我国首株猪盖他病毒的分离与鉴定

盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种广泛分布于欧亚大陆及澳大利亚北部太平洋沿岸的人兽共患虫媒病毒,我国目前各地仅从蚊子中分离到该病毒。本研究在对一猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)流产胎儿进行多重RT-PCR检测时,由检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一对引物扩增出一非特异性条带,测序及在NCBI数据库中BLAST结果显示,该序列与GETV序列高度相似。经病毒分离、传代、蚀斑纯化,获得一株能够在Marc-145细胞上稳定生长的分离物。电镜观察显示,该病毒有囊膜及纤突,直径约70 nm,接近于球形,具有披膜病毒科甲病毒属成员的典型形态特征,将该分离物命名为HNJZ-S1株盖塔病毒(Getahvirus)。全基因序列分析结果显示,分离物HNJZ-S1基因组全长11 689 bp,与GenBank中现有14株GETV序列相似性为97.4%～99.3%,其与韩国猪源毒株AY702913(登录号AY702913)序列相似性最高(99.3%)。遗传进化分析显示,HNJZ-S1与日本蚊源毒株12IH26、马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中国蚊源毒株HB0234亲缘关系最近,处于同一进化分支。其E2基因推导的氨基酸序列分析结果显示,HNJZ-S1与韩国猪源毒株AY702913和QIAG9302以及日本马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2和中国蚊源毒株HB0234等处于同一进化分支。本研究首次从我国发病猪群中检测并分离到GETV,也是迄今为止中国唯一一株来自脊椎动物的盖他病毒,对猪源GETV的感染谱和致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究具有重要意义,并为之提供了宝贵的研究素材。     

中国4省猪场猪盖他病毒感染调查及病原分离鉴定

为了解我国猪盖他病毒(Getah virus,GETV)流行情况,本研究利用RT-PCR和病原分离方法在国内首次对晋、冀、豫、皖4省231个猪场的801份猪脏器和组织进行GETV的病原学调查及部分基因序列分析。试验结果显示,从4省的猪群样品中均检出GETV,其中从231个猪场中32个阳性养殖场的病料中检出37份阳性样品,猪场阳性率为13.9%,样品阳性率为4.62%,并首次从种公猪精液中检出GETV。对该病毒Cap和NSP3基因扩增产物的进行序列分析,发现目前中国猪群中的GETV与日本近年猪源、马源及蚊源毒株亲缘关系最近,其次中国近年蚊源和韩国猪源毒株;遗传进化分析显示49个已知序列的GETV可分为3个群或谱系,其中75.5%的毒株属于2000年以后报道的Ⅲ群,具有明显的地域和年代特征且未发现物种特征。从样品中分离出两株GETV HNNY-1和HNJZ-S2,其全基因组均为11 689bp,且与Cap和NSP3基因序列分析结果基本一致,均与2012年以来的所有日本毒株亲缘关系最近。本研究首次揭示在我国4省份猪群中均有GETV存在且种公猪也可带毒,应引起人们重视。鉴于国内外目前均把该病毒看作是人兽共患病病原,因此有必要对其在中国猪群中的感染谱、传播途径、流行规律、致病性及防控措施等进行深人研究,为实时了解其在人畜间的感染和流行情况、制定有效防控措施提供科学依据。     

家养野猪源猪圆环病毒2型安徽株的分离鉴定及其全基因组序列分析

目的对安徽省临诊疑似PMW S家养野猪病例进行猪圆环病毒2型(PCV2)分离鉴定,并对分离株的全基因组进行克隆与序列分析。方法应用PK-15细胞进行PCV2的分离与增殖,根据PCR、IFA、电镜技术进行PCV2分离株的鉴定,克隆分离株的全基因组,并对序列进行分析。结果获得1株来自安徽家养野猪源PCV2分离株,命名为YZ0901。该毒株全基因组长为1 767 bp,属于PCV2b基因型。与GenBank已发表的国内外参考毒株的同源性介于93.9%~99.2%,与安徽分离毒株彼此之间的同源性介于93.4%~99.5%。结论安徽省家养野猪中存在PCV2感染,分离毒株与家猪源病毒差异不大,PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性,家养野猪源PCV2的基因型与当地PCV2流行株的基因型密切相关。     

四川省鸭坦布苏病毒的分离鉴定及遗传进化分析

本研究从四川省什邡市某发病养鸭场采集到疑似鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染的病料,将病料组织研磨,无菌处理后接种鸭胚连续传代培养,分离获得一株病毒,并通过PCR鉴定以及电镜形态观察,确定该分离株为黄病毒属坦布苏病毒,命名为SCS01。将SCS01株全基因组进行PCR分段扩增测序发现,SCS01株全基因组全长为10 992bp。在线BLAST比对检索,结果显示,SCS01株全基因组与国内鸭源坦布苏分离株同源性最高可达97.94%,进化树分析显示,SCS01株属于中国流行I群毒株,与多数分离自北方地区的中国II群毒株相比,具有较为明显的地方特性。分离株与所有参考毒株的E基因核苷酸和氨基酸相似性均在90%以上,其中与重庆分离株CQW1的相似性最高。这一鸭源坦布苏病毒的分离及其全基因组的测定为进一步探究坦布苏病毒的地区流行提供了材料。     

山东省猪圆环病毒2型的分离鉴定及其ORF2基因遗传进化分析

该研究对山东省某猪场疑似患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的病猪进行了临床病理学检测和病理组织切片观察。PCR检测阳性的病料处理后接种PK-15细胞,通过连续传代培养分离到一株猪圆环2型病毒(porcine circovirus type 2,PCV2)(SDWF20107),并对其进行ORF2基因扩增、遗传进化分析以及氨基酸突变位点分析。序列分析表明,该毒株与其他参考毒株的核苷酸相似性介于77.2%~99.6%之间,氨基酸相似性介于82.1%~99.6%之间;分离株与2.1d亚型的毒株位于同一分支,表明分离毒株属于2.1d亚型。根据流行毒株的特征,该猪场改用高效圆环2型病毒疫苗并调整了免疫程序,使该猪场患病猪群症状很快消失,恢复正常生产水平。该研究结果为猪场中PCV2的基因分型及其变异情况提供了参考资料,也为今后PMWS的流行病学研究和防控提供理论依据。     

猪Ⅱ型圆环病毒浙江株的分离及全基因组结构分析

用PCR方法对从浙江省猪场收集的、以淋巴结肿大和生长迟缓为特征的患猪腹股沟淋巴结进行PCV2检测.将检测为阳性的病料研磨、离心、过滤除菌后,接种PCV-free PK-15细胞进行病毒分离,分离获得3株病毒,命名为HZ0201、HZ0202、NB0301.PK-15细胞增殖所得病毒离心纯化后,在电镜下可观察到直径约为17～20nm,呈二十面体对称的病毒粒子.以组织和病毒的细胞DNA为模板进行PCV2的全基因扩增,测序结果显示,3株病毒分离物全基因序列均由1767bp组成,直接来自病料与细胞分离毒株的核苷酸同源性为100%.基因组内含有11个ORF.通过比较发现,分离毒株与PCV2参考株的同源性介于94.2%～99.7%之间;与PCV1参考株的同源性为77.2%～77.9%.     

浙江地区鼬獾和犬源狂犬病病毒分离株全基因组测序与分析

测定浙江地区狂犬病病毒分离株(鼬獾和犬)全基因组序列,从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析,了解狂犬病病毒在浙江的流行和变异情况以及目前浙江流行株的遗传学背景,以丰富中国狂犬病病毒街毒流行株的全基因组信息。脑内接种1~2日乳鼠分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定浙江地区狂犬病病毒分离株全基因组核苷酸序列,并进行编码蛋白和序列相似性比较及种系发生分析。测序获得狂犬病病毒浙江淳安鼬獾分离株F02、F04和松阳犬分离株D01、D02全基因组核苷酸序列信息:基因组全长11 923和11 925 nts,前导序列Leader长58nts,5个ORF为:NP(1 353 nts);PP(894 nts);MP(609 nts);GP(1 575 nts);LP(6 386 nts),N-P-M-G间隔序列长2、5、5 nts;G-L基因间的伪基因Ψ长423 nts;Trailer尾长70 nts。核酸BLAST及多重序列比对分析显示浙江地区4个狂犬病病毒分离株的全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征;中国毒株之间特别是浙江同种动物狂犬病病毒之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高,浙江病毒全基因组序列编码蛋白氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变;浙江病毒负链RNA基因组5个基因编码氨基酸的长度没有变异,5个编码蛋白仅表现较少的序列变化;浙江病毒与本研究选择的代表性引用街毒株或者来自街毒的减毒株的变异位点和变异类型相似,多重序列相似性的比较和种系发生分析显示所分离的狂犬病病毒浙江街毒株均属于基因1型,具有较独特的中国地域性特点,故本研究中的浙江地区分离株极有可能是自然界中固有的街毒株。     

猪伪狂犬病病毒流行株HLJ-01的分离鉴定及致病性分析

【背景】自2011年以来,猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)发生变异,经典的疫苗株已不能完全抵抗PRV变异株的感染,国内多个猪场出现伪狂犬病的暴发,PRV变异毒株开始在我国大规模流行。【目的】通过分离PRV流行变异毒株,并对其进行遗传进化和致病性分析,为PRV流行病学调查及疫苗研制提供实验数据。【方法】采集黑龙江某猪场感染PRV的脑组织病料,根据GenBank PRV gE和gB保守序列设计引物,进行PCR鉴定。通过对gE和gC基因进行序列测定和遗传进化分析。利用BHK-21细胞分离病毒,采用噬斑纯化方法对病毒进行纯化。通过电镜、间接免疫荧光对病毒进行鉴定,测定病毒生长曲线并进行致病性研究。【结果】经PCR和测序鉴定分离株为PRV流行株,将其命名为HLJ-01。遗传进化分析结果显示,该分离毒株与我国近几年分离的流行变异株位于同一分支;氨基酸序列分析结果显示,gE和gC存在国内流行变异株的特征序列,表明该分离毒株为流行变异株。生长曲线显示,分离株HLJ-01在感染48h时滴度最高(10^8.5TCID₅₀/mL)。电镜观察结果显示,病毒颗粒直径约150nm,呈球形,有囊膜,囊膜外有放射状纤突,呈现典型PRV病毒特征。动物感染实验结果显示,10^7.0TCID₅₀剂量感染组死亡率为100%;10^6.0TCID₅₀剂量感染组死亡率为80%;10^5.0TCID₅₀剂量感染组死亡率为60%。仔猪在接种病毒后均出现PRV感染的典型症状和病理变化,证实分离毒株对仔猪有较强致病力。【结论】分离获得一株猪伪狂犬病毒,经鉴定该分离株为流行变异株,而且具有较强的致病力,这为PRV流行病学分析及疫苗候选株的筛选奠定了基础。     

22株猪圆环病毒2型安徽分离株全基因组遗传进化分析

为了解安徽地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学及流行毒株遗传变异情况,本研究应用DNA Star软件,针对22株PCV2安徽分离株和26株GenBank登录的PCV2参考毒株,进行全基因组核苷酸序列、ORF1和ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性分析,并运用MEGA 6.0软件构建系统进化树.结果显示,22株PCV2安徽分离株基因组全长均为1 767 bp,相互之间的核苷酸序列相似度为94.6％～99.8％,与GenBank登录的26株PCV2参考毒株之间的核苷酸序列相似度为92.4％～99.8％.PCV2安徽分离株的ORF1核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与参考毒株之间的相似度分别为94.3％～100％和85.4％～100％,ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列相似度分别为85.9％～99.9％和76.9％～100％.ORF2编码的Cap蛋白氨基酸序列在8～30、44～91、121～140及190～224几个区域存在突变,且有部分变异位点位于抗原表位区.22株PCV2安徽分离株分布于两个基因亚型,8株属于PCV2b,14株属于PCV2d.结果表明,PCV2安徽分离株的全基因组核苷酸序列较稳定且彼此间亲缘关系密切.ORF2的变异程度远高于ORF1,PCV2d基因亚型己经逐渐过渡成为安徽地区的主要流行毒株.Cap蛋白氨基酸序列在免疫反应区域内的变异可能影响PCV2的免疫原性.本研究结果丰富了安徽地区猪圆环病毒病的分子流行病学资料,同时也为有效防控该病提供了一定的参考依据.     

一株马冠状病毒的分离鉴定及遗传演化分析

马冠状病毒病是由马冠状病毒(equine coronavirus, ECoV)引起的一种马新发胃肠道病毒病,成年马感染后主要出现发烧、腹痛和腹泻等症状。1975年,马冠状病毒感染首次在美国出现,此后在多个国家和地区均有流行,此前我国仅从山东腹泻驴的小肠样品中分离得到了一株重组马冠状病毒。【目的】了解ECoV中国毒株的基因组成、亲缘关系以及生物学特性,可以为我国ECoV流行现状和遗传演化趋势提供依据,为ECoV防控产品的研发提供材料。【方法】对湖北省武汉市黄陂区腹泻马匹的粪便样品进行RT-PCR检测,对检测阳性样品进行病毒分离,并利用靶向ECoV S1蛋白的单克隆抗体通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)对分离的病毒进行验证。根据ECoV-JL株全基因组测序结果,对全基因组、N基因和NS2基因进行了基因组系统发育分析和同源性比较。【结果】成功分离到一株ECoV,并命名为ECoV-JL。透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察分离到的病毒颗粒呈球状,且具有囊膜和冠状病毒典型的纤突结构。该分离株感染HRT-18细胞72 h后病毒滴度可到达峰值,半数组织培养感染剂量(tissue culture infectious dose 50%, TCID₅₀)约为10^6.16 TCID₅₀/mL。ECoV-JL毒株可以在人回盲肠癌(human ileocecal cancer-18, HRT-18)细胞、人结直肠腺癌(human colorectal adenocarcinoma-2, Caco-2)细胞和人肝癌(human liver cancer cells, Huh7)细胞上稳定传代。ECoV-JL株与GenBank中现有的ECoV全基因组序列相似性为97.9%-99.0%,系统发育分析发现ECoV-JL株属于单独的演化分支,与其他毒株的亲缘关系较远,说明ECoV-JL株可能是重组变异而来,其中NS2基因突变较多,NS2基因编码的差异是造成ECoV-JL株与其他毒株同源性较差的主要原因。【结论】本研究从腹泻马的粪便样品中成功分离并鉴定了一株ECoV,将其命名为ECoV-JL株,对该毒株生物学特性和亲缘关系的研究反映了湖北地区流行毒株的特点,为我国ECoV流行现状和演化趋势提供重要依据。     

猪圆环病毒2型流行株的分离及其感染性克隆的构建

【目的】通过分离一株猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株,并构建其感染性克隆,为研究PCV2基因功能提供操作平台。【方法】通过PCR方法,从疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪淋巴结中鉴定为猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)2型阳性。把阳性病料接种PK-15细胞传代培养,在培养物中扩增出PCV2的全基因序列。对扩增出的全序列进行序列测定,并与GenBank中公布的5株广东PCV2分离株(GD-pz、GD-gj、GD-jm、GD-ss和GD-sz)进行同源性分析。通过EcoRⅠ和SalⅠ将PCV2全基因组序列克隆进pUC18载体中,获得含PCV2 GD-zq株全基因组单拷贝的重组质粒pPCV2-GD-zq,再通过SalⅠ和HindⅢ把另一个全长拷贝克隆进pPCV2-GD-zq质粒中,使PCV2 GD-zq株基因组DNA以头尾相接的双重复方式克隆进pUC18载体中,获得重组质粒pPCV2-2GD-zq。将pPCV2-2GD-zq DNA纯化和定量后转染PK-15细胞,拯救PCV2 GD-zq病毒。【结果】从PMWS感染的猪淋巴结中分离到了一株PCV2,命名为GD-zq株;序列分析结果显示,GD-zq株全基因组为1 767 bp,与GenBank中公布的5株广东PCV2分离株ORF1核苷酸一致性为97.1%-99.7%,编码氨基酸一致性为98.7%-100%;ORF2核苷酸一致性为93.2%-99.6%,编码氨基酸一致性为92.3%-99.1%;全基因一致性为96.0%-99.6%。pPCV2-2GD-zq质粒转染PK-15细胞后,其通过间接免疫荧光实验(IFA)能从转染细胞及其传代细胞中,检测到拯救出的病毒。【结论】分离了一株PCV2广东株GD-zq,成功构建了PCV2 GD-zq株的感染性克隆。     

两株田间重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定、进化分析及其致病性研究

为了解2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV2)田间毒株重组特征,本研究对两株分离物(HENXX-8、HENJY-2)进行全基因测序、进化分析及毒力测定,并对其全基因序列进行重组分析。结果显示,两个毒株均属于PRRSV 2,两者与其代表株VR-2332的核苷酸相似性分别为85.6%、85.7%;与高致病性PRRSV(HPPRRSV)毒株JXA1、TJ和WUH4株分别为85.7%～85.8%、85.4%～85.5%;与经典毒株CH-1a、HB-2(sh)分别为84.7%～85.7%、84.5%～85.7%;而与所有NADC30类毒株均在90.0%以上。全基因、ORF5及Nsp2序列进化分析结果均显示两个分离物与国内报道的类NADC30毒株遗传距离较近,同处于一个分支。全基因组重组分析结果表明,两个分离毒株存在明显重组现象,且重组模式均以类NADC30毒株为骨架病毒,与HP-PRRSV毒株发生重组。但重组对象不同:HENJY-2是由类NADC30毒株与TJ株发生重组;而HENXX-8则是由类NADC30毒株与WUH4、TJ株发生3毒株间重组。由于重组部位序列缺乏特异性分子标志,因此无法确定与类NADC30发生重组的是HP-PRRSV还是其减毒的疫苗毒株。两株分离物的重组部位与早期分离毒株HENANHEPB、JL580等有所不同,均未涉及到ORF5基因,而是集中在Nsp1～Nsp2以及ORF2a～ORF3区域,主要发生在病毒基因组的靠5'端(30～7 000 bp)和3'端(11 000～13 000 bp)处。对部分重要基因的核苷酸相似性分析结果显示,两个分离株的ORF2a、ORF3基因与HP-PRRSV毒株相似性最高,表明重组病毒的这两个基因可能来自HPPRRSV毒株。致病性试验结果表明,参考毒株HENXC-4的毒力略高于分离毒株HENXX-8,主要表现在体温升高、日均增重降低和肺部病变上。但两个分离物均未引起发病猪死亡。以上结果表明,目前PRRSV2在田间的基因重组事件存在随机性,提示不同毒株在田间的存在会加剧PRRSV重组事件的发生和流行、毒株类型更加复杂,从而增加了临床防控难度。因此,慎重使用活疫苗并持续监测活疫苗毒株在田间的变异动态,对更好防控本病具有一定的临床指导意义。     

三带喙库蚊中分离的西藏环状病毒全基因序列测定及分析

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)是环状病毒属中的新成员,首次分离自中国西藏自治区的圆斑按蚊,本研究首次对从三带喙库蚊标本中分离到的西藏环状病毒(HN11121株)进行全基因组序列测定和分子遗传进化分析。结果显示除第2节段以外,三带喙库蚊分离的HN11121病毒株与从圆斑按蚊分离的西藏环状病毒原始分离株(XZ0906)第1~10节段核苷酸和其编码的氨基酸序列长度相同,核苷酸和氨基酸同源性分别为70.3%(S6)~98.7%(S5)和79.8%(S6)~99.8%(S10);而HN11121病毒株与XZ0906病毒株第2节段核苷酸长度分别为2 850bp和2 838bp,分别编码950和946个氨基酸,核苷酸和氨基酸同源性分别为55.8%和47.1%。病毒VP2蛋白氨基酸位点差异结果显示从三带喙库蚊分离的HN11121病毒与从圆斑按蚊分离的XZ0906相比存在390个氨基酸差异位点。基于HN11121病毒株VP1基因和VP3基因核苷酸序列的系统进化分析结果显示HN11121属于环状病毒属西藏环状病毒,但是从三带喙库蚊分离的HN11121病毒与在圆斑按蚊分离的西藏环状病毒原始分离株(XZ0906)处在不同的进化分支。以上结果提示,从三带喙库蚊分离的西藏环状病毒(HN11121)与从圆斑按蚊分离的西藏环状病毒在病毒基因组和病毒基因组分子遗传进化均存在较大差异,鉴于三带喙库蚊是我国乙脑病毒的主要传播媒介,同时该蚊种也是我国南方广泛存在的蚊虫种类,因此加强三带喙库蚊中西藏环状病毒监测对于了解西藏环状病毒的生物多态性具有重要意义。     

广西鸭源H6N6亚型禽流感病毒NA的序列分析

2009年至2014年间我单位在广西南宁、防城港和梧州三市活禽交易市场进行流行病学调查时,在鸭咽喉和泄殖腔中分离到10株H6亚型禽流感病毒(AIV)毒株。为了解这10株病毒的神经氨酸酶基因(NA)的分子特征和差异,我们运用RT-PCR对这10株H6亚型禽流感病毒的NA基因进行了扩增、序列测定及分析。结果显示,所分离的10株病毒均为H6N6亚型流感病毒。序列同源性分析结果表明A/DK/NN/6121/2013株的NA基因与其他9株NA基因差异性较大,差异性达到5.4%~5.9%,其余9株之间相似性在97.9%~100%;南宁与防城港、南宁与梧州以及梧州与防城港毒株相似性分别为94.5%~100%、94.1%~98.1%和97.8%~98.5%,这些数据表明不同毒株呈现一定的地域性差异。氨基酸序列分析发现10个毒株NA基因上潜在的糖基化位点也有所不同,表明这些毒株有异源性。遗传进化分析表明10株NA基因片段均属于欧亚谱系的禽源演化分支,除了南宁市的DK/NN/6121与福建相应毒株遗传进化关系较近外,其他9株与越南的相应毒株相互之间遗传进化关系都很亲近,且与越南A/duck/Vietnam/LBM235/2012(H3N6)株的NA基因存在很近的遗传关系,推测它们之间的基因可能存在基因交流;同时发现与台湾和韩国等的毒株关联不大。     

宁夏地区犬细小病毒的分离鉴定及其VP2基因进化分析

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)具有高度传染性,是幼犬最危险的消化道传染病病原之一。为了解宁夏地区CPV的流行现状及其VP2基因的遗传变异情况,本研究采集了14份经胶体金试纸条检测为CPV阳性的腹泻犬粪样,进行病毒分离和鉴定,并将分离株VP2基因全序列进行克隆和测序分析。结果显示,14份样品中成功分离到5株CPV;病毒TCID50在104.9/0.1mL～105.4/0.1mL之间;HA效价均达1∶512以上;序列分析显示,5株分离株中3株为new CPV-2a型,2株为new CPV-2b型;分离株与参考株的核苷酸和氨基酸相似性分别为98.2%～99.9%和96.9%～99.8%;聚类分析显示,分离株序列全部聚类在同一分支。本研究的结果为我国西北地区CPV分离株的分子流行病学和遗传多样性提供了依据,有助于该地区预防和控制CPV感染。     

中国牛病毒性腹泻病毒JZ05-1分离株全基因测序及分析

牛病毒性腹泻病毒为瘟病毒属成员,呈世界性分布并在乳/肉牛业中造成严重经济损失。本研究利用MD-BK细胞增殖一株分离于我国吉林地区的牛源牛病毒性腹泻病毒JZ05-1毒株,观察发现其具有典型的致细胞病变效应。使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别扩增覆盖基因组全长的八个片段并测序,拼接获得该病毒的全基因组序列长12285核苷酸(nt),GenBank登录号:GQ888686。该病毒基因组具有编码多聚蛋白的一个11694nt可读框,5'非翻译区(UTR)长387nt,3'非翻译区长204nt。分别分析BVDVJZ05-1的5'-UTR序列和全基因组序列,发现该病毒属于BVDV-2a亚型。BVDV-2型多数毒株之间的相似性约为96%,与JZ05-1全基因组序列相似性最高的加拿大p11Q毒株和中国XJ-04毒株的相似性为90%和91%。因此,JZ05-1全基因组序列与BVDV-2型其他毒株的全基因组序列具有较大差异。     

家蚕传染性软化病病毒（桐乡株）VP1基因片段的克隆及序列分析

以首株在中国分离到的家蚕传染性软化病病毒（Bombyx mori infectious flacherie virus,BmIFV）BmIFV-CHN001基因组为模板,扩增了编码主要结构蛋白的VP1基因。克隆测序后得到VP1基因片段906 bp。该序列与已发表的日本毒株相比,核苷酸序列的相似性为99.3%,编码氨基酸的相似性为100%,证明该毒株与家蚕传染性软化病病毒日本株的同源性较高。把BmIFV-CHN001的VP1序列与同属的另外6个昆虫小RNA病毒的结构蛋白进行序列比对,构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示这7种病毒具有相近的亲缘关系,而BmIFV-CHN001与蜜蜂囊雏病毒的亲缘关系最近。     

我国2009年新分离乙脑病毒全基因组序列特征研究

本研究对我国2009年新分离的两株乙脑病毒进行全基因组序列测定和分析,以了解病毒全基因组分子特征。通过RT-PCR和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用ClustalX、DNASTAR、MEGA等生物学软件完成核苷酸序列及氨基酸序列分析和系统进化分析等。研究结果显示,新分离两株乙脑病毒YN0911和YN0967株基因组全长均为10 965个核苷酸,编码3 432个氨基酸。这2株乙脑病毒之间核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.8%。与国际乙脑病毒流行株相比,核苷酸同源性为83.5%～98.9%,氨基酸同源性为94.8%～99.7%。与乙脑病毒疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白有13个氨基酸差异位点,但都位于抗原关键位点之外。这2株病毒在3′UTR区域存在11nt缺失。基于C/PrM区段、E基因、全基因组系统进化分析结果均显示新分离2株乙脑病毒为G I乙脑病毒,并且和越南、四川、贵州、广西以往的分离株遗传进化关系较近。本研究提示我国新分离的2株乙脑病毒均为G I乙脑病毒,决定病毒毒力的关键氨基酸位点未见明显变化。     

2010–2015年华东地区猪圆环病毒2型的分子流行病学分析

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是严重危害世界养猪业的重要传染病,即猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的重要病原,其致病机制及流行规律尚未阐明。本研究对2010–2015年间采集自中国华东地区的病料进行PCV2检测,以探讨中国华东地区PCV2的分子流行病学特征,分析PCV2的遗传演化规律。【方法】本研究利用PCR方法对384份断奶仔猪多系统衰竭综合征疑似发病猪样本进行检测,并对随机选取的42份阳性样品进行PCV2全基因组的测定和分析。【结果】华东地区普遍存在PCV2的感染,阳性率为41.15%。序列扩增获得42株PCV2全长基因组,同源性和系统进化树分析表明,基于PCV2 ORF2和全长核苷酸序列构建的系统进化树结构是基本一致的。从病料中测得的42株PCV2与11株参考毒株序列的ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.0%–100.0%和82.5%–100.0%。遗传进化分析显示,53株PCV2毒株可分为4个基因型,即PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。本文获得的42株序列ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.6%–100.0%和86.8%–100%,...     

猪7种腹泻相关病毒的临床检测及猪嵴病毒的遗传进化分析

为了解引起猪腹泻疫病的病毒性病原种类及感染现状,本研究首先针对7种报道较少但可引起猪腹泻的病毒性病原建立了多重RT-PCR检测方法,包括猪捷申病毒(PTV)、猪萨佩罗病毒(PSV)、猪丁型冠状病毒(PDCo V)、猪嵴病毒(PKV)、猪札幌病毒(PSa V)、猪星状病毒(PAst V)和猪环曲病毒(PTo V)。利用该方法对419份临床腹泻粪便样品进行筛检,结果显示PKV检出率最高,阳性率达26.98%–45.79%;PKV和其他病原混合感染率达9.52%–18.54%。基于PKV的高检出率及其可能在猪腹泻疾病中发挥的作用,本试验进一步选取3个PKV阳性样品进行全基因组序列测定及遗传进化分析。结果表明,这3个阳性样品PKV均归属于猪嵴病毒属,且与其他动物嵴病毒遗传距离较远,分别标记为CM-PKV、JS-PKV和PD-PKV;它们的全基因组同源性为88.1%–89.1%;CM-PKV与2013年报道的中国株JS-02a-CHN/2013同源性最高,而JS-PKV和PD-PKV则与2008年报道的匈牙利株K-30-HUN/2008/HUN同源性最高。表明上海不同地区猪群中存在的PKV有明显的遗传差异,但毒株遗传特性的差异与其致病力的相关性需进一步研究。本研究为深入了解PKV的流行现状及探讨其在猪腹泻疫情中的作用提供了参考。