节杆菌β-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

分离纯化了由节杆菌所产的fI-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)并研究了其酶学性质.以乳糖发酵培养基培养,离心收集茵体,超声破碎细胞得到粗酶液;采用硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水、DEAE-Sepharose离子交换和p-aminobelazyl-1-thio-β-galactopyranoside...     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α 半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上 ,尝试了基因工程α 半乳糖苷酶在 5L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α 半乳糖苷酶的研究。在 4L无机盐培养基中接种 0 .4LpPIC9K Gal GS115培养物 ,最终得到 3 .5L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为 2 .1g L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点 ,设计了如下的纯化流程 :离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带 ,总回收率 41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后 ,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明 ,从发酵液中纯化的α 半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α 半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α-半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上,尝试了基因工程α-半乳糖苷酶在5 L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。在4 L无机盐培养基中接种0.4 L pPIC9K-Gal/GS115培养物,最终得到3.5 L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为2.1 g/L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点,设计了如下的纯化流程：离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带,总回收率41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明,从发酵液中纯化的α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α-半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

饲用型青霉α-半乳糖苷酶活力测定的研究

研究了比色法测定饲用α-半乳糖苷酶活力,以对硝基苯酚-α-D-吡喃半乳糖苷为底物和对硝基苯酚作标准产物。酶活力的测定条件受很多因素的影响,如酶浸提液的pH、酶液稀释倍数、反应温度、作用时间。其中稀释倍数和pH的影响较为显著。稀释酶液的酶活测定值在0．02～0．07U／mL内较为合适。考虑到动物饲用酶制剂的特殊性,测定α-半乳糖苷酶活力时建议规定pH为5．5,反应温度为40℃。根据研究结果,反应时间采用10min,比色波长405nm为宜。     

鳞杯伞α-半乳糖苷酶的提取纯化及酶学性质研究

采用离子交换层析和凝胶过滤层析对鳞杯伞子实体中的α-半乳糖苷酶进行纯化,得到了一种分子量为50 kDa的α-半乳糖苷酶,命名为CSG。纯化后的CSG纯化倍数为891.46倍,比活力为54.78 U/mg,得率为0.71%。通过BLAST比对液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)获得其肽段,发现其为GH27家族的α-半乳糖苷酶。CSG的最适pH为3.0,最适温度为50 ℃。在酸性范围pH 2.2-7.0和温度范围4-30 ℃有较好的稳定性。Mn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺对CSG有较强的抑制作用。半乳糖和蜜二糖对CSG的抑制类型为混合型抑制。化学修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺显著降低CSG的活力,碳二亚胺对CSG具有显著的激活作用。该酶具有良好的蛋白酶抗性,且对棉子糖家族寡糖(RFOs)、瓜尔豆胶和赤槐豆胶均表现出良好的水解作用。     

新型α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的：制备高效价、高特异性的新型α-半乳糖苷酶的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法：用脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫新西兰大白兔,获得α-半乳糖苷酶的兔抗血清,并经HiTrap rProteinA柱纯化获得高纯度的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹评价抗体的特异性。结果：通过免疫法得到了α-半乳糖苷酶的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1：1×10^6,经rProteinA柱纯化后获得了高效价、高纯度的抗体,Western印迹显示该抗体特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合。结论：获得了新型α-半乳糖苷酶的高效价、高特异性的兔多克隆抗体,可用于血型转变过程中残留α-半乳糖苷酶含量的特异性检测。     

微生物α-半乳糖苷酶的研究进展

α-半乳糖苷酶在多种生物内广泛存在,微生物是目前α-半乳糖苷酶的主要来源。微生物α-半乳糖苷酶可按照底物特异性或序列同源性分类,在古菌、细菌和真菌中均存在,其性质与来源和家族有关,催化机理大多为构型保留机制,目前主要应用于食品与饲料工业,还可用于生物质降解和医药领域。展望了微生物α-半乳糖苷酶的研究趋势。本文对相关研究者具有一定的参考意义。     

微生物源α-半乳糖苷酶的研究进展

介绍了微生物源α-半乳糖苷酶的生理生化特性、合成调控机制的研究进展情况及其在食品、饲料、医药工业等领域的一些应用。Α-半乳糖苷酶均是糖蛋白,不同来源的α-半乳糖苷酶的作用基质特异性差别较大,作用基质特异性差别是由蛋白质部分N-末端氨基酸序列决定的。不同微生物来源的α-半乳糖苷酶其最佳作用条件、pH稳定性及耐热性差异较大。微生物α-半乳糖苷酶是一种诱导酶,其合成受多个基因的调控,高浓度的葡萄糖能抑制其合成。     

新型α-半乳糖苷酶的稳定性研究

目的：观察脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶（GAL）在不同pH缓冲液、不同温度下的稳定性,以及不同离子及还原剂对酶活性的影响。方法：以GAL对单糖底物对硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）的活性为主要检测指标,观察不同离子及还原剂等对酶活性的影响;观察GAL在不同pH缓冲液中和不同温度下的稳定性。结果：钙离子、锌离子、钴离子和高浓度的锰离子增强酶的活性,DTT抑制酶的活性,螯合剂EDTA的加入提高了酶活性。GAL在pH4.6～7.5时保存1 h后稳定性很好,能保持最高活性的90％以上;在4℃～45℃下保存的稳定性最好,45℃开始活性下降。结论：GAL具有很好的温度稳定性和pH稳定性,使其适用于血型转变和异种移植。     

蓖麻β-半乳糖苷酶的纯化及其基本性质

蓖麻籽黄化苗中存在高活性β-半乳糖苷酶。经硫酸铵分级分离、DEAE-纤维素离子交換层析、Sephadex G-100、CM-Sephadex和DEAE-Sephadex层析纯化。活性收率为6.4％,纯化倍数达107倍。纯化了的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带,SDS-PAGE显示两条蛋白带,其相应分子量分别为3.25×10~4和2.94×10~4。用Sephadex G-200分子筛层析法测得分子量为6.7×10~4。综合上述结果推测该酶是由两个不同的亚基构成。以邻硝基苯酚-β-半乳糖苷为底物测得该酶的表观Km为5.9×10~(-3)mol/L。最适pH和最适温度分别为4.5和50℃。酸碱稳定区域在pH4.6—7.5之间。不同浓度缓冲液以及不同种类缓冲液、不同金属离子对酶活性影响均进行了讨论。     

粪便宏基因组来源低分子量碱性β-半乳糖苷酶的异源表达及酶学性质

【背景】β-半乳糖苷酶在食品加工、临床医疗及基因工程等领域有重要的应用价值,开发酶活性高、热稳定性强的β-半乳糖苷酶已成为研究热点。【目的】从西黑冠长臂猿（Nomascus concolor）粪便微生物宏基因组中挖掘新型β-半乳糖苷酶并进行酶学性质研究。【方法】以西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组DNA为模板扩增β-半乳糖苷酶基因GalNC1-8,构建重组表达质粒pEASY-E2/GalNC1-8,转化至大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）异源表达,研究其酶学性质。【结果】获得GH35家族碱性β-半乳糖苷酶GalNC1-8,其分子量为28.18 kDa,最适温度为50°C,最适pH为8.0。将该酶在30-50°C下处理1 h,剩余酶活仍保持在80%以上;pH 7.0-9.0下处理1 h,剩余酶活大于54%。在含乙醇的反应体系中,其酶活性几乎不受影响;β-巯基乙醇、丙三醇、甲醇、Na⁺、K⁺和Li⁺对其酶活性有促进作用。在0.5-3.5 mol/L NaCl下处理1 h后,仍保留50%以上的酶活性。...     

热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

克隆前期筛得分枝犁头霉Absidia ramosa WL511的热稳定α-半乳糖苷酶cDNA基因aga(GenBank No.DQ234280),将aga基因插入表达载体pPICZαA并电转化整合到毕赤酵母P.pastoris GS115的染色体上。30℃、甲醇流加量0.5%(V/V)时,酵母发酵上清液中酶活达32U/ml。纯化后酶的比活力为137U/mg,SDS-PAGE显示单一条带,凝胶过滤和SDS-PAGE估算其分子量分别为348kDa和87kDa,该酶为四聚体结构,糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大6kDa。该酶等电点为5.2,最适反应温度73℃,最适pH6.8,60℃以下及pH5.5～9.0范围内活性稳定。75℃时保温2小时保留54%的酶活,85℃时酶活完全消失。以对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷为底物,该酶Km值为0.42mmol/Lol/L;Vmax为413U/mg;kcat为64531/min。     

一株产右旋糖酐酶青霉的分离及酶的纯化和性质

[目的]从土壤中筛选到一株新的产右旋糖酐酶的真菌F1001,为酶法制备药用级右旋糖酐提供新的右旋糖酐酶产生菌株.[方法]通过形态特征和ITS rDNA序列分析方法鉴定菌株.利用硫酸铵盐析、Sepharose 6B凝胶柱纯化,得到纯度较高的酶蛋白.以右旋糖酐70 kDa为底物,对右旋糖酐酶酶学性质及催化机理进行研究.[结...     

表达重组咖啡豆α-半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵

用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础.     

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究

纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%。酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5.0,该酶在pH3.4-6.0下稳定,高温耐受性差。Cu2+、Zn2+、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca2+和Mn2+对酶具有较强的激活作用。     

β-半乳糖苷酶的研究进展

对β半乳糖苷酶的性质及作用机理作概述,同时对利用生物技术进行β半乳糖苷酶基因克隆和表达的研究概况进行了简要介绍。     

植物β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一个与细胞壁降解相关的酶,广泛分布于植物组织中,参与一系列的生理生化过程,如植物的花粉发育、果实成熟及生长过程中多糖的裂解。目前,已从多种植物中分离到β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因属于多基因家族,随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同组织中被发现。但目前β-半乳糖苷酶在植物发育中确切的作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域内细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合所在课题组的研究结果进行相关探讨,为进一步研究β-半乳糖苷酶在植物中的作用机制提供新的线索。     

植物β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一个与细胞壁降解相关的酶,广泛分布于植物组织中,参与一系列的生理生化过程,如植物的花粉发育、果实成熟及生长过程中多糖的裂解。目前,已从多种植物中分离到β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因属于多基因家族,随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同组织中被发现。但目前β-半乳糖苷酶在植物发育中确切的作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域内细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合所在课题组的研究结果进行相关探讨,为进一步研究β-半乳糖苷酶在植物中的作用机制提供新的线索。     

β-半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用

研究乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶的酶学性质及低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)的酶法合成条件。利用高效液相色谱法进行检测,以GOS(聚合度n3)生成量为指标,考察温度、pH、金属离子种类和浓度对酶活性的影响,以及K+存在时,底物浓度、反应时间、加酶量对乳糖转化率及GOS生成浓度的影响。结果表明:一价离子对β-半乳糖苷酶转糖苷活性具有促进作用,其中K+、NH+4对水解活性同样起促进作用,而Na+起抑制作用;制备低聚半乳糖的最佳工艺条件为37℃、pH8.0、K+0.08mol/L、初始乳糖质量浓度500g/L、反应时间5h、加酶量10μL/g乳糖,此条件下低聚半乳糖的生成质量浓度达到94.74g/L。     

分枝犁头霉α-半乳糖苷酶的氨基酸组成及化学修饰

α-半乳糖苷酶进行氨基酸组分分析,结果为含有较多的酸性及巯水性氨基酸,较少的组氨酸、酪氨酸及半胱氨酸。 用几种蛋白质侧链修饰试剂对α-半乳糖苷酶进行化学修饰。在一定条件下,当巯基及酪氨酸残基分别被NEM、IAA及NAI修饰后,酶活力不受影响,说明这些基团与活力无关。当羟基、组氨酸及色氨酸残基分别被EDC、DEP、NBS及HNBB修饰后,酶活力大幅度下降,说明这些基团或者参与了酯催化作用或者位于酯活性位区附近。