复合诱变选育高效转化DHEA为7α,15α-diOH-DHEA的菌株及其转化工艺优化

结合酮康唑抗性筛选法,采用亚硝基胍和低能氮离子注入复合诱变方法筛选得到一株高效生物转化去氢表雄酮(D H E A)为3β,7α,1 5α-三羟基雄甾-5-烯-1 7-酮(7α,1 5α-d i O H-D H E A)的菌株亚麻刺盘孢C o l l e t o t r i c h u m l i n i S T-1,该突变株在底物D H E A投料浓度为1 0 g/L时产物摩尔得率达到3 4.2%,较出发菌株提高了4 6.2%。在此基础上进行培养基组分的优化,采用P l a c k e t t-B u r m a n实验设计考察转化培养基中各组分对产物摩尔得率的影响,有效筛选出葡萄糖、酵母粉和M g S O4·7 H2O浓度对产物摩尔得率影响显著,继而采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并利用中心组合响应面设计实验对3个显著性因素的最佳水平进行研究,得到最适转化培养基组分为(g/L):葡萄糖2 6.3 4;酵母粉1 2.1 5;玉米浆3.0 0;F e S O4·7 H2O 0.0 1 5;M g S O4·7 H2O0.1 4;K H2P O40.9 0。采用该优化培养基,菌株C.l i n i S T-1的产物摩尔得率达到4 9.3%,较优化前提高了4 4.2%。     

工业分枝杆菌植物甾醇转化途径及菌种改造研究进展

相比于传统的化学转化法,微生物转化法在甾体药物的生产中显示出了明显的优势.利用分枝杆菌降解植物甾醇可以生成一系列甾体药物的中间体,这极大地方便了甾体药物的生产.通过基因工程、分子生物学和结构生物学等学科的技术手段,人们对甾醇转化菌株进行了深入的探索和改造.本文对工业分枝杆菌植物甾醇转化途径及菌种改造的研究进展进行了综述...     

Mycobacterium sp．高效转化植物甾醇为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的诱变选育

采用紫外线、亚硝基胍复合诱变雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）的转化产生菌Mycobacterium sp．,结合平板筛选,获得一株遗传性状稳定单产ADD的突变菌株Mycobacterium sp．-11,其ADD质量浓度达到1246ms／L,比原始菌株（484mg／L）提高了150％,经初步优化后发酵液中ADD最高达到1430mg／L,发酵液中ADD质量占ADD、AD两产物质量总和的比例由70％提高到99．1％。     

3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9α-羟基雄烯二酮的制备

9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD)是制备甾体类药物的重要中间产物。3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)能够转化雄烯二酮(AD)产生9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD),该酶由Ksh A和Ksh B两个亚基构成。为获得高效积累9-OH-AD的重组菌株,本研究选择耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc2155和戈登氏菌Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395,对其在胆固醇为唯一碳源条件下表达明显上调的ksh A和ksh B候选基因进行克隆,插入到分枝杆菌表达载体p NIT中,构建共表达质粒,并将它们导入分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805中,获得重组菌株。利用重组菌株分别对植物甾醇、胆固醇和谷甾醇进行生物转化,分离纯化转化产物,采用光谱学方法鉴定其化学结构,确定该转化产物为9α-羟基雄烯二酮,说明分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805由积累雄烯二酮变为积累9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD),进而证明导入的候选基因ksh A和ksh B确实为有功能的基因。生物转化实验表明,与胆固醇、谷甾醇相比,植物甾醇作为底物更易于转化;而用来源于耻垢分枝杆菌的ksh A、ksh B构建的重组菌转化率更高,可达90%,具有较高的应用价值。本研究通过对KSH编码基因的异源表达,成功地进行了分枝杆菌生物转化特性的改造,为探索各种甾体药物中间体的工业生产奠定了基础。     

分枝杆菌LY-1转化植物甾醇产9α羟基雄烯二酮的发酵工艺优化

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可用于糖皮质激素类药物的生产。为了提高目的产物的产量,以分枝杆菌(Mycobacterium sp.) LY-1作为出发菌株,研究不同碳源、氮源、磷酸盐和金属离子等培养基组分对菌株LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响,结合正交试验优化,确定最适培养基组分为玉米浆30 g/L、KNO_3 4.0 g/L、NaH_2PO_4 1.2 g/L、FeSO_4 0.075 g/L及CaCl_2 0.10 g/L。在此条件下,当植物甾醇投料质量浓度为15 g/L时,产物得率达到43.9%～44.9%。通过单因素实验优化培养条件,得到最适培养条件为pH 8.0、接种量2%、温度30℃时,9α-OH-AD的得率可达46.2%～47.0%,比优化前提高了22.1%,产量达到5.21 g/L,具有潜在的工业应用价值。     

白果中植物甾醇的提取优化及体外释放研究

目的：优化白果中植物甾醇的提取并考察其体外释放情况。方法：以白果为原料,以乙醇为提取溶剂,使用超声波辅助提取法,在单因素试验的基础上,通过正交试验优化了白果中植物甾醇的提取工艺,进一步通过体外模拟消化试验,分析了添加油脂、热处理方式、物料粉碎程度对甾醇体外释放的影响。结果：超声时间、料液比、超声功率均影响甾醇的提取率。超声功率对提取率具有显著影响,最佳工艺为超声时间6 min、料液比1∶15 g/mL、超声功率350W,此时可得最大甾醇提取率为0.878 mg/（g·dw）。体外模拟消化试验证明,添加油脂、热处理方式、物料粉碎程度均对植物甾醇的体外释放具有显著影响,当使用微波加热处理时,甾醇的释放情况最佳。     

降胆固醇植物乳杆菌的紫外诱变选育

通过对植物乳杆菌进行紫外线诱变处理,采用胆固醇梯度平板的初筛方法和体外降胆固醇能力的测试,结果得到二株降胆固醇能力强且性能比较稳定的植物乳杆菌突变菌株Lp-UVs 29和Lp-UVs 44,胆固醇的降解率分别为48.7%和44.2%,分别比诱变前提高了97.97%和79.67%.     

植物甾醇保护胃粘膜及抗消化道肿瘤的研究进展

天然产物是新药发现的重要来源,具有多途径、多层次、多靶点和多种生物活性的特点。植物甾醇作为其中一类重要的甾体类化合物,种类繁多,分布广泛,药理活性显著,是一种多功能活性因子,具有保护胃黏膜、抗炎、抗癌、降低胆固醇、抗氧化等功效。胃黏膜损伤是世界范围内的常见病和多发病,几乎所有人在一生中都罹患此疾病,寻找具有保护胃黏膜功能的生物活性物质,已成为人类关注的热点话题之一。本研究概述植物甾醇的理化性质、药理活性及其安全性,并阐述植物甾醇保护胃粘膜及抗消化道肿瘤的活性,为植物甾醇功能性食品、药品地进一步开发提供理论依据。     

响应面法优化火龙果茎甾醇的提取及纯化工艺研究

以火龙果茎为原料,研究火龙果茎甾醇的提取及精制工艺.利用响应面分析法对火龙果茎甾醇超声提取工艺进行优化.结果表明:超声波辅助提取火龙果茎甾醇的最佳工艺条件为提取时间57 min、超声功率143 W、液料比12∶1 (mL/g)、温度53℃,甾醇得率为2.693％‰.通过正交试验确定火龙果茎甾醇精制的最佳条件为:液料比为4∶1(mL/mg),结晶初始温度为55℃,养品时间为18h,此条件下火龙果茎甾醇的纯度达到87.6％.     

植物中甾醇糖基转移酶的研究进展

甾醇(sterol)是植物细胞膜结构和天然植物激素的重要组成成分。甾醇糖基转移酶(sterol glycosyltransferases,SGTs)作为糖基转移酶一号家族(GT family 1)较为保守的一支,是一类参与甾醇下游修饰的酶,具有调控植物初期生长发育、信号转导、次生代谢产物合成以及响应生物、非生物胁迫等生物学功能。本文主要综述了SGTs在植物生长调控、生物合成、早期发育研究的进展,最后讨论了甾醇糖基转移酶在工业生产药用活性分子方面的前景和主要限制,旨在为更深入开展甾醇糖基转移酶的研究和应用提供参考。     

植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展*

微生物选择性降解植物甾醇侧链获取甾体药物合成的重要中间体雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)对于我国制药行业具有重要意义。现存文献资料对该领域缺乏全面系统的分析总结,从甾醇侧链微生物转化的机理、途径及其收率的影响因素等几个方面综述了近几年的研究进展,并对此领域的发展趋势进行了展望。     

构建CRISPR-Cas9介导的耻垢分枝杆菌基因组高效删除系统

【背景】耻垢分枝杆菌具有生长迅速和非致病性的特点,可作为结核分枝杆菌致病机理研究替代菌株和类固醇激素生产的工程菌,但目前耻垢分枝杆菌中缺乏高效率的基因组敲除方法。【目的】基于CRISPR-Cas9介导的定点、高效的DNA切割能力,构建耻垢分枝杆菌染色体DNA片段无痕敲除系统。【方法】构建了包含四环素诱导型启动子驱动的密码子优化的cas9基础载体pCas9101,在双侧同源臂长度约为1 kb条件下选用合适的gRNA表达模块,分别测试了对耻垢分枝杆菌mc2155染色体上的3β-羟基类固醇脱氢酶基因(MSMEG_5228,1 071 bp)和胆固醇降解基因簇(MSMEG_5990-MSMEG_6043,约48kb)敲除效率,使用相同大小的同源臂以经典p2NIL-pGOAL方法进行对照,并计算效率。【结果】使用CRISPR-Cas9方法对耻垢分枝杆菌mc2155的3β-羟基类固醇脱氢酶基因敲除效率为22%,胆固醇降解基因簇敲除效率也达到18%,两者连续敲除效率为4%。但对照p2NIL-pGOAL方法未能获得目标DNA片段敲除的菌株。【结论】本文建立的基于CRISPR-Cas9的耻垢分枝杆菌基因组无痕敲除系统显示出较高的敲除效率,该方法可为耻垢分枝杆菌后续研究提供快速高效的基因组操作方法。     

ARTP诱变选育环孢菌素A高产菌株及发酵工艺优化

采用常压室温等离子体技术(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)对雪白白僵菌FIM-1809菌株进行诱变,得到一株遗传稳定性较高的突变高产菌FIM-1809-7,其产环孢菌素A能力较初始菌株提高约39%。通过单因素和正交设计试验优化,确定最佳发酵培养基组分及培养条件为：玉米浆粉6%、可溶性淀粉12%、葡萄糖1.2%、蛋白胨2%,pH 5.6,菌种菌龄为72 h,接种量10%,装液量70 m L/500 m L,发酵时间8 d,最终突变菌株产环孢菌素A效价较出发菌种增加了约53%。结果表明,采用ARTP技术结合发酵条件优化能够有效提高雪白白僵菌产环孢菌素A的能力,为该菌株的工业化应用奠定了良好的基础。     

高效降解棉酚菌株的分离鉴定及诱变选育

作为一种蛋白资源, 棉籽粕因其含有毒素——游离棉酚限制了其在饲料工业中的应用。为获得能高效降解棉籽粕中棉酚的菌株, 以醋酸棉酚为唯一碳源培养基从16份样品中筛选出一株高效降解棉酚菌株(Y-2), 经生理生化及18S rDNA鉴定为Pichia guilliermondii, 此菌种为非致病酵母, 且首次报道用于棉酚的降解, 在工业生产中具有潜在的应用前景。通过紫外诱变获得一株棉酚降解率更高的突变株YUV-51。通过对突变株YUV-51发酵温度、时间及接种量的初步优化, 获得其固态发酵优化条件: 30 °C培养48 h, 接种量0.025 g湿菌体/g棉籽粕, 初始水分含量50%。为避免游离棉酚在前处理中大量降解棉籽粕, 不进行湿热处理, 经接种发酵后脱毒率可达到58%。这使微生物脱毒在实际生产中应用成为可能。     

α-亚麻酸甾醇酯的理化特性及氧化稳定性研究

本文研究了采用无溶剂直接酯化法合成得到的α-亚麻酸甾醇酯的理化特性、脂溶性、结晶特性、油脂氧化稳定性。结果表明,α-亚麻酸甾醇酯具有理想的理化特性,酸价和过氧化值分别为1.2 mg KOH/g和0.56meq/kg,反式脂肪酸含量小于0.1%,在不同植物油脂中的溶解性达到30%以上,结晶温度区间在-25.9～-29.6℃之间。α-亚麻酸甾醇酯在大豆油、油菜籽油和亚麻籽油中的浓度分别小于0.1%、0.1%和0.3%,油脂的氧化诱导时间随浓度增加而增加。因此α-亚麻酸甾醇酯良好的理化特性表明其在不同形态食品、保健品和医药产品等中将具有较广的应用范围,是一种具有较高营养价值的功能性食品添加剂。     

以分枝杆菌为底盘细胞生物合成甾药中间体的<研究进展

甾体药物(steroid drugs)是一类具有重要生理和药理作用的药物。目前，甾药行业主要通过分枝杆菌(Mycobacteria)转化制备系列重要甾药中间体，再经过必要的化学修饰或酶法修饰获得高端甾体药物。较之前的“薯蓣皂素-双烯醇酮”体系具有原料廉价且来源丰富、生产成本低且反应路线短、收率高且环境友好等优点。基于基因组学和代谢组学进一步揭示分枝杆菌甾醇降解途径中关键酶系及其催化机理，使分枝杆菌作为底盘细胞成为可能。本文对不同物种类固醇转化酶的发现、分枝杆菌自源基因和异源基因过表达的改造以及分枝杆菌作为底盘细胞的优化和修饰等方面的研究进展进行了综述。     

解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产α-酮戊二酸条件优化

对具有发酵产α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)ZY-4进行了紫外诱变和NTG诱变育种,筛选得到产量提高的突变株,并对突变株的发酵培养基进行了优化,结果表明,紫外诱变和NTG诱变后筛选到的突变株分别比原始出发菌株产量提高了67.8%和110%。优化后发酵培养基成分为甘油8%,氯化铵5.0 g/L,硫胺素1.0μg/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,七水硫酸镁0.5 g/L,培养基优化后α-酮戊二酸产量比原始出发菌株提高了232.4%。     

三羟基雄甾烯酮高转化菌株的选育及工艺优化

以能将去氢表雄酮 (DHEA) 转化为三羟基雄甾烯酮 (7α,15α-diOH-DHEA) 的赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1为出发菌株,对其进行了诱变选育及工艺优化,以期提高转化效率。采用0.12 mg/mL亚硝基胍诱变处理赤霉菌孢子悬液30 min,以350 μmol/L酮康唑为最低抑制浓度进行抗性平板筛选,最终获得一株遗传稳定性较好的高产菌株M-10,其产物摩尔得率达到70.2%,为出发菌株的1.2倍。通过摇瓶转化工艺的优化,确定了突变菌株的最适转化工艺。在优化的转化工艺下,当底物DHEA投料浓度为5 g/L时,7α,15α-diOH-DHEA摩尔得率提高到75.6%,较原始菌株提高了31.3%。     

分枝杆菌Mycobacterium sp. NwIB-01 3-甾酮-9α-羟基化酶基因的克隆、异源表达及分离纯化

3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是微生物甾体降解途径中的关键酶,在甾体药物制备中有重要价值。以本实验室从土壤中自行筛选的分枝杆菌Mycobacterium sp.NwIB-01为出发菌株,利用红平红球菌Rhodococcus erythropolis SQ1已报道的ksh序列与已全基因组测序的分枝杆菌序列数据库进行比对分析,根据同源基因设计简并引物获得部分ksh序列,通过染色体步移扩增出全长ksh(命名为M.S.-ksh),该基因与耻垢分枝杆菌M.smegmatis mc2155的ksh同源性为85%。构建pET32-ksh表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高表达重组转化子菌株,经IPTG低温诱导,SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,用Ni2+亲和层析柱纯化,纯度达90%以上。本研究为利用基因工程菌进行工业化生产甾体药物奠定了基础。     

产γ-聚谷氨酸菌株的诱变选育及其种子液工艺优化

以已筛选的1株产γ-多聚谷氨酸解淀粉芽胞杆菌C1为出发菌株,对其进行紫外线-亚硝基胍(NTG)复合诱变,并运用单因素试验和正交试验设计对诱变菌株的种子培养工艺进行优化。通过复合诱变选育得到1株能够稳定遗传的正突变菌株C1-6,其摇瓶发酵生产γ-PGA的产量由18.4 g/L提高到24.2 g/L,增加了31.5%,且传代8次后仍能保持稳定。通过单因子试验筛选到玉米粉和黄豆粉作为C1-6生长的C源和N源。正交试验后,C1-6在成分为K2HPO41.0 g/L、Mg SO40.5 g/L、黄豆粉15.0 g/L、玉米粉5.0 g/L,p H 6.5的培养基中,37℃、装液量1/5(150 m L三角瓶装液30 m L)的培养条件下可获得较大的生物量,OD600达到6.31。