蛋白质定向进化的研究进展

定向进化是改造蛋白质分子的一种有效的新策略。主要是在实验室里模拟自然进化过程,通过由易错PCR、致突变菌株诱变等方法对编码蛋白质的基因进行随机诱变,由DNA改组、随机引导重组和交错延伸等方法进行突变基因体外重组,设计高通量筛选方法来选出需要的突变株。它不仅可快速产生工业上有用的新酶,而且对研究蛋白质的结构与功能的关系具有非常重要的意义。     

蛋白质定向进化的研究技术及应用

蛋白质定向进化是在人类改造蛋白质的过程中产生的。蛋白质定向进化通常分三步进行,即随机诱变、体外重组和筛选。每一步都有多种研究技术。蛋白质定向进化大大加速了人类改造蛋白质的步伐,在实际应用研究和基础理论研究中都具有重要意义。     

非随机方法构建酿酒酵母基因工程菌

酿酒酵母是基因工程产品研究和生产的一个重要表达系统,表达载体和宿主细胞是构成表达系统的两大要素,虽然外源基因表达的方式、强度主要由表达载体控制．但宿主细胞的选择对最终获取产品的质量和数量也具有十分关键的作用。酿酒酵母基因工程宿主菌除要求具有高的DNA转化效率、细胞生长密度和稳定性、低的内源蛋白水解酶活性外,还必须具备与表达载体相对应的营养缺陷筛选标记,用传统随机诱变方法得到的营养缺陷变异株,因含有本底和隐性突变,在细胞生长密度和稳定性方面往往不能满足基因工程产品研究和生产的要求,甚至不能有效地表达外源基因。本文报道用重组技术,通过非随机方法构建了酿酒酵母基因工程宿主茁。研究表明用该方法得到的宿主菌在细胞生长密度、稳定性和表达外源基因方面优于用传统随机诱变方法得到的宿主菌。     

蛋白质定向进化技术的研究进展

蛋白质定向进化技术是蛋白质分子改造的一个重要策略.重点介绍了易错PCR、DNA改组等对编码蛋白质的基因进行随机突变和重组的技术,以及构建突变体库和高通量筛选的方法,并探讨了定向进化技术在蛋白质工程中的应用及前景.     

蛋白质定向进化的研究进展及其应用前景

定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略.它不需要了解蛋白质的空间结构,主要通过在实验室里模拟自然进化过程,采用错误倾向PCR等方法对编码蛋白质的基因进行随机突变,经DNA改组、交错延伸等技术进行体外重组,设计高通量筛选方法来选出需要的突变体.本综述了定向进化技术的发展及应用.     

基因体外随机突变的两种方法的研究

引导蛋白质功能进化常用的方法是模拟和加速蛋白质基因自然重组的进程,即在蛋白质的基因中引进随机突变。因此,蛋白质基因体外随机突变的方法影响着引导蛋白质功能进化的效果。本文描述两种简单而有效的基因体外随机突变发生方法。一种是化学诱变法：将蛋白质基因用1.0mol/L硝酸钠在室温下处理1h,然后将突变基因插入质粒,导入大肠杆菌中表达;另一种方法是延伸诱变法：将10个随机氨基酸短肽基因连接到蛋白质基因上,使蛋白质C末端连接随机短肽,通过增大蛋白质分子来达到延伸蛋白质序列空间的目的。来自嗜热脂肪芽孢杆菌的过氧化氢酶I基因用这两种方法进行了随机突变,获得了大量突变体酶基因。通过对突变体酶基因表达产物性质变化的测定,证明这两种基因诱变方法能够有效地诱发基因的随机突变。 Abstract:Two novel and simple methods were described in the paper for in vitro mutagenesis and recombinatin of polynucleotide sequence to mimic and accelerate nature's recombination strategy to direct the evolution of protein function.One is chemical mutagenesis: protein gene was inserted into M13mp18,and the single－stranded DNA was treated with 1．0mol/L sodium nitrite at room temperature for 1h for mutation and converted into duplex,then the mutated gene was ligated to plasmid for expression.Another is elongation mutagenesis: random peptide of 10 amino acid was connected at C－terminal of protein to expand the sequence space by increasing proteins dimensions,then the elongation mutated gene expressed in E.coli.We have used these two methods to recombine the thermostabilized catalase I, and these two methods were found to be efficient to form a lot of catalase I mutates by identifying the properties of mutated enzyme.     

限制性酶介导整合技术在盘基网柄菌的应用

1前言突变分析技术在许多功能基因的分离和表达中起着关键的作用,前人已经利用电离辐射、紫外诱变、PCR和转座子等技术对许多模式生物进行了随机突变研究。分离具有特殊细胞分化功能的基因需要建立大群体的随机突变体库,但是用传统方法产生的随机突变体的鉴定与突变表型相关基因的     

人参多肽基因的酶法体外随机——定位诱变

本文报道了酶法体外随机——定位诱变人参多肽基因的原理和方法。该法把传统的随机诱变和现代的定位诱变融合起来,可灵活控制基因突变的随机性和定位性。我们用双脱氧末端终止法测定了三个突变株的结果证实了该法的合理性和可行性,     

一个耐热碱性磷酸酯酶突变型的研究

为了进一步揭示蛋白质的耐热机制,对含有耐热碱性磷酸酯酶（ＦＤ－ＴＡＰ）的表达质粒ｐＴＡＰ５０３Ｆ进行了随机诱变,用菌落原位显色法从约５０００个转化子中筛选到４个耐热性下降的突变型克隆,并对其中１克隆（ＴＡＰＭ３）进行了部分酶学性质、ＤＮＡ和氨基酸序列的研究。酶学性质研究表明,与野生型相比,该突变型酶的耐热性有较大幅度的下降,而热激活性无明显改变。ＤＮＡ序列分析表明在１２３９位ＴＡＰＭ３发生Ｇ→Ａ转     

组学技术在重离子辐射微生物诱变育种中的应用

重离子辐射诱变具有诱变率高、诱变谱宽、突变体易稳定等优势,在微生物育种实践中已得到广泛应用。随着测序技术的发展,对重离子辐射诱变效应的研究可以实现较为全面地了解突变体在基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等多个层面的生物学信息。本文综述了利用重离子辐射诱变技术进行微生物育种的研究进展,以及联合高通量测序技术探究重离子诱变产生的生物学效应机理。在此基础上,进一步探讨利用组学方法研究重离子诱变微生物的新思路,旨为重离子诱变微生物育种技术提供参考和建议。     

枯草杆菌蛋白酶基因工程的研究进展

本文介绍了枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)的研究现状,即利用定位诱变和体外重组等技术改变酶的性质,包括催化活性、底物特异性、稳定性、低温适应性以及酶在有机相中的性能等。对枯草杆菌蛋白酶的成功改造不仅有可观的商业价值,而且为蛋白质工程的发展作出了重要的贡献 。     

钝齿棒杆菌argR基因克隆、表达及其重组菌发酵产精氨酸研究

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS.M7是筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。ArgR是精氨酸合成过程中的一种调控蛋白。为进一步验证其在钝齿棒杆菌中对精氨酸合成量的影响,利用特异性引物,分别扩增标准菌C. creantum AS 1.542和诱变菌C. creantum AS.M7的argR全长基因,测序后比较二者的差异;结果表明标准菌argR基因ORF全长516 bp,编码一个含172个氨基酸残基的蛋白;而诱变菌argR基因的109位碱基由C替换为T,导致ArgR蛋白在钝齿诱变菌中表达被提前终止。同时,将来源于标准菌的argR基因连接到穿梭表达载体pXMJ19中,电击转化至诱变菌C. crenatum AS.M7 得到重组菌株,用摇瓶发酵的方法观测重组菌产精氨酸量的变化。SDS-PAGE和Western blot分析证明标准菌的argR基因在诱变菌中得到了表达。对重组诱变菌产精氨酸量进行了测定,结果显示:产精氨酸能力由原来7.8 mg/ml下降至2.5 mg/ml,下降了约67.9%。     

HIV蛋白质优势B细胞抗原表位的筛选、重组表达与抗原性鉴定

设计了一种新的病原体蛋白质B细胞抗原表位的筛选和重 组表达方法。不须使用抗原,而通过交替用病人血清IgG抗体“淘洗”(biopanning)随机肽库和用正常人血清IgG反向吸附,来获得特异抗原表位资料。用HIV病人血清的IgG抗体淘洗噬菌体递呈随机十二肽库,再以正常人IgG抗体吸附,筛选到了能和HIV病人血清发生特异反应的噬菌体克隆,经ELISA、DNA测序等,成功地筛选出了位于HIV gp41外膜蛋白、高亲和力、构型特异的优势B细胞抗原表位(602GCSGKLICTTNV613)。用大肠杆菌硫氧还蛋白作为骨架,在其活性部位以“内融合”形式重组表达了该抗原表位,纯化的重组蛋白具有良好的抗原性,能与HIV(+)IgG抗体及艾滋病人血清呈特异反应,表明本技术路线可以有 效地进行HIV蛋白质的B细胞抗原表位筛选和重组表达。此方法也可移植于其它病原微生物抗原或自身抗原的表位研究,继而为基于抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据。     

枯草杆菌蛋白酶基因工程的研究进展

本文介绍了枯草杆菌蛋白酶（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）的研究现状,即利用定位诱变和体外重组等技术改变酶的性质,包括催化活性、底物特异性、稳定性、低温适应性以及酶在有机相中的性能等。对枯草杆菌蛋白酶的成功改造不仅有可观的商业价值,而且为蛋白质工程的发展作出了重要的贡献。     

离子束在生物品种改良中的应用研究进展

辐射诱变育种是利用各种射线诱发生物遗传基因突变,促进基因重组和核外突变,获得有利用价值的突全体。诱变育种的辐射技术和方法在不断地发展看,辐射源由X射线、γ射线发展到快中子、电子束、空间辐射,离子束诱变育种是近十几年崛起的新技术,具有损伤轻、突变率高、突变谱广的优点,概述了这一新的品种改良技术的进展。     

DNA改组的最新动态及应用前景

DNA改组(DNA shuffling)是目前最方便、有效的一种分子水平的体外定向进化技术,该技术同倾向错误PCR (Error-prone PCR) 相结合,通过对单基因或相关基因家族的靶序列进行多轮随机诱变、重组和高通量的筛选,可以有效富集正突变,去除负突变,提高突变文库的丰度,创造新基因和获得期望功能的蛋白质。DNA改组技术已在新药物等领域取得了广泛的应用,极大地推动了现代生物科学和生物技术的发展。该技术同计算机强大的数据分析系统相结合,将会为后基因组学的发展提供强有力的技术平台。     

DNA改组技术在水蛭素实验进化中的应用

蛋白质的改造是生物工程的重大研究课题.由于结构和功能预测的不精确性,而使按照三维结构信息进行定位诱变往往达不到预期的目的.近年来,另一条改造蛋白质的途径有较大的发展,即在实验室条件下模拟生物分子的自然进化,通过变异和靶功能的选择来获得改进性能的蛋白质[1],此过程称为生物分子实验定向进化.DNA改组(DNAshuffling)是一种改造基因和蛋白质的有效实验进化技术[2].它是在体外进行基因随机片段的重组,从而增加基因的多样性,促使有利变异与不利变异分离,通过选择使有利变异得到优化组合[3].DNA改组包含3个步骤:基因的随机片段化,自身引发PCR和重组合PCR.经过DNA改组的突变体库有可能选择到性能更优的突变体.为进行亲和淘选,需将突变体展示在噬菌体的表面[4].     

重组标签蛋白在蛋白质纯化中的研究进展

重组蛋白的表达纯化是研究蛋白质结构与功能的重要环节之一,表达重组蛋白宿主细胞的监测筛选和重组蛋白低水平可溶性表达、低回收率以及不稳定易水解等问题一直是蛋白质高通量纯化工艺中的难题。近年来,将多肽或蛋白质作为标签,与目标蛋白共表达的方法已经很大程度地解决了这一问题。因此,针对不同特性的蛋白质选择合适的标签纯化策略在重组蛋白纯化研究中是相当关键的环节。本文回顾了几种传统标签蛋白的研究概况(His-tag,Arg-tag,Flag-tag,GST-tag,MBP-tag等),着重对近年来新开发的了几种标签蛋白(Si-tag,Halo-tag,Intein-CBD-tag,ELPs-tag等)进行了深入探讨,并对新标签蛋白在蛋白质纯化中的应用前景作以展望。     

用于蛋白质体外分子进化研究的DNA随机突变技术

蛋白质体外分子进化是模拟自然的进化过程,利用基因随机突变和定向筛选（选择）技术,以获得具有预期新功能的突变体分子。虽然体外进化近几年才产生,但已成为医药和工业领域中筛选具有特殊催化性质的酶的最重要的方法之一。ＤＮＡ随机突变技术是蛋白质体外分子进化研究的基础,本文将对几种最重要的突变方法：倾向错误的ＰＣＲ、ＤＮＡ重排、模板交错延伸反应和随机延伸突变的原理和应用等加以介绍。     

雷帕霉素菌株的常压室温等离子体(ARTP)诱变选育

雷帕霉素由放线菌次级代谢产生,具有抗真菌、抗肿瘤以及免疫抑制等生理活性,是临床重要的器官移植、抗肿瘤原料药物。为了获得具有高发酵潜力的工业用菌株,对雷帕霉素菌株的摇瓶发酵工艺进行了优化。采用常压室温等离子体(ARTP)的方法对高产雷帕霉素菌株的单孢子悬液进行诱变处理,通过高压液相的方法对诱变菌株的发酵代谢产物进行检测,成功地从诱变菌株中筛选获得了发酵产量提高30%以上的诱变菌株,建立了ARTP诱变选育高产雷帕霉素菌株的方法,为后期进行该菌株的选育研究工作以及中试发酵工艺优化提供了方法和物质的基础。