巴马猪NK细胞表型鉴定及猪CIK细胞诱导方法建立

目的获得巴马猪外周血淋巴细胞中NK细胞的表型及比例的数据,建立一种高效率猪CIK(cytokine-induced killer)细胞体外诱导培养的方法。方法分离巴马小型猪外周血淋巴细胞,通过检测CD2~+/CD8~+/CD3~-细胞以表征猪NK细胞的表型;通过优化诱导培养条件,提高诱导淋巴细胞中CIK的比例,建立高效率CIK细胞体外诱导方法。结果利用优化的诱导培养条件,在诱导培养第5天时CD3~-/CD2~+/CD8~+的NK细胞的比例可高达43.63%,较最初分离时NK细胞比例提升了5.59倍;细胞增殖活性实验表明诱导培养第5天时可见明显的3个荧光峰,表明诱导后细胞发生了3次分裂,理论上较最初分离增加了8倍;诱导细胞的qPCR表型分析表明该细胞群体在诱导培养第5天时相关的表面标志有明显的上升也与流式分析结果一致。结论建立了高效的猪CIK细胞体外诱导培养的方法。     

DC-CIK细胞的生物学活性及体外抗血液肿瘤研究

目的:研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后的体外增殖能力、免疫表型变化、分泌细胞因子水平以及对K562、K562/ADM细胞毒作用的影响.方法:正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照.用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)的水平.结果:DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P＜0.05);DC、CIK细胞共培养后,CD3+ CD8+、CD3+ CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P＜0.05);共培养3d,DC-CIK细胞上清液中IL-12、INF-7的分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P＜0.01,P＜ 0.05);在2.5∶1-20∶1的效靶比范围内,DC-CIK共培养物对K562和K562/ADM的杀伤活性均高于单纯CIK细胞组,且差异显著(P＜0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关.结论:DC-CIK细胞的增殖能力、分泌细胞因子水平、对K562和K562/ADM的杀伤活性均高于CIK细胞,为DC-CIK细胞免疫治疗提供了实验和理论依据.     

共培养的树突状细胞与CIK细胞的体外增殖和杀瘤活性研究

本文观察树突状细胞与同源CIK细胞共培养后培养物的表型、增殖活性变化,及DC对CIK细胞细胞毒活性的影响。提取健康供血者的PBMC,常规诱导出DC与CIK细胞,用A549肺腺癌细胞裂解液抗原冲击DC,并和CIK细胞共培养,动态观察DC-CIK培养物增殖活性和表型变化;定量检测细胞培养上清中的IFN-γ和IL-12;并用MTT法检测共培养细胞杀伤A549肺腺癌细胞和BEL-7404肝癌细胞的活性。结果表明DC与CIK细胞共培养,通过彼此的相互作用诱导出比CIK细胞增殖活性和杀伤活性更强的细胞群体。经A549肺腺癌细胞裂解液抗原冲击的DC活化的CIK,对A549肺腺癌细胞的杀伤活性高于单纯CIK细胞,差异显著(p<0.05)。二者对BEL-7404肝癌细胞的杀伤活性无显著差异。实验证明DC与CIK共培养细胞是一种增殖活性和细胞毒活性高于CIK细胞的免疫活性细胞,经肿瘤抗原冲击的DC能明显提高CIK对肿瘤细胞的杀伤活性,具有更广阔的应用前景。     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对急性白血病细胞的体外杀伤作用

目的:研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与同源树突状细胞(DC)共培养后CIK细胞的表型、增殖活性的变化,及抗急性白血病细胞活性.方法:正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照.用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型.结果:DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P＜0.05); DC、CIK细胞共培养后,CD3+ CD8+、CD3+ CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P＜0.05);在2.5∶1-20∶1的效靶比范围内,DC-CIK共培养物对AML细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P＜0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关.结论:DC-CIK细胞的增殖能力、对AML细胞的杀伤活性均高于CIK细胞,为DC-CIK细胞免疫治疗提供了实验和理论依据.     

自体CIK细胞对化疗后晚期乳腺癌患者影响的临床对照研究

目的:评估自体CIK细胞治疗对改善化疗后晚期乳腺癌患者机体免疫力及生活质量的疗效及安全性。方法:通过开放的、非随机同期对照研究,比较自体CIK细胞治疗与一般对症治疗对化疗后晚期乳腺癌患者外周血T淋巴细胞亚群的影响,运用E-ORTC QLQ-C30生活质量测评量表分析CIK治疗前后患者生活质量改变,观察不良反应。结果:CIK治疗对化疗后晚期乳腺癌患者外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD56+T细胞亚群的升高作用优于一般对症治疗,自体CIK细胞治疗后患者临床症状、躯体功能及总健康状况较治疗前有明显改善,无严重不良反应。结论:自体CIK细胞对改善化疗后晚期乳腺癌患者机体免疫力及生活质量有较好疗效及安全性。     

重组人纤维蛋白片段诱导CIK的增殖及对肺癌耐顺铂细胞的杀伤作用

为探讨重组人纤维蛋白片段(RetroNectin)对CIK(Cytokine-induced killer cells)细胞活化、增殖的影响及CIK细胞的免疫学特性和对肺癌耐药细胞DDP-A549 (DDP: Cisplatin)的杀伤作用。提取健康人外周血中单个核细胞, Ⅰ组细胞接种于前一天用RetroNectin和CD3MAb包被好的培养瓶中, Ⅱ组接种于单独用CD3MAb包被好的培养瓶中, 接种当天加入IFN-γ, 第二天加入IL-2诱导CIK细胞。细胞计数法测定CIK细胞的增殖,并绘制细胞生长曲线, MTT法测定细胞杀伤活性,流式细胞术分析细胞表型。扫描电镜和透射电镜下观察CIK细胞对DDP-A549的杀伤和DDP-A549细胞的改变。RetroNectin对CIK细胞有很强的激活作用, 可使其细胞增殖总数达524.77倍, 其主要效应细胞CD3+CD56+可达(31.40±1.91)%; 对肺癌耐顺铂细胞DDP-A549的杀伤作用明显高于其亲代药物敏感株A549(P<0.01)。但两组CIK细胞对靶细胞的杀伤率在相同效靶比时无明显差异(P>0.05)。RetroNectin能显著增强CIK增殖活性, 但对CIK细胞的杀伤活性并无明显影响。CIK能够显著抑制DDP-A549的生长, 可用于耐顺铂肺腺癌的免疫治疗。     

化疗药物对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的影响

探讨化疗药物及地塞米松对CIK细胞增殖活性及淋巴细胞亚群的影响。分别选取不同浓度顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇和地塞米松与不同诱导天数的CIK细胞共培养,在加入或不加入IL-2的情况下,采用MTT法检测各种药物对CIK细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测CIK细胞中各亚群的比例。顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇及地塞米松均在一定程度上抑制CIK细胞的增殖活性,其中顺铂和紫杉醇表现出明显的剂量依赖性(P0.05);IL-2可对CIK细胞产生保护作用,在一定程度上降低化疗药物对CIK细胞的抑制作用(P0.05)。顺铂主要降低CD3+CD56+亚群比例(P0.05),对CD3+CD4+、CD3+CD8+亚群比例无显著影响(P0.05)。     

人外周血淋巴细胞体外诱导培养前后细胞表型与细胞毒活性相关性研究

为了分析体外细胞因子诱导培养CIK细胞过程中细胞表型的变化与其杀瘤活性的相关性及为临床过继免疫治疗提供实验依据,本研究采用体外诱导方法扩增培养正常人外周血淋巴细胞及单个核细胞,应用流式细胞术测定培养前、培养第7天和第14天的CD3~+等15种不同表型细胞百分率的变化,用CCK-8试剂检测第7天和第14天的细胞毒活性。结果显示,扩增培养后T细胞活化表型的表达和细胞毒活性在第7天最强,与其细胞表型CD3~+CD25~+、CD3~+CD28~+、CD3~+CD25~+CD28~+、CD3~+CD4~+呈正相关(P<0.05),与CD3~+CD45RA~+CD45RO~+呈负相关(P<0.05)。本研究表明测定培养细胞活化相关表型可以间接监测其杀瘤能力,为临床CIK细胞过继免疫治疗的应用提供实验依据。     

抗原负载DCs诱导的CIK细胞对B16黑色素瘤抑制作用的形态学观察

目的:探讨抗原负载树突状细胞(dentritic cells,DCs)诱导的CIK(cytokine induced killer)细胞对B16黑色素瘤的抑瘤作用。方法:分离、培养DC和CIK细胞,取部分DC进行肿瘤抗原负载,将其与CIK细胞按1:10的比例共培养3d,即为抗原负载的DC-CIK。建立B16黑色素瘤小鼠模型,分别于瘤周围皮下注射经Brdu标记的CIK、DC-CIK、抗原负载DC-CIK。按注射细胞进行分组,测量注射前后各组小鼠的瘤体积,计算抑瘤率,比较其抑瘤作用。应用免疫组化方法和透射电镜观察抗原负载DC-CIK细胞在皮肤中的分布及杀伤肿瘤细胞的形态学表现。结果:抗原负载DC诱导的CIK(细胞组抑瘤率(86.57%)高于CIK细胞组(33.34%,P<0.05)和DC-CIK细胞组(61.08%,P<0.05);光镜下抗原负载DC-CIK细胞主要分布在皮下组织,癌组织周围,特别是癌巢周边。透射电镜下抗原负载DC-CIK细胞体积大,核有切迹,细胞质内细胞器丰富,粗面内质网扩张。细胞表面有突起,与肿瘤细胞密切接触。大量肿瘤细胞凋亡、坏死。结论:CIK细胞经抗原负载DC诱导后抑瘤作用明显强于单纯CIK细胞和DC-CIK细胞。     

DCIK细胞用于肺癌临床免疫治疗

观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK 细胞)和同源树突状细胞(DC)共培养后,共培养细胞树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞(DCIK 细胞)体外细胞毒活性,并观察DCIK细胞治疗肺癌的近期临床疗效、免疫学活性及副反应.收录 12例确诊肺癌经标准治疗方案治疗的患者,取外周血分离单个核细胞(PBMC),体外诱导出DC和CIK细胞共培养后,观察DCIK细胞表型,用MTT法测体外细胞毒活性;当效靶比为20∶1、10∶1时,DCIK细胞体外细胞毒活性杀伤率分别为55%、46.2%.所有患者均接受一定剂量的 DCIK细胞过继免疫治疗,观察其近期临床疗效、免疫反应、不良反应.12例患者中完全缓解 1例,部分缓解4例,病情稳定1例,近期有效率为41.6%,疾病控制率为50%,病情进展共6例,其中死亡2例.与DCIK细胞回输前相比,患者CD4 、CD8 、CD56 均有明显的升高(P＜0.05),这表示可以诱导患者产生特异性的免疫反应.除两例患者出现一过性的发热外,其余患者基本无不良反应.DCIK细胞在肺癌免疫治疗中能诱导机体产生特异性的免疫反应,亦是新的杀伤肿瘤细胞的效应细胞,有较好的临床疗效.     

DC-CIK治疗大肠癌的研究进展

大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均较高。过继免疫治疗是当今肿瘤治疗的热点,已逐步成为一些肿瘤的首选治疗方法。树突状细胞(DC)是目前已知功能最强大的抗原呈递细胞,具有呈递肿瘤抗原和抵制肿瘤细胞免疫逃逸及刺激T淋巴细胞产生免疫应答的作用。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)由多种细胞因子诱导而成,具有T淋巴细胞及NK细胞抗肿瘤作用的特点。DC和CIK细胞有效结合可以同时促进DC细胞的增殖和免疫功能及加强CIK细胞的抗肿瘤作用。本文就近年来国内外应用DC-CIK治疗大肠癌的研究进展进行综述。     

DC 与CIK细胞治疗难治复发急性髓细胞白血病的近期临床观察

目的：评估自体DC与CIK 细胞治疗难治复发急性髓细胞白血病的近期疗效与安全性。方法：给予20 例难治复发急性髓细 胞白血病患者树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗,20 例难治复发的应用同样化疗方案的急性髓细胞白血病 患者做为对照组;治疗后4 周观察两组患者临床疗效和生存质量(KPS)评分,DC 与CIK 细胞治疗前和治疗后1 周检测T细胞亚 群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+)和细胞因子(IL-12、IL-2、IL-7、IFN-酌及TNF-琢)水平的变化。结果：①DC 与CIK 细胞 治疗组有效率和KPS评分明显高于对照组(P<0.05),所有患者的不良反应轻微,均可耐受。②DC 与CIK 细胞治疗后1 周,患者T 细胞亚群百分比和细胞因子含量较治疗前均明显升高,其中CD3+、CD3+CD56+及IL-12、IL-7 明显升高(P<0.05)。结论：DC与CIK 细胞免疫治疗难治复发急性髓细胞白血病安全有效。     

DC与CIK细胞治疗难治复发急性髓细胞白血病的近期临床观察

目的：评估自体DC与CIK细胞治疗难治复发急性髓细胞白血病的近期疗效与安全性。方法：给予20例难治复发急性髓细胞白血病患者树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）治疗,20例难治复发的应用同样化疗方案的急性髓细胞白血病患者做为对照组;治疗后4周观察两组患者临床疗效和生存质量（KVS）评分,DC与CIK细胞治疗前和治疗后1周检测T细胞亚群（CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋）和细胞因子（IL-12、IL-2、IL-7、IFN-γ及TNF—α）水平的变化。结果：（1）DC与CIK细胞治疗组有效率和KPS评分明显高于对照组（P〈0．05）,所有患者的不良反应轻微,均可耐受。（2）DC与CIK细胞治疗后1周,患者T细胞亚群百分比和细胞因子含量较治疗前均明显升高,其中CD3＋、CD3＋CD56＋及IL-12、IL-7明显升高（P〈0．05）。结论：DC与CIK细胞免疫治疗难治复发急性髓细胞白血病安全有效。     

利用草鱼CIK细胞和MTT法测定镉和铬毒性试验的优化

本文利用主要养殖鱼类草鱼的肾脏细胞系CIK为靶细胞,从MTT法的细胞接种浓度、MTT 浓度及温育时间等几个重要参数,研究了对CIK细胞应用MTT法进行化合物毒性测定的条件,并根据最适条件,测定了氯化镉(CdCl2) 和重铬酸钾(K2Cr2O6) 对草鱼CIK细胞的毒性,建立了一种利用鱼类细胞系(草鱼CIK细胞) 进行化合物毒性测定的方法。由于每种细胞系各具有不同的生物学特性及对有毒物质不同的敏感性,因此该测定方法的建立,在水产养殖环境毒理的领域中,将具有一定的应用价值。       

人类白细胞抗原半相合供者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期原发性肝癌二例

目的 观察半相合供者细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗晚期肝癌的临床疗效.方法 2 例无法手术且无法耐受化疗的晚期肝癌患者分别选取人类白细胞抗原(HLA)半相合健康供者体外培养CIK,14 d 后分次回输给相应患者,观察患者治疗前后瘤体大小、肿瘤标志物、免疫指标、临床症状、生活质量和卡氏评分等的变化.结果 2 例患者...     

番茄红素联合CIK 治疗的抗肿瘤作用的实验研究

目的:探讨番茄红素联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗的抗肿瘤作用及相应机制。方法:建立荷B16-F10黑色素瘤小鼠模型,观察联合治疗对肿瘤体积、宿主生存时间、淋巴细胞增殖活力及淋巴细胞杀伤能力的影响。结果:CIK及番茄红素治疗均可以抑制肿瘤的生长,延长荷瘤鼠的生存时间。与CIK治疗组相比较,中高剂量的番茄红素联合CIK治疗可以显著增强抗肿瘤疗效,延长荷瘤鼠的生存时间,并且可以通过刺激荷瘤鼠淋巴细胞增殖、增强淋巴细胞对肿瘤的杀伤能力提高CIK治疗的抗肿瘤疗效。结论:番茄红素能够通过提高宿主免疫水平而显著增强CIK治疗的抗肿瘤效果。     

自体CIK细胞联合化疗治疗老年急性白血病的临床疗效评估

目的:探讨自体细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞联合化疗方案治疗老年急性白血病的临床疗效。方法:采集6例在我院进行化疗治疗的老年急性白血病患者的静脉血制备自体CIK细胞,成熟后回输入体内,持续注射10天为一个疗程。观察培养前和培养13天后白细胞各亚型细胞所占百分比,并比较CIK细胞回输前后患者白细胞亚群、感染次数及输血量的变化。结果:培养后CD3~+、CD8~+、CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+亚型细胞百分比均显著高于培养前(P0.05),CIK细胞回输后患者体内CD3~+、CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+亚群细胞百分比显著高于回输前(P0.05);CIK细胞回输后,患者感染次数和持续时间均显著少于回输前(P0.05),疾病稳定期输血量显著低于回输前(P0.05),疾病进展期输血量与回输前差异无显著性意义(P0.05)。结论:自体CIK细胞联合化疗治疗老年急性白血病患者有效且安全,可维持病情的稳定、提高机体细胞免疫功能和抗感染能力,值得临床推广。     

DC-CIK对K562/A多药耐药基因mdr1表达的影响

目的：体外观察树突状细胞（dendritic cell,DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine inducedkiller,CIK）对K562/A细胞株多药耐药基因mdr1表达的影响。方法：采集健康人的外周血,分离出单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,在体外加入多种细胞因子经诱导生成DC及CIK细胞,以流式细胞仪检测其表面标志,将DC细胞内加入K562/A细胞裂解物致敏后,再与CIK细胞混合培养48小时。将致敏后的DC-CIK细胞与K562/A及K562分组培养后以荧光定量PCR检测其mdr1基因表达的情况,PBMC作为对照组。结果：RT-PCR中可见K562/A＋DC-CIK组中mdr1 mRNA表达较K562/A明显降低,经荧光定量PCR观察到K562/A内mdr1 mRNA表达为K562的10.27倍、K562/A/PBMC略低于未处理的K562/A（P〉0.05）,K562/A/DC-CIK细胞中mdr1 mRNA含量较K562/A、K562/A/PBMC少（P〈0.05）。DC-CIK细胞与细胞株混合培养后,mdr1基因表达较混合培养前明显降低。结论：实验数据显示DC-CIK可使耐药细胞株内mdr1基因表达下调。但K562与DC-CIK混合培养后该基因降低不明显,提示该基因在细胞中存在着基础表达,意义在于维持细胞内稳态。目前针对逆转白血病耐药的研究较少,需要多进行相关研究以拓宽细胞免疫治疗在逆转耐药领域的应用。DC-CIK是具有发展潜力的抗肿瘤方法。本实验将为下一阶段研究逆转耐药的机制提供依据,DC-CIK细胞免疫疗法有望成为逆转肿瘤耐药的新方法。     

树突状细胞与CIK细胞共培养诱生的DCCIK细胞群对肿瘤的杀伤作用

由树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的同源杀伤细胞(CIK)的共培养诱生的细胞群(DCCIK)对肿瘤细胞的细胞毒活性的研究。DCCIK细胞体外杀伤肿瘤靶细胞A549(MTT法),效靶比为10∶1、5∶1时杀伤率分别为61%、52%。DCCIK细胞诱导培养3周后,效靶比为10∶1、5∶1时杀伤率分别为64%和56%。数据亦表明DCCIK细胞对靶细胞的杀伤优于CIK细胞。动物体内实验分荷瘤A549、BEL7404和A375三组,每组分(A)DCCIK 化疗、(B)单用化疗。治疗20天、35天后测量各组肿瘤消失率。结果显示:DCCIK 化疗的抑瘤效果明显好于单纯化疗。提示DCCIK细胞有临床应用前景。     

自体CIK细胞治疗21例中晚期恶性实体瘤的肿瘤标志物变化观察

目的观察自体细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）过继免疫疗法治疗中晚期恶性实体肿瘤的临床疗效及肿瘤标志物变化,初步对该疗法作出评价。方法取中晚期恶性实体肿瘤患者自体外周血50ml,根据文献报道方法体外诱导扩增CIK细胞。培养约14d后,一次性回输入患者体内,观察患者CIK细胞回输前2周及回输后4周左右外周血免疫指标变化、肿瘤标志物变化、生活质量及Karnofsky评分变化,随访1年观察1年生存率。采用t检验及寿命表法进行统计分析。结果在21例接受CIK回输治疗的患者中,治疗前出现有代表意义的肿瘤标志物异常升高的患者有14例,1次回输后有8名患者出现肿瘤标志物下降,其中1名患者降至正常范围;免疫指标在CIK细胞回输后4周较回输前2周均无有统计学意义,其中CD3由70.81﹪±10.52﹪升至71.91﹪±11.09﹪,t=0.762,P=0.455;CD4由39.06﹪±11.03﹪升至39.21﹪±8.74﹪,t=0.093,P=0.927;CD8由28.75﹪±8.22﹪升至29.88﹪±10.13﹪,t=0.895,P=0.382;CD16^＋CD56^＋（即NK细胞）由15.73﹪±9.52﹪升至15.37﹪±6.66﹪,t=-0.173,P=0.865;EORTCQLQ-C30（vertion3.0）评分中总体健康状况（globalhealth）由（41.67±17.28）分上升至（46.43±17.19）分,P=0.076;以上各指标治疗前后差异均无统计学意义。但功能子量表中的躯体功能（physicalfunctioning）单项[由（62.94±17.48）分上升至（66.67±17.37）分,P=0.012]和症状子量表中的疲倦（fatigue）[由（51.33±20.03）分下降至（43.38±16.81）分,P=0.012]、疼痛（pain）[由44.44﹪±19.24﹪下降至（36.51±14.55）分,P=0.038]及食欲丧失（appetiteloss）[由（52.38±19.92）分下降至（38.09±21.82）分,P=0.016]单项差异均有统计学意义（P〈0.05）;卡氏评分由[（61.42±3.59）分上升至（62.38±4.36）分,t=1.000,P〉0.05];随访1年内有3名患者死亡,生存率约85.7﹪。结论自体CIK细胞回输治疗后肿瘤标志物有明显改变,同时对缓解晚期恶?