肺炎克氏杆菌的nifA基因产物在巴西固氮螺菌中的功效

通过三亲本杂交将质粒pCK3{携带改变了启动子的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneuma-niae)nifA 基因]引入巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62菌株中,由此获得的转移接合子巴西固氮螺菌Yu62-4菌株在6．0 mmol/L以上NH+4浓度下,能表现出微弱的固氮酶活性(相当于无NH+4时活性的0．3-0．5％),而野生型Yu62则全部丧失固氮酶活性。固氯酶的丙烯酰胺凝胶电泳和铁蛋白的免疫杂交实验表明,转移接合子Yu62-4在高NH+4(50mmol／L)下,虽有铁蛋白合成,但合成量比无NH+4时少得多,而且有一部分铁蛋白未被共价修饰;野生型菌株Yu62在此NH+4浓度下无铁蛋白合成。实验结果表明：外源(来自肺炎克氏杆菌)的基因产物在巴西固氮螺菌Yu62中不能有效地解除NH+4对该菌固氮酶合成的阻遏作用。本文分析了出现这种现象的原因。     

巴西固氮螺菌Yu62在玉米根的定植

将GFPmut2质粒中的gfp基因 (编码绿色荧光蛋白)克隆到载体pVK100中,构建成重组质粒pVK1001.将pVK1001通过电转化方法导入到联合固氮菌巴西固氮螺菌Yu62中,获得GFP标记的巴西固氮螺菌Yu62菌株.用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米(农大3318)幼苗,在接种后8 d、12 d,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测,结果表明巴西固氮螺菌Yu62菌株能定植于玉米根部皮层的薄壁细胞间隙.用扫描电镜和超薄切片电镜观察表明,大多数细菌主要定植于根表,少数菌可进入玉米根组织内.     

巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.     

巴西固氮螺菌Yu62的EGFP标记及其在小麦体内的定殖研究

以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP.利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株.用EGFP标记菌接种小麦'小偃107'种子,室内限菌条件下培养10 d后,用荧光显微镜观测标记菌在小麦体内的定殖规律并观察接菌植株的田间生长状况.结果显示,巴西固氮螺菌Yu62能定殖于小麦根毛区、茎组织的细胞间隙等部位,而且接菌小麦'小偃107'植株在根系发育、株高、分蘖数等方面比对照有较明显的优势.研究表明,巴西固氮螺菌Yu62能够定殖于小麦根茎内,并具有促进植物生长的作用.     

巴西固氮螺菌Yu62在玉米根的定植

将GFPmut2质粒中的gfp基因(编码绿色荧光蛋白)克隆到载体pVK100中,构建成重组质粒pVK1001。将pVK1001通过电转化方法导入到联合固氮菌巴西固氮螺菌Yu62中,获得GFP)标记的巴西固氮螺菌Yu62菌株。用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米(农大3318)幼苗,在接种后8d、12d,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测,结果表明巴西固氮螺菌Yu62菌株能定植于玉米根部皮层的薄壁细胞间隙。用扫描电镜和超薄切片电镜观察表明,大多数细菌主要定植于根表,少数菌可进入玉米根组织内。     

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巴西固氮螺菌Yu62 nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD－PCR法克隆了巴西固氮螺菌（Azospirillun brasilense)Yu62和nifA基因。序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源（96．5％）,其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97．6％。该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA^-突变株的Nif^-表型。研究了NH4^ 和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响。结果表明：nifA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl4与微氧（0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%-0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性。     

巴西固氮螺菌ntrBC基因的克隆与核苷酸序列分析

以EMBL3为载体,构建了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的基因文库.以巴西固氮螺菌Yu62中PCR扩增出的450bp DNA 片断作为探针,对该基因文库进行筛选,得到了10个阳性克隆(EA1—EA10),其中含有两种不同类型的克隆,分别以EA4和EA9为代表.对EA4的杂交分析发现目的基因位于2.9kb EcoRI片段上.DNA序列分析结果表明该片段含有完整的ntrC编码区,其编码产物由480个氨基酸组成.分子量为53469;ntrC上游是完整的ntrB编码区,其编码产物由400个氨基酸组成,分子量为43487.对相应的NtrC和NtrB氨基酸序列进行同源性分析,说明巴西固氮螺菌与根瘤菌的亲缘关系较与其它自生固氮菌的更为接近.     

肺炎克氏杆菌NifA对巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用

用PR方法克隆了巴西固氮螺菌Yu62 nifH的启动子片段,DNA序列分析表明菌株Yu62与标准菌株sp7之间的DNA序列差异很小。利用启动子探针质粒载体pcBl82,构建了3个不同的nifH：：lacz转录融合质粒,在大肠杆菌中分别测定肺炎克氏杆菌NifA对它们的转录激活作用。结果表明巴西固氮螺菌nifH启动子的转录是依赖于NifA的,缺失了上游激活序列的启动子不能被NifA激活转录,肺炎克氏杆菌NifA对其自身nifH及巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用并无很大差异。     

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巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒及nifHDK基因的定位

对从北京郊区玉米根际分离到的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilente)Yu 62的质粒进行了分离和检测,发现检测方法不同,得到的质粒数目也不同,用Kado法只发现一个大质粒,以pABm 1表示,其分子量约为1 20 Md;而用改良的Eckhardt方法,则发现有5个大质粒,分别以p&Bm l、pABm 2、pABm 3、pABm 4和pABm 5表示,它们的分子量分别约为120 Md、330 Md、360 Md、480 Md和900 Md,部是巨型质粒,用多种方法检测均未发现小质粒。应用生物素标记的孩酸杂交技术制备了Biotin-nifHDK探针,并对Yu62菌株的质粒及染色体片段进行了Southern印迹杂交和斑点杂交,杂交结果表明nifHDK基因定位于染色体上。     

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共姗理论陆晓涛等:生抱班放线菌及其他属菌的甲基蔡醒。微 生物学报,31门):l,1991。娜替华:晌豆根瘤胞间细菌的扩展及其“前途”。微生 物学报,31(1):,,1991。张玉英等:甲烷权化细菌812中与甲醇氧化有关基 因的克隆。微生物学报,31(1):12,19,l。邵煌等:霍乱弧菌脂多塘基因在大肠杆菌中的克 陇。微生物学报,3.(1):19,1991。齐义腆等:昆虫病毒多角体蛋白基因的克隆及其在大 肠杆菌中的表达。微生物学报,31(1):25,1991。张亚梅等:用DNA杂交技术检测临床分离株的四种 耐四环素基因。微生物学报,31(l):36,l,910贺延龄等:一个水解纤维素的嗜热厌…     

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生物固氮

961447 肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮螺菌固氮基因表达的铵调节中的作用[中]/何路红…//生物工程学报.-1995,11(4).-385～388 按三亲交配法将pCK3转入巴西固氮螺菌UB3     

巴西固氮螺菌Yu62glnB基因的克隆及其功能分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中,筛选到glnB基因的阳性克隆,将3.7kb/EcoRI PstI的阳性克隆亚克隆到pUC19中,进行了全序列分析,其在GenBank中的登记号是AF323960。DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因,glnB基因下游是编码谷氨酰胺合成酶（GS）的glnA基因,glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF。glnB基因编码区长336bp,编码112个氨基酸,与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分别高达71%、77%、79%和69%。将卡那霉素抗性片段（Km-cassette)插入glnB基因的BglII位点,通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中,通过同源重组,获得GlnB^-突变株（glnB::Km）。为进一步分析glnB基因的功能,将glnB基因的编码区（339bp）构建在pVK100中,置于Km启动子下组成型表达,形成重组质粒pVK-II。将重组质粒pVK-II转入到GlnB^-突变株,构建成互补株C-glnB(glnB:Km/glnB)。对GlnB^-突变株和互补株的固氮酶活性和生长性能的测定表明,GlnB^-突变体无固氮酶活性,即表型为Nif^-;而互补株像野生型菌株一样具有固氮酶活性。突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同。将含有glnB基因的重组质粒pVK-II分别转移到野生型Yu62菌株和具有一定抗铵能力的DraT^-突变标中,使glnB基因的拷贝数增加,并进一步比较它们的固氮酶活性,结果表明多拷贝的glnB基因能显著提高固氮酶活性。     

巴西固氮螺菌中P_Ⅱ和P_Z在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌 (Azospirillumbrasilense)中 ,glnB和glnZ是两个高度同源基因 ,分别位于 3 7kb EcoRI+PstI和 3 7kb SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒 (Kmr cas sette)插入法 ,对glnB和glnZ分别进行定位诱变 ,并获得相应的突变株 ,即glnB- 和glnZ- 。研究表明 ,glnB- 突变株丧失固氮酶活性 ,表现为Nif- ,而glnZ- 象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能 ,将glnB和glnZ分别构建在pVK1 0 0载体上形成重组质粒pVK -Ⅱ和pVK -Z ,对glnB- 和glnZ- 突变株进行互补实验 ,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性 ,而glnZ无此作用。同时 ,通过三亲接合法将pVK -Ⅱ和pVK -Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT- 突变株中 ,使glnB和glnZ的拷贝数增加 ,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因 ,能显著提高固氮酶活性 ,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时 ,将pVK Ⅱ和pVK -…