流行性出血热(EHF)Ⅱ型疫苗生产中病毒株及原液的质控检测

流行性出血热Ⅱ型纯化疫苗(即亚单位疫苗)系用Ⅱ型Hautaan病毒R_(22)SM株感染乳鼠脑精制而成。为了保证疫苗生产和质量控制,我们对病毒株的繁殖量,感染度,毒力及纯毒株的中和指数作了实验性检测,依据检测的结果:用Ⅱ型EHF毒株R_(22)SM株乳鼠脑内接种感染后的第4或5天病毒在脑内开始出现,而大量繁殖则在接种感染后第7～8。其单一鼠脑内病毒繁殖量(病毒滴度)和制成单一收获原液中病毒含量基本相一致;脑内病毒滴度log LD_(50)为9.7;原悬液中病毒滴度log ID_(50)为11.2,纯毒试验的特异性中和指数为1378。如上所述,各种实验检测结果完全符合EHF疫苗生产规程指标要求。     

流行性出血热病毒感染金黄地鼠的实验研究

本文证明金黄地鼠对于流行性出血热病毒包括家鼠型和野鼠型毒株均敏感。除口饲外,多途径接种均可使地鼠感染。流行性出血热病毒浙5株10001D_(50)接种3周龄地鼠,五天后即可在肺、脾、肠、肝等多种组织中检出病害抗原,至8—10天达最峰,其中肺最强,抗原持续时间至少50天。接种病毒后10天左右,可在血中检出抗体,后缓慢上升,至第50天达1:1280—1:5120。乳鼠感染EHF病毒后可引起全身播散性感染,病毒抗原可在全身软组织中找到。乳鼠感染强毒株可发病致死,但幼鼠和成鼠不表现症状为健康带毒者。     

流行性出血热病毒对乳鼠致病特点的观察

本文观察了两株从病人体内新分离的流行性出血热(EHF)病毒114株和435株对乳鼠的致病特点,并在感染的乳鼠脑内找到了EHF病毒。免疫荧光检查发现,病毒抗原广泛存在于感染鼠的脑、肺、肝、肾等脏器。脑内和腹腔两条感染途径的比较发现,病毒抗原在上述脏器中的分布基本一致,但前者脑内的病毒感染滴度较后者高一个对数单位。对病毒的动态观察发现,EHF病毒首先在乳鼠腹腔感染6小时后的腹腔巨噬细胞(Mφ)中分离到、并持续阳性;病毒血症出现在感染后2天,随之在脑、肺、肝、肾和脾脏中查到。以上结果表明:EHF病毒对乳鼠具有广泛的嗜性,脑内感染途径能获得较高滴度的感染性病毒。提示EHF病毒在鼠mφ中增殖并携带至全身播散,可能是造成乳鼠全身性弥漫性感染的主要原因。     

用15L转瓶大规模生产腮腺炎疫苗的研究

细胞与病毒同时接种于33℃培养5天,其病毒滴度平均为6.25 LogCCID50/ml,但细胞成片后再感染,其病毒滴度平均为4.85 LogCCID50/ml.在鸡胚细胞感染2.3×10-3病毒剂量时,滴度可达≥6.5 LogCCID50/ml,病毒高峰期于100小时和120小时分二次收获,其滴度分别达到6.0和≥6.5 LogCCID50/ml.每瓶产疫苗量4500ml和9000ml,病毒滴度没有影响.液体疫苗于2～8℃保存14天,滴度由5.75降至4.75 LogCCID50/ml,而将疫苗保存在-18℃至18周,其滴度由6.38缓慢下降至5.0 logCCID50/ml.     

体内外感染PRRSV处理下仔猪脾淋巴细胞增殖活性的变化

为了探讨体内或体外感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的仔猪脾淋巴细胞在体外培养的增殖能力,本研究将PRRSV-GXA分离株经Marc-145细胞大量增殖培养,然后体内感染仔猪,接种病毒后分别于第11天、第14天和第21天从活体猪收获脾脏,分离脾淋巴细胞后用ConA和LPS于体外进行诱导增殖.研究结果显示第11天收获的T淋巴细胞增殖能力高于对照组,而B淋巴细胞增殖能力明显下降;第14天收获的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力均极显著低于对照组;第21天收获的B淋巴细胞增殖能力略高于对照组,T淋巴细胞增殖能力略低于对照组.同时,用不同滴度的PRRSV体外感染PRRSV阴性的猪脾淋巴细胞,经ConA和LPS诱导增殖后,发现病毒滴度在103~106 TCID50/mL范围内,能明显提高脾淋巴细胞的体外增殖能力;而病毒滴度在100~102 TCID50/mL范围时,脾淋巴细胞增殖能力低于对照组.本研究结果说明PRRSV体内或体外感染对仔猪脾淋巴细胞增殖活性均有显著的影响,将为临床上PRRS的综合防治提供理论依据.     

流行性出血热病毒感染家猪的实验

本实验证明猪为流行性出血热病毒(EHFV)的敏感实验动物。从啮齿动物中分离的动物源株(R_(22))和从EHF患者血中分离的人源株(HB_(55))都可感染猪,并可在其体内许多组织中复制增殖。家猪在接种EHFV后第6—9天有一个短暂的发烧期,表现出病毒血症。于接种后的第7—11天(R_(22))和7～20天(HB_(55))可在组织中、特别是脾和肺中,用直接免疫荧光技术(DFA)很容易地捡出EHFV抗原。亦可在感染EHFV的猪血中检出EHFV抗体。从感染后的荧光阳性猪脾、肺可分离出感染性病毒。但R_(22)病毒株在感染猪后的第15天便完全消失,而HB_(55)株在感染后的第20天仍可查见,似乎动物源株(R_(22))和人源株(HB_(55))有所差异,然而都对家猪有感染性。从而,首次证实了家猪为EHFV的敏感实验动物,可作为EHFV的分离,增殖及疫苗研制等的新动物模型。这一发现,对EHF的研究将起积极作用,也提示猪在EHF流行病学上的意义不可忽视。     

巨细胞病毒感染对新生豚鼠胸腺的影响

新生豚鼠皮下接种豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)后,导致动物胸腺急性感染。感染豚鼠胸腺在接种后第五天开始出现病毒,第十天达高峰。此外,感染动物胸腺的发育受到抑制,细胞总数和T淋巴细胞数随朐腺中病毒滴度的增高而进行性下降,至接种GPCMV后第十天最显著。由于病毒对T细胞的作用,细胞表面红细胞受体的丧失导致胸腺Null细胞百分比高于对照动物。     

Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究

选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态。结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6d为病毒在细胞内的增殖高峰期。     

狂犬病病毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株的适应传代

目的建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞,连续传代,检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果 CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞,通过连续带毒传代至第7代,病毒滴度可达6.78 lg LD50/mL,并在第10~15代内滴度维持在7.0 lg LD50/mL以上,15~30代滴度稳定在7.0 lg LD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDC P15制备的疫苗原液,各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)的要求,疫苗效力在6.0IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。     

粘虫核型多角体病毒在同源寄主细胞系内复制的研究

对MsNPV在同源寄主细胞系NEAU Ms 94 7311内复制进行了研究。结果表明 ,接种MsNPV后 72h ,细胞核内开始有成熟的多角体形成 ,病毒接种后 2 4 0h感染率最大 ,达 36.2 % ,至2 64h多角体完全成熟 ,达 2 5.0PIB/感染细胞。病毒增殖曲线表明 ,接毒后 2 4h在培养基中开始检测出MsNPV NOV ,2 4 0h滴度达最大值 ,为 6.32× 10 5TCID50 /mL。病毒连续传代至第 7代或第 8代以后 ,其感染率、病毒滴度及多角体产量均有显著下降。     

Ⅱ型登革病毒D01090株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育及初步鉴定

目的:选育能在人胚肺二倍体细胞KMB17上稳定增殖的Ⅱ型登革病毒适应株,为研发以人源性细胞为基质的登革疫苗候选株奠定基础。方法:将Ⅱ型登革病毒中国株D01090提取病毒基因组,通过RT-PCR法进行登革病毒型别鉴定后,在C6/36和Vero细胞上进行毒种扩增和滴度测定;将D01090毒株以4.0MOI接种KMB17细胞并反复传代至病毒完全适应在细胞内扩增,并连续传代10代,选育出良好的KMB17细胞适应株;病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心后获得高浓度病毒液,接种KMB17细胞后通过透射电镜超薄切片检测细胞的病理变化;然后经过三轮蚀斑纯化筛选出纯化病毒株,免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性。结果:以Ⅱ型登革病毒中国株D01090基因组为模板,能扩增出511bp的登革病毒特异基因和119bp的Ⅱ型登革病毒型特异性基因。病毒经C6/36细胞扩增后滴度达4.5CCID50/ml,感染KMB17细胞至第三代可产生明显的细胞病变(cytopathic effect,CPE),连续传10代细胞病变速度逐渐增快,至第10代达到增殖高峰,病毒滴度达5.0CCID50/ml;将病毒感染6天后病变达+++的KMB17细胞进行超薄切片后经透射电镜观察细胞的病理变化,镜下可观察到内质网中新组装成的病毒颗粒,细胞周围产生很多分裂的小碎片,伴有游离出胞的病毒;三轮蚀斑纯化后筛选出纯化克隆,免疫荧光法检测病毒的抗原性呈阳性。结论选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株,经蚀斑纯化后仍保持较好的抗原性。     

BALB/C乳鼠作为流行性出血热动物实验模型的初步研究

用EHF病毒76/118株、陈株、H_(8278)株、,A_(54)株经脑内注射BALB/C小鼠,乳鼠均能发生感染,并引起规律性发病,表现为耸毛、个体瘦小、动作迟缓、后肢麻痹僵直,直至死亡。在乳鼠脑、肺、肝等脏器内均可检出病毒抗原,并可分离出病毒,传3代的乳鼠脑悬液经VeroE—6细胞滴定,病毒滴度有明显增高,说明Balb/C乳鼠对EHF病毒是敏感的,可作为EHF的实验动物模型。幼鼠和成鼠虽然也能感染EHF,但在脑、肺、肝等脏器中均查不出病毒抗原,而抗体水平却很高,最高可达1∶1280。     

急性巨细胞病毒感染导致新生豚鼠脾细胞亚群的定量改变

新生豚鼠皮下接种豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)后,导致脾脏GPCMV急性感染,脾脏肿大,脾细胞增生,计算表明,脾T淋巴细胞,B淋巴细胞、吞噬细胞数显著高于正常动物,接种病毒后第5天即可在脾细胞检出高滴度感染性病毒(达2.5 log10 TCID50/10~7细胞),其中,主要是脾B淋巴细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞携带病毒。     

流行性出血热病毒在人革膜传代细胞内的生长繁殖

本文应用人羊膜传代细胞(Wish细胞)对流行性出血热病毒(EHFV)的敏感性进行了试验,用EHFV武株及76118、A9、R22、R4、陈株等5个代表株接种Wish细胞。结果Wish细胞感染EHFV后第1代第8～10天即可查见明显的特异性荧光,荧光光强度随代数和时间而增加,TCID50为10~4～/10~5ml。并用荧光阻断试验和双份血清证实在Wish细胞内繁殖的病毒为EHFV。此结果为EHF病原学研究提供了新的敏感细胞株。     

乙型脑炎14-2株冻干活疫苗的生产研究

乙型脑炎病毒14-2株经地鼠肾细胞连续传23代,各代次的病毒滴度和回传乳鼠后的毒力都较稳定,与5-3株无差异。各代次的神经毒力和中枢神经外毒力也与5-3株相同。脑内感染12～14克小白鼠均不致死,皮下感染也不致病。用地鼠肾细胞经36℃培养4天,病毒增殖达到高峰,滴度为8.0～8.5logTCID50/0.2ml。病毒培养液的pH值为7.4～7.6时,病毒增殖高峰可持续3天。以1％明胶、5％蔗糖为保护剂,在冻干后无真空、不充氮的条件下。14—2株活疫苗在37℃可保存10天,室温(16～31℃)可保存4个月,5～8℃可保存一年,病毒滴度均无明显下降.冻干后充氮或不充氮病毒的滴度及稳定性看不出差异。冻干14—2株活疫苗融化后,用Eagle’s液稀释,置22～23℃8小时,滴度不变,若以生理盐水稀释,则可保持2～4小时;以蒸馏水稀释只能稳定2小时。     

通过基因组定量研究猪瘟病毒在细胞中的增殖特性

应用间接免疫荧光、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)测定技术,分别从病毒抗原、病毒基因组RNA复制水平和病毒感染滴度变化3个方面,研究了猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞中增殖的特点,用猪瘟病毒石门株感染96孔板培养的细胞,1×102个TCID50/孔,间接免疫荧光检测结果显示感染后8h能检测到被荧光抗体染色的感染细胞,随感染时间的延长,出现荧光的细胞数量逐渐增多,在感染后72h,几乎所有细胞均能出现荧光。Real-time PCR结果显示在细胞感染初期的8~24h,病毒的基因组RNA复制呈加速趋势,其拷贝数在感染后72h达到高峰。此外,在感染后8h能检测到病毒基因组负链RNA转录,不过负链RNA在病毒增殖过程中维持在较低的水平。TCID50测定结果表明CSFV的感染滴度增加趋势与基因组类似,在病毒感染8h后能检测到具有感染性的子代病毒,感染滴度在8~20h之间逐渐增长,24~48h之间增长速度稍减慢,在感染后48~52h达到高峰,能在72h之内维持较高的感染滴度。     

双单克隆抗体ELISA间接夹心法检测流行性出血热病毒抗原

建立了检测流行性出血热(EHF)病毒抗原的双单克隆抗体(McAb)ELISA同接夹心法,用本法和间接荧光抗体技术(IFAT)相比较,IFAT检出感染细胞内病毒抗原的高峰在感染后第8天,而ELISA检测感染上清中病毒抗原的高峰在第14天,两方法检测179份人工感染EHF病毒的乳鼠脑和肺组织标本,阳性检出率分别为72.1％和68.2％,实验结果表明,本法特异,敏感,简便,不仅可用于EHF病原学研究,也适用于流行病学调查检测大量鼠肺标本。     

四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究

本文首次对低温保存的三株草鱼呼肠孤病毒GCRV873、GCRV875、GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒感染特性等比较研究.结果表明,GCRV873、GCRV875、GCRV876在-30℃保存10年后仍然具有一定的感染性,其滴度均在102TCID50/mL以上,略低于从病鱼组织分离的GCRV991毒株的滴价.经传代培养后,四株GCRV的毒力逐渐升高,并趋于稳定;当感染复数(MOI)为0.05PFU/cell时,测定四株GCRV的滴度均高于108 TCID50/mL,但略有差异.GCRV873的滴度最高,可达到6.4×1011 TCID50/mL.连续传代的GCRV毒株在不同温度(28℃、31℃、34℃、37℃、41℃)条件下,均可感染CIK细胞;在28℃时,感染效价最高,随着温度的升高,其感染效价逐渐降低.     

两种传代细胞系对轮状病毒D36株(P[4]G2)敏感性的比较

目的探讨轮状病毒D36株在MDCK细胞和Vero细胞上培养的适应性,确定其培养的最佳细胞基质及培养条件。方法将D36株以MOI 1.0按不同培养瓶分组接种MDCK细胞和Vero细胞,补充含有不同浓度胰酶的维持液,于不同时间观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对D36株的敏感性。结果D36株病毒感染MDCK细胞后第6天病毒滴度达到最高,为(5.00～5.50)lgCCID50/mL;而D36株病毒感染Vero细胞后病毒滴度于第8天达高峰,为(4.50～4.75)lgCCID50/mL。另外,在两种细胞维持液中加入约0.8μg/mL的胰酶均可提高病毒滴度。结论两种细胞系在同等条件下感染D36株病毒后,MDCK细胞比Vero细胞出现病变的时间早,每一批MDCK细胞培养物病毒滴度高于同批次试验的Vero细胞培养物。     

甲肝病毒在猴胚肾细胞和Vero细胞上的分离与适应

使用恒河猴胚肾(MEK)细胞从临床标本中分离和适应了甲肝病毒W和X,通过阻断实验、中和实验、免疫荧光和免疫电镜实验、RT-PCR对其进行特异性鉴定,证明是甲肝病毒.W株和X株第7代在MEK细胞上的抗原滴度分别为1∶512、1∶1024,感染滴度(logTCID50/mL)分别为8.17、8.50.只有分离株W可以适应于Vero细胞,第6代21d抗原滴度为1∶256,感染滴度(logTCID50/mL)为8.00.