血管平滑肌细胞的分化与血管内壁的构建

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的发育与血管壁的构建是目前相关领域中的重要学科前沿．国内外同行的工作多集中在血管发育初始阶段内皮细胞及其前体细胞在血管新生中的作用、调节因素及生物学机制．VSMCs参与血管壁早期构建,特别是VSMCs的募集与分化机制已经成为血管新生研究中的一个新领域． 本期发表的《 抑制Rac1蛋白活化阻碍胚胎发育早期血管新生 》(见696～701页)报道了韩雅玲教授及其合作者在这一领域取得的最新研究结果．Rac1是真核细胞内重要的一类信号传递分子,在细胞信号传递过程中发挥分子开关作用．他们采用胚胎干细胞(ESCs)为模型,建立稳定表达持续型Rac1和显性失活型Rac1编码序列的小鼠ESCs并制备胚胎小体,诱导分化后观察其对内皮细胞分化和迁移的影响,发现抑制Rac1可以干扰血管内皮细胞连接成血管网状结构,细胞骨架F-actin排列紊乱,细胞的迁移受到明显抑制,表明Rac1在胚胎早期血管发育过程中与内皮细胞的迁移有关[1]． 近年来,韩雅玲教授及其研究集体在VSMCs发育与血管构建、胚胎干细胞来源的拟胚体血管平滑肌发育与血管新生机制以及胚胎主动脉VSMCs起源等方面开展了研究,取得了一系列有价值的成果[2～11],可能为闭塞性和增生性血管病的发生及防治提供理论依据和候选基因．详见“相关链接”．     

胚胎干细胞SM22α-EGFP表达克隆的建立及平滑肌细胞体外发育的动态观察

为探讨血管发育早期血管平滑肌细胞(VSMCs)募集和增殖特点,构建了含有SM22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒,建立了平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达EGFP的胚胎干细胞株(ESCs),以研究VSMCs的发育特点.实验发现,起源于SM22α-EGFPESCs形成的胚胎小体(EBs)在第11天开启SM22α启动子并表达EGFP.此后EGFP阳性细胞持续增加,在第30天达到高峰.VSMCs多起源于EBs中细胞密集处,应用免疫荧光染色及RT-PCR观察到EGFP阳性细胞表达多种平滑肌特异性标志物.在贴壁培养的胚胎小体中VSMCs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形,慢速视频显微摄像测得纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快.以上结果表明,SM22α-EGFPESCs分化形成的EBs可以模拟体内早期胚胎血管形成过程,从形态学上获得VSMCs募集分化的证据.     

Rac1蛋白活化加速缺氧诱导的人血管内皮细胞衰老

为阐明Rac1蛋白在人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）衰老中的作用及分子机制,我们采用持续缺氧的方法诱导内皮细胞衰老,检测缺氧前后内皮细胞衰老标志基因SA-β-Gal和PAI-1的表达、细胞周期分布和细胞增殖情况,同时分析缺氧前后细胞内Rac1蛋白的表达.结果显示,持续缺氧96 h后,HUVECs体积变大,细胞浆内颗粒和空泡增多,SA-β-Gal活性明显增加,PAI-1基因表达升高,细胞发生G1期阻滞,细胞增殖受抑,活化型Rac1蛋白表达上调,提示持续缺氧诱导的内皮细胞衰老可能与Rac1蛋白的活化有关.为进一步明确内皮细胞衰老与Rac1蛋白的关系,应用逆转录病毒将持续活化型Rac1（V12Rac1）和主导抑制型Rac1（N17Rac1）基因分别瞬时感染HUVECs,比较三种HUVECs（HUVECs,V12Rac1-HUVECs,N17Rac1-HUVECs）缺氧后的衰老变化,并分析其下游调控分子--血清反应因子（serum response factor,SRF）的表达和定位变化.研究发现,缺氧培养V12Rac1-HUVECs 48 h即可引起细胞衰老,表现为SA-β-Gal活性明显增加,PAI-1基因表达升高,细胞出现明显的G1期阻滞并且细胞增殖受抑,其改变与缺氧96 h的HUVECs相似;而N17Rac1明显抑制缺氧引起的内皮细胞衰老发生.上述结果说明,Rac1蛋白活化可以加速缺氧诱导的内皮细胞衰老,而抑制Rac1蛋白的活性则可抑制缺氧诱导的内皮细胞衰老.为进一步研究Rac1蛋白引起内皮细胞衰老的机制,通过免疫荧光染色及Western blot分析检测三种细胞缺氧处理后SRF的表达,发现：与HUVECs细胞比较,V12Rac1引起缺氧48 h HUVECs核蛋白中SRF的表达明显下降,SRF入核转位受到明显抑制;而N17Rac1感染后,缺氧HUVECs细胞核蛋白中SRF表达明显增多.上述结果提示：缺氧状态下Rac1蛋白活化能够明显加速HUVECs衰老,而抑制Rac1蛋白活性则明显抑制缺氧诱导的HUVECs衰老,SRF蛋白的核转位活化参与了Rac1蛋白调控HUVECs衰老的发生.     

Rac1/MAPK/ERK 通路介导脂多糖LPS 诱导的人内皮细胞 单层通透性增高机制研究

目的:探讨LPS诱导的人内皮细胞单层通透性改变的分子机制。方法:应用逆转录病毒为载体,感染并筛选稳定表达持续活化型Rac1和主导抑制型Rac1的人HUVEC细胞,应用LPS刺激并观察细胞骨架蛋白F-actin和HUVEC单层通透性的改变。同时应用Western blot方法检测LPS刺激前后细胞中MAPK/ERK信号通路的改变及加入PD98059阻断ERK表达后,细胞内F-actin的改变情况。结果:与正常HUVEC相比较,LPS刺激后,感染活化型Rac1和主导抑制型Rac1的HUVEC中F-actin重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性显著增加。而抑制型Rac1感染后的HUVEC中F-actin无重构现象,同时细胞单层通透性无明显增加。LPS刺激前后,各组细胞中ERK1/2总蛋白均无明显改变。LPS刺激后,感染活化型Rac1的HUVEC中,p-ERK增加。经PD98059阻断后,细胞内p-ERK表达下降同时伴随F-actin解聚发生。结论:LPS诱导的内皮细胞通透性增加是经过Rac1-MAPK/ERK通路介导的。     

胚胎干细胞来源的拟胚体分化早期血管平滑肌标志物的表达时相

目的:研究胚胎血管发育早期SMα-actin、SM22α、myocardin、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)的表达规律,并初步探讨在此阶段血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法:采用转染平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体的胚胎干细胞制备拟胚体(EBs),用免疫荧光染色、RT-PCR、Western blot分析SMα-actin、SM22α、myocardin、SMMHC的表达时相;然后分别用0μmol/L(对照组)、10μmol/L、50μmol/L AG1296(血小板源性生长因子受体抑制剂)处理EBs,观察三组SMα-actin、SM22α、myocardin、SMMHC在基因及蛋白水平上的表达变化。结果:胚胎血管发育早期SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC分别在EBs第0(胚胎干细胞)、8、11、13d开始有表达。AG1296三种浓度处理后SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC蛋白表达及myocardin、SM22α和SMMHC mRNA表达均无明显差异。结论:EBs发育过程中存在着自发的VSMCs分化,SMα-actin表达最早,依次为myocardin、SM22α、SMMHC;PDGF-BB对EBs分化早期VSMCs标志物表达的调控可能不是必要的。     

高效诱导人胚胎干细胞成为内皮祖细胞

血管的发生和发育不仅对胚胎形成中各器官的发育分化十分重要,并且对成体的创伤修复和生殖功能也具有重要意义．血管内皮细胞是形成心血管封闭管道系统的形态基础,体外多种细胞可经诱导分化产生出内皮祖/内皮细胞(endothelial progenitor/endothelial cells,EPCs/ECs),但是存在一些不足．鉴于人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)诱导分化的全能性和长期增殖能力,为EPCs/ECs提供了新的来源．现有文献报道,hESCs诱导分化为EPCs/ECs的比例较低,为了提高该诱导分化效率,我们使用分阶段的二维诱导方法,首先将细胞接种在超纯层纤连蛋白(Matrigel)上,之后通过在不同阶段添加不同的因子,最终获得CD31⁺KDR⁺细胞的比例可以达到16%．进一步内皮诱导分化的结果显示,获得的EPCs/ECs的比例可以达到约32%,这些细胞具有在Matrigel上形成血管样结构的能力,可结合植物凝集素．实时定量PCR的结果显示,诱导分化所得的细胞表达众多内皮相关基因,并且免疫荧光的结果也表明部分细胞表达内皮细胞特异性表面标志CD31．     

胚胎干细胞在体外模拟心肌生长环境中向心肌分化

目的:探讨获得大量成熟同质有功能的心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的方法.方法:胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)经悬滴培养法形成拟胚体(embryoid bodies,EBs),将EBs用抗坏血酸处理后与天然心肌细胞共培养诱导ESCs的分化,采用免疫组化、流式细胞技术、RT-PCR、超微分析等方法分析分化细胞(ESC-derived CMs,ESCMs)的结构和功能.结果:共培养组,常规组和对照组中有(90.1±3.40)%,(29.6±6.03)%和(20.1±3.82)%的EBs表现节律性收缩,差异有统计学意义(P＜0.05).在体外模拟的心脏微环境中,不但跳动EBs的数目明显增加,且单个跳动EBs中含有功能CMs的百分比也明显增加.兴奋收缩的自律性能维持更长时间,在后期分化得到的有功能ESCMs在细胞形态上接近于天然的心肌细胞.结论:心脏微环境是促使ESCs特定地分化为CMs的关键因素,抗坏血酸处理和共培养诱导策略可使ESCs定向分化为CMs.     

低氧通过上调Wnt5a促进人胚胎干细胞向生血内皮细胞分化

胚胎的早期发育是在低氧条件下进行的,低氧环境在胚胎血管发生及造血发育中起着重要作用,低氧条件能促进胚胎干细胞在体外向内皮细胞和造血细胞的分化,但低氧条件对造血细胞产生的具体作用及相应机制尚不清楚．本研究利用人Es细胞向造血祖细胞定向分化体系,发现低氧环境可以促进CD31＋TIE2＋造血内皮祖细胞的产生,2天后造血内皮祖细胞开始表达终生造血基因．进一步研究发现,低氧能够上调Wnt5a的表达,干涉Wnt5a能够抑制低氧环境对生血内皮细胞分化的促进作用．在正常氧环境下加入Wnt5a产生促进生血内皮细胞分化的效应,该效应与低氧处理促进生血内皮细胞产生的作用相似．本研究首次证明了低氧通过上调Wnt5a的表达促进人Es细胞向生血内皮细胞的分化,为ES细胞向生血内皮细胞的分化及造血祖细胞分化的研究提供了新的线索．     

血管内皮生长因子受体3在大鼠胚胎皮肤淋巴管和血管内皮的表达及意义

目的观察血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3)蛋白在大鼠第15d胚胎和第21d胚胎皮肤淋巴管和血管内皮的表达水平,探讨VEGFR-3在胚胎淋巴管和血管发生发育中的生物功能.方法应用免疫组织化学技术(SABC法)对大鼠第15d和第21d胚胎共61例皮肤样本进行抗鼠VEGFR-3免疫组织化学染色,观察VEGFR-3在皮肤淋巴管和血管内皮细胞的表达情况.结果大鼠胚胎皮肤淋巴管和血管内皮细胞均阳性表达VEGFR-3蛋白,VEGFR-3蛋白在大鼠胚胎第15d、胚胎第21d皮肤淋巴管内皮细胞的阳性表达率分别是38.71%(12/31)和73.33%(22/30),第21d胚胎皮肤淋巴管VEGFR-3蛋白的表达水平明显高于第15d胚胎皮肤淋巴管VEGFR-3蛋白的表达水平(P<0.01).VEGFR-3蛋白在大鼠胚胎第15d、胚胎第21d皮肤血管内皮细胞的阳性表达率分别是48.39%(15/31)和46.67%(14/30),第15d和第 21d胚胎皮肤血管VEGFR-3蛋白的表达水平之间无明显差异(P>0.05).结论随着大鼠胚胎的发育,VEGFR-3蛋白在皮肤淋巴管的表达水平表现为明显上升的趋势,提示VEGFR-3在淋巴管发生发育中的作用逐渐增强.     

C型利钠肽基因调控斑马鱼胚胎血管发育

本研究旨在探索C型利钠肽前体蛋白基因(natriuretic peptide precursor C,nppc)在斑马鱼胚胎期的表达及其在血管发育过程中的功能。利用胚胎整体原位杂交技术检测nppc基因在斑马鱼胚胎期的表达。同时使用转基因斑马鱼系Tg(flk1:GFP)和Tg(fli1a:n GFP),显微注射nppc特异性吗啉基反义寡核苷酸(morpholino)和nppc m RNA调控nppc基因表达,利用激光共聚焦显微镜观察分析斑马鱼节间血管(intersegment vessel,ISV)表型,并统计内皮细胞数目。结果显示,在受精后24 h和48 h,nppc基因在斑马鱼脑、心脏、血管系统中都有表达。下调nppc基因表达导致ISV发育缺陷,ISV内皮细胞数目减少。以上结果表明下调nppc基因表达可能通过抑制内皮细胞增殖和内皮细胞迁移调控斑马鱼胚胎血管发育。