绍(续)

近年来由于在枯草杆菌中克隆表达外源基因的需要,发展了一种称为辅助质粒协同转化的系统。枯草杆菌的感受态细胞转化要求转化的质粒以寡聚体形式存在,否则转化频率将大大下降。假如感受态的受体细胞中存在和将要转化的质粒有部分同源顺序的质     

乳酸菌受体菌株的筛选、鉴定及特性研究

从乳酸菌保健品中分离筛选到一株能作为受体菌的乳酸菌菌株COCC101,经鉴定为粪肠球菌(Enterococcusfaecali)。抗药性实验显示这株粪肠球菌对多数药物敏感或中度敏感;粪肠球菌中没有质粒存在,转化效率和电场强度有对应的正相关,最高达到2×104转化子/μgDNA,并且能广泛接受不同来源的质粒;在Nisin诱导下可表达外源的绿色荧光蛋白(GFP)。这些结果显示COCC101菌株在乳酸菌基因工程研究中有望成为受体菌。     

插入烟草叶绿体启动基因片段的重组质粒转化大肠杆菌和枯草杆菌感受态与原生质体的比较

大肠杆菌(E.coli)N100携带的pK01-26质粒插入烟草(Nicotiana tobacHm var.)叶绿体启动基因片段的重组质粒。该质粒以大肠杆菌HB101为受体可以再转化,转化频率为4.93×10^-6,以枯草杆菌168为受体不能实现转化。上述两种受体菌株的原生质体,经处理,再生细胞壁后,分别获得转化子。经原生质体转化,以大肠杆菌HB101为受体的转化频率为2.7×10^-4频率为2.6×10^-5。以H     

E. Coli PBR322质粒DNA在福氏志贺氏菌中的转化表达

质粒转化到异种细菌细胞是否能够存在、 受体菌细胞能否接收异体DNA物质而进行遗 传性状的表达，是基因工程的重要环节之一。我 们将E. coli pBR322质粒用转化方法，引进福 氏志贺氏2a, 3a菌中，获得成功。     

pUB 110质粒转化枯草杆菌Ki-2株及其突变体的研究

迄今文献中报道枯草杆菌基因克隆化都采用枯草杆菌168株及其突变体。本文采用我国分离的枯草杆菌Ki-2株及其突变体Ki-2-1 32(Thr~-Ile~-Val~-)和Ki-2-148(ura~-)为pUB110质粒DNA的受体菌株。用酸酚法提纯pUB110质粒DNA,在琼脂糖凝胶电泳上看不到样品中有染色体DNA的带。结果表明,Ki-2、Ki-2-132和Ki-2-148都可作pUB 110质粒的受体菌,其转化频率在10~(—3)—10~(—8)之间,因菌株和条件不同,频率有所差异。Ki-2-132的转化效率为每微克DNA可产生10~4转化体。pUB 110质粒DNA浓度在0.01—1.00μg/ml之间时,转化体数目随DNA浓度增加而增加,其中,在浓度为0.01—0.1μg/ml之间成直线关系,测定的DNA依赖指数为1.04,系一级反应。从pUB110质粒DNA转化168、Ki-2、Ki-2-132、Ki-2-148的转化体中提取的质粒DNA仍具有pUB110质粒DNA的抗卡那霉素的转化活性。从转化体提纯的质粒DNA的电泳图以及EcoRI消化后的电泳图与原来的pUB110 DNA的电泳图相同。     

一种简单、快速制备与转化大肠杆菌受体细胞的方法

用TSB溶液取代常规的CaCl₂溶液,制备大肠杆菌受体细胞。在菌体处于对数早期时离心收集细胞,用TSB缓冲液悬浮后,即可用于质粒DNA的转化。转化效率可达10⁷～10⁸转化子／μgDNA。     

链霉素生物合成有关质粒的研究——转化前后灰色链霉菌质粒的检测

本文通过凝胶电泳分析以及电镜的观察,检测灰色链毒菌质粒DNA转化前后的给体、受体和转化子中质粒的存在情况,结合链霉素合成能力的变化证明,链霉素产生菌——灰色链霉菌No.45(给体)中存在两个质粒pSG1(19×10~6道尔顿)和pSG2(2.3×10~6道尔顿)。高温消除质粒的、丧失合成链霉素能力的、气生菌丝受抑制的突变体No.45—3(受体)中只有pSG2,说明高温漓除的质粒是pSG1。以结霉素抗性为筛选标记,通过质粒DNA转化而重新获得合成链霉素能力的转化子TrNo.30(转化子)中,既检测到pSG2,也检测到pSG1。这就进一步证明与链霉素生物合成有关的质粒是pSG1,而不是pSG2。上述电泳分析结果又为电镜观察所证实。     

外源质粒电击转入Pseudomonas putida的条件研究

以自行筛选的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）(命名为Rs198,Genbank登录号为FJ788425）为受体菌,将具有卡那霉素抗性标记的大肠杆菌假单胞菌穿梭质粒PDSK519通过电转化法导入到受体菌中,对细胞生长状态、电转化温度、质粒DNA及感受态细胞浓度、电击电压及电转化介质给予转化效率的影响进行研究。结果表明,在细胞生长至OD600为0.5左右时收集菌体,在低温条件下制备浓度为 4.6×1012/ml 的感受态细胞,以0.3mol/L的蔗糖为电转化介质,在13kV/cm的场强下电击能获得较高的转化效率,最高可达1.3×107个转化子/μ g DNA。为构建恶臭假单胞的遗传转化系统,利用基因工程手段为该菌的进一步研究奠定了理论基础。     

黑曲霉菌pyrG缺陷株的建立

运用紫外线照射致突变方法建立了黑曲霉菌ATCC 12049,13496和N402等3种菌株的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷株.其中ATCC 13496是一种蛋白酶缺陷株.含黑曲霉菌pyrG基因的重组质粒pY 1.2可使它们发生转化,成为Pyr+,转化效率约为8～40转化子/μgDNA.这些pyrG缺陷株将可被用作基因工程的受体菌.     

流感病毒RNA聚合酶PA亚基cDNA重组质粒pQEPA—1转化效率实验研究

转化是细菌基因重组的主要方式＊～,也是在基因丁程中向受体细胞导入外源基因的本要手段。因而,转化在基因重组、基因转移等分子生物学研究中具有重要的作用。以往的文献报道对P重组质拉的人工转化条件所述不～,有的甚至差异较大。为建立重组DNA的高效、快速的转化体系,以大肠肝菌M15为受体菌,以流感病毒RNA聚合酶PA亚基tiDNA的PA－1片段重组质粒PQEPA－1为靶质粒,研究f（2lL,l浓度、转化时间及转化后的温有时间对重组质粒转化效率的影响。实验所用的Q问浓度分别为0、30、巧和150rnmol／L,转化时间分别为儿工ic、20、3队6…     

一种含双歧杆菌种属特异性复制子的新型大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒的构建

目前,双歧杆菌的转化是一个技术难题,与大肠杆菌等宿主菌的高转化效率不同,采用普通的原核质粒无法转化双歧杆菌.为此,本文提出双歧杆菌转化对质粒复制子具有"种属特异性"要求,并通过构建含有双歧杆菌特异复制子的新型穿梭质粒,以求解决这一难题.首先从GenBank获取长双歧杆菌隐性质粒pMB1的序列信息,采用Overlap-PCR方法获得其全长DNA,作为拟构建质粒的复制子;继而采用重组技术,将其与pMK4质粒片段(含大肠杆菌复制子pUC和抗氯霉素基因Cat)重组,构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒;用电穿孔法将重组质粒转化双歧杆菌,通过观察不同电转参数下的转化效率,选择双歧杆菌转化的最佳条件.结果,成功获得全长1899bp的pMB1复制子并构建成功含有pMB1和pUC双复制子的原核重组质粒,经酶切和测序鉴定正确,命名为pCMB1.以重组质粒成功转化了长双歧杆菌NCC2705和NQ1501,而其它3种野生型双歧杆菌(包括1株长双歧杆菌)未能转化成功.结论:质粒中含有双歧杆菌种属特异的复制子是实现双歧杆菌转化的必要条件;即使是含有特异复制子的质粒也只能转化有限数量种型甚至有限数量种株的双歧杆菌;选择最佳电转化条件能显著提高转化效率.     

一种平末端连接的有效方法

转化效率与质粒大小成反比,而当质粒大于１５ｋｂ时,转化效率将成为限制因素,此时提高连接效率极为必要,特别是对于具有普遍性而效率又低的平末端连接。我们在连接反应体系中,加入相应的产生平末端质粒载体的限制性内切酶Ｈｐａ Ｉ、或ＥｃｏＲ Ｖ,与不加Ｈｐａ Ｉ,或ＥｃｏＲ Ｖ的连接反应相对照,连接产物转化大肠杆菌ＪＭ１０９后,产生的转化子比率分别为１９．９％和１０．３％（ｐＦｐ７）,３２．６％和９．７％（     

一种优化的质粒转化简便方法

目的:质粒DNA转化时,比较不同的冰浴时间、热休克时间、预培养时间对转化效率的影响.优化质粒DNA转化方法,缩短了转化时间,该方法可获得与常规转化方法相当的转化效率.方法:质粒DNA加入感受态细胞中,混匀冰浴5min,42 ℃热休克60s,接着冰浴1min,37℃预培养10min,涂布预热至37℃的平板.结果:操作时间由2h减至20min,转化效率没受影响.结论:该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用.     

质粒浓度对氯化钙转化法转化效率的影响

在保证其他条件一致的情况下．设置质粒浓度梯度并建立阴性对照进行研究来确定大肠杆菌DH50t氯化钙转化法时的最佳质粒浓度,结果表明质粒浓度为10^2ng／μL时的转化效率最高。与其他质粒浓度相比,质粒浓度为10^2ng／μL时的转化效率最高,实验重复性好,成本低廉,操作简便,而且对目的基因的克隆也具有重要意义,因此值得推广使用。     

质粒pBR322电注入E.coli HB101的研究

常用的转化方法是用CaCl_2或CaCl_2/RbCl_2处理受体菌使成感受态。转化率约为10~3—10~6个转化子/μg质粒DNA。近年发展起来的电转化技术可使转化率提高到lC~(?)—10~(10)个转化子/μg质粒DNA。我们以质粒pBR322和大肠杆菌HB101为实验材料,对常用的转化方法和电转化的结果进行了比较,对电转化中获得最佳转化效果和各种参数如电压、脉冲时间、脉冲次数、循环数等进行了探讨。