应用实时荧光定量RT-PCR检测宫颈癌及其外周血中VEGF表达的研究

目的:研究血管内皮生长因子在宫颈癌患者癌和癌旁组织及外周血循环细胞中的表达情况,分析其在肿瘤生长与转移中的作用。方法:采用基于TaqMan探针技术的实时荧光定量RT-PCR法检测了50例宫颈癌患者癌及癌旁组织和40例正常宫颈组织标本中VEGF mRNA的表达情况及其对应的外周血中的VEGF mRNA表达,分析其与临床病理参数之间的关系。结果:宫颈癌组织及癌旁组织中VEGF mRNA的表达水平无明显差异,但均与正常宫颈组织的表达水平差异有显著性;宫颈癌组织中VEGF mRNA的表达与肿瘤的组织学类型无明显的相关性;而与肿瘤的临床病理分期、病理分化程度、淋巴结转移、肿瘤直径、深肌层浸润间均呈显著的正相关。宫颈癌患者外周血中VEGF的表达明显高于对照组水平,与淋巴结是否转移密切相关,但与其他临床病理参数无关。结论:实时荧光定量RT-PCR可以敏感且特异性的检测出宫颈癌组织及外周血中VEGF mRNA的表达,且方法准确可靠,操作方便,在肿瘤的微转移的诊断监测方面有一定的应用价值。VEGF有可能成为治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。     

SARS冠状病毒实时荧光RT-PCR定量检测

为建立一种快速、准确、特异的SARS病毒RNA定量检测方法,根据复合探针荧光定量分析原理,对SARS病毒核酸进行实时荧光定量RT-PCR检测.借助计算机辅助,对SARS病毒基因靶序列以及检测引物和探针进行了优化筛选;利用体外转录SARS病毒RNA靶序列,对RT-PCR反应的镁离子浓度参数进行了优化;比较Trizol法、磁珠法、Qiagen法、煮沸法等4种方法提取RNA的检测效果,建立了样本处理方法;通过对构建的体外转录靶序列模型的检测,对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评价,并通过对42例临床标本的检测对本方法的检测效果进行了评估. 通过克隆SARS病毒核酸靶序列并进行体外转录,获得了长度约1.2 kb的体外转录RNA靶序列;经优化,荧光RT-PCR反应液中的Mg²⁺浓度以4.0 mmol/L为最好;RNA提取方法采用磁珠法效果较好;本方法的检测灵敏度最低可达5个拷贝的体外转录RNA分子,特异性100%,C_t值的CV值小于5%.对临床确诊的42份SARS病人血清和漱口水标本的检测结果表明,该方法的检出率为79%,与荧光抗体检测法的符合率为70%.上述结果表明,该方法建立的荧光定量RT-PCR技术能够快速准确、特异、敏感地对SARS病毒核酸进行定量分析,为临床SARS冠状病毒RNA的检测提供了新的,更为有效的检测方法.     

人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用比较

分别设计HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异的引物与荧光标记探针,并合成含靶基因的模板RNA,建立常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR方法,对其灵敏性、特异性和可重复性以及用于临床样本的适用性等进行平行比较评价.结果表明:这两种方法皆可对HCoV-NL63或HCoV-HKU1进行特异性诊断,其中荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度均可达10拷贝/25μL反应体积,不同批次重复检测结果间的变异系数均小于5%.上述方法应用于158份临床鼻咽拭子标本,其中荧光定量RT-PCR方法检出6份HCoV-NL63阳性标本,5份HCoV-HKU1阳性标本,而常规RT-PCR方法则分别检出HCoV-NL63阳性与HCoV-HKU1阳性各3份.对常规RT-PCR方法获得的阳性样品进行序列分析证实上述方法的可靠性.本实验成功建立了可用于临床标本检测的人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步证实荧光定量RT-PCR检测方法检出率明显高于常规RT-PCR方法,这为开展HCoV-NL63和HCoV-HKU1的流行监测及临床早期诊断提供了有效技术手段.     

一种新颖简便的荧光实时 RT-PCR相对定量方法的建立

为建立一种新颖、简便的荧光实时 RT-PCR 相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式 . 公式显示相对表达指数只与 CT 值和标准曲线的斜率相关 . 构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐 . 当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时,标准曲线的斜率并不改变,说明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关 . 因此,新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总 RNA ( 或 cDNA) ,经系列稀释后作为标准品,来构建相对定量标准曲线,获得斜率 . 与绝对定量法比较,新方法获得了基本相同的斜率和非常一致的定量结果 ( 差异小于4%) ,而传统的 2 -ΔΔCT法却表现出较大的定量误差 . 这些结果表明,新的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法 .     

猪丁型冠状病毒荧光定量RT-PCR与S1蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

最近,新发现的猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)可导致仔猪腹泻,亟待建立有效准确的核酸及血清学检测方法并调查猪场的PDCo V感染情况。本研究采用针对病毒M基因的探针荧光定量RT-PCR检测方法,对2014-2015年间收集的河南、湖南、浙江、江西、安徽、河北、黑龙江、江苏、山东和上海等10个省市收集的共254份腹泻仔猪小肠匀浆或粪便样本进行检测,共检出11份PDCo V阳性样本,总阳性率为4.33%。采用在昆虫细胞表达纯化的PDCo V囊膜S1蛋白为包被抗原,建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测2015-2016年间收集的来自江苏、湖南、浙江等7个省份的609份具有腹泻症状的猪血清样品,抗PDCo V S1抗体检出率为44.17%(269/609)。上述建立的两种方法分别针对病毒的RNA或抗体对PDCo V进行特异性检测,可以应用于PDCo V流行情况的监控。     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAc1基因mRNA方法的建立

构建包含RAc1基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAc1之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参.从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAc1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析.纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验.建立了RAc1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～107拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r=1.000),扩增效率高(E=98.2%).建立了基因RAc1实时定量PCR的质粒标准品.     

实时荧光定量PCR技术及其应用

实时荧光定量PCR技术是一种多色荧光检测核酸定量技术,该简要介绍实时荧光定量PCR技术的原理及其应用。     

实时荧光定量PCR及RT-PCR与常规PCR及RT-PCR检测对虾病毒效果的比较

常规PCR及RT-PCR已用于对虾DNA及RNA病毒检测,但存在费时、灵敏度较低、不能定量等问题。建立了TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR方法,分别用于检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)4种对虾病毒。与常规PCR及RT-PCR比较,所建立的TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR检测上述4种对虾病毒不仅有很高的特异性,检测灵敏度也提高了10～100倍,同时还具有快速、简便、不污染环境、重复性好、实时定量等优点,可明显提高对虾病毒检验检疫工作质量及效率。     

应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5mRNA表达

目的应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞（BMSCs）对大鼠肝星状细胞（HSCs）的死亡受体5（DR5）mRNA表达的影响,探讨BMSCs诱导HSCs凋亡及其机制。方法采用贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠BMSCs,传至第4代使用;大鼠原代HSCs细胞及肝纤维原细胞系冻融后传代使用。应用6孔塑料培养板,建立上下双层细胞共培养体系,常规培养。实验分为3组：（1）实验组：BMSCs与HSCs共培养;（2）空白对照组：HSCs单独培养;（3）阴性对照组：大鼠肝纤维原细胞与HSCs共培养。以上培养体系动态观察24、48、72h,应用流式细胞仪检测HSCs细胞凋亡率,采用SYBRGreenI荧光实时定量RT-PCR法检测,以β-actin基因作为内参,计算各组DR5mRNA的相对表达量。结果在共培养组中,BMSCs促进了HSCs凋亡,与其他两组比较差异有显著统计学意义（P〈O．01）,空白对照组与阴性对照组比较无统计学意义（P〉0．05）。实验组BMSCs能明显上调HSCs中DR5mRNA的表达,与空白对照组和阴性对照组比较差异有显著统计学意义（P〈O．01）;空白对照组与阴性对照组DR5mRNA的表达比较无统计学意义（P〉O．05）。结论利用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5mRNA表达,为进一步研究BMSCs通过死亡受体途径调控HSCs凋亡以及为BMSCs用于治疗肝纤维化的机制研究提供了理论基础。     

上调hMLH1基因表达对卵巢癌药物敏感性的影响

构建携带错配修复基因hMLH1编码序列全长的真核表达质粒pCAN—hMLHl,并探讨其对卵巢癌细胞顺铂耐药的逆转作用。应用基因重组技术将pET28-hMLHl中的目的基因hMLHl定向克隆到真核表达载体pCAN,经酶切及测序鉴定：分别将pCAN—hMLHl和空质粒pCAN转染进卵巢癌耐药细胞SKOV3／DDP,同时以对顺铂敏感的sKOV3细胞和未转染的SKOV3／DDP细胞作为对照：应用RT-PCR和Westemblo凇测转染前后细胞内hMLHlmRNA和蛋白的表达变4Jc;四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测转染前后sKOv3／DDP细胞对顺铂敏感性的变化;Hoechst染色检测转染前后细胞的凋亡。结果提示：pCAN—hMLHl重组质粒经酶切及测序鉴定,表明真核表达质粒构建正确;采用脂质体法转染sKOv3／DDP细胞后,RT-PCR和Westernblot检测到耐药细胞内hMLHl的表达增强：MTT结果显示转染重组质粒后sKOv3／DDP细胞对顺铂的敏感性显著增加;Hoechst染色观察到转染后耐药细胞的凋亡明显增强。该研究成功构建了pCAN．hMLHl重组质粒,在sKOV3／DDP细胞中进行表达,并能增强耐药细胞对顺铂的敏感性,促进耐药细胞的凋亡。     

应用SYBR实时荧光定量Real—TimePCR法检测人宫颈癌MCPH1 mRNA表达

目的 应用SYBR实时荧光定量RT-PCR法检测MCPH1/BRIT1 mRNA的表达.方法 提取人宫颈癌总RNA,经逆转录PCR获得靶基因（MCPH1）及管家基因（GAPDH）的CDNA,采用SYBR Green 荧光实时定量法检测,以GAPDH基因作为内参,计算各组MCPH1 mRNA的相对表达量.结果 在31例宫颈癌标本中,MCPH1基因mRNA的表达,19例癌比正常低,1 例癌比正常高,其余标本无统计学意义;6例癌比癌旁低,1例癌比癌旁高,其余无统计学意义.结论 利用SYBR实时荧光定量RT-PCR检测出人宫颈癌中MCPH1基因mRNA的表达下调,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用及功能奠定了基础.     

EMT标志分子Vimentin在胃癌中的表达和临床意义

目的:探讨EMT标志分子Vimentin在胃癌中的表达和临床意义。方法:利用免疫组化染色的方法检测Vimentin在120例胃癌及其相应癌旁组织中的表达,统计分析Vimentin的表达水平与年龄、性别、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征间的相关性。结果:Vimentin在胃癌中的表达阳性率为55.8%,远高于相应癌旁组织的22.5%(P0.01),进一步分析研究发现Vimentin的表达水平在Ⅲ和Ⅳ期的胃癌中(TNM分期)的表达明显高于Ⅰ和Ⅱ期的胃癌,差异具有统计学意义(P=0.009),在发生淋巴结转移胃癌中表达明显高于未发生淋巴结转移的胃癌,差异具有统计学意义(P0.000)。结论:Vimentin在胃癌中高表达,其表达水平与TNM分期、淋巴结转移密切相关,提示Vimentin在胃癌的转移过程中可能发挥重要作用。     

胃癌组织中的MUC1和VEGF表达及其意义

目的:检测胃癌组织中VEGF和MUC1的表达情况,研究二者与胃癌生物学行为之间的关系。方法:应用免疫组织化学SP法检测VEGF和MUC1在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况。结果:胃癌组织中VEGF的阳性表达明显高于癌旁组织,两者之间差异存在统计学意义(P0.05),VEGF在胃癌组织中的表达与胃癌浸润深度、有无远处转移、有无淋巴结转移、TNM分期有关,之间差异存在统计学意义(P0.05);胃癌组织中MUC1的阳性表达明显高于癌旁组织,两者之间差异存在统计学意义(P0.05),MUC1在胃癌组织中的表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移、远处转移有关,差异有统计学意义(P0.05);胃癌患者组织VEGF与MUC1的表达水平呈正相关(r=0.210,P0.05)。结论:VEGF和MUC1在胃癌发生、发展和转移过程中起重要作用,可能成为检测胃癌的重要肿瘤标志物。     

HMGB1在胃癌组织及细胞系中表达的研究

目的:近年来的研究表明,高迁移率族蛋白(1HMGB1)在肿瘤的发生及恶性演变过程中发挥重要作用,本研究旨在探讨HMGB1在胃癌组织、正常组织、胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27、AGS及正常胃黏膜细胞系GES中表达情况。方法:免疫组织化学法检测HMGB1在32例可手术切除的胃癌患者组织标本(包括癌组织和正常组织)的表达情况;RT-PCR及Westren Blot检测HMGB1在胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27、AGS及正常胃粘膜细胞系GES的m RNA及蛋白质表达。结果:胃癌组织HMGB1免疫组织化学染色评分高于正常组织(P0.05);RT-PCR结果显示SGC-7901、BGC-823、HGC-27、AGS、GES细胞系HMGB1 m RNA表达丰度均较高;Westren Blot检测发现胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27中HMGB1蛋白水平显著高于胃癌细胞系AGS及正常胃粘膜细胞系GES。结论:HMGB1在胃癌组织及正常组织中的表达具有显著性差异。胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27相对于其它胃细胞系存在HMGB1高表达,适合后续基因敲除分析工作。     

mRNA差异展示研究胃癌差异表达基因

以胃癌细胞株GC7901与胃粘膜细胞株GES-1为对比材料,利用mRNA差异展示技术,研究胃粘膜至胃癌过程的差异表达基因,为建立胃癌预警系统打下基础.获得8个未知的与胃癌相关的cDNA,命名为GCYS-1,2,3,4,5,6,7,20,完成其克隆及序列分析,RNA印迹证实GCYS-1至7片段与GCYS-20基因在GC7901细胞株中呈高表达,在GES-1细胞株中呈低表达.此8个序列在GenBank数据库中登录,接受号为AF054162～AF056168及AF219140.     

TACC1及TFF3在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的：探讨转化酸性卷曲螺旋蛋白1（TACC1）和肠三叶因子（TFF3）在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化方法检测胃癌组织中TACC1及TFF3的表达情况。采用x2检验、乘积极限法及单因素、多因素生存分析等统计学方法,分析胃癌组织中TACC1及TFF3的表达与患者临床病理参数及预后的关系。结果：TACC1和TFF3在进展期胃癌、有淋巴结转移及复发的胃癌组织中的表达率较高。此外,TFF3在较大肿瘤（肿瘤大小〉4 cm）的胃癌组织中的表达较高。单因素生存分析显示年龄、淋巴结转移、TACC1和TFF3表达与低生存期显著相关（P〈0.05）。多因素分析结果表明,TACC1和TFF3的表达是独立的预后预测因子。结论：TACC1和TFF3的表达可以作为胃癌的独立不良预后因子,而且在胃癌组织中TACC1和TFF3共同表达的患者生存时间更短。     

转录因子FOXP1在胃癌组织中的表达及意义

目的:检测FOXP1蛋白在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,并探讨其与胃癌患者病理参数及预后的关系。方法:采用免疫组织化学染色方法检测90例胃癌组织和相应癌旁正常组织中FOXP1的表达情况并进行评分,进一步统计分析FOXP1表达与胃癌患者临床病理参数以及预后的关系。结果:FOXP1在胃癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织(P0.01);对临床资料进行统计分析表明,在临床III期和IV期患者的胃癌组织中FOXP1的表达显著低于临床I期和II期的患者(P0.05);FOXP1在低分化胃癌中的表达显著低于高、中分化胃癌(P0.01);FOXP1表达阳性者术后总体生存率较表达阴性者高(P=0.145),中位生存期长。结论:FOXP1表达的减少可能参与了胃癌的发生发展,FOXP1在胃癌中可能扮演抑癌基因的角色,FOXP1可作为胃癌治疗的潜在靶点。     

TGF-beta1、HIF-1alpha、VEGF在胃癌组织及癌旁组织中的表达及临床意义

目的：研究TGF-beta1（转化生长因子-beta1）、HIF-1alpha（低氧诱导因子-1alpha）、VEGF（血管内皮生长因子）在胃癌组织及癌旁组织中 的表达及临床意义。方法：选取于我院就诊的160 例胃癌手术患者切除的组织,采用免疫组化技术检测手术切除的胃癌组织中的 TGF-beta 1、HIF-1alpha及VEGF的表达,分析其与患者临床病理参数的关系。结果：免疫组化结果显示：TGF-beta1、HIF-1alpha及VEGF 在胃 癌组织中的表达均高于癌旁组织,差异均有统计学意义（P<0.05）;TGF-beta1、HIF-1alpha及VEGF 的表达均与肿瘤分期、淋巴结转移及 浸润深度有关（P<0.05）;VEGF的表达分别与TGF-beta1、HIF-1alpgha的表达呈相关关系（P<0.05）。结论：TGF-beta1、HIF-1alpha及VEGF在胃 癌组织中的表达与胃癌的病理学特征有关,检测TGF-beta1、HIF-1alpha及VEGF的表达将有助于临床诊治胃癌患者。     

PGI、PGⅡ在胃癌组织中的表达及意义

目的：研究胃蛋白酶原I(PGI)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)在胃癌组织中的表达及意义。方法：将我院2011 年5 月至2013年10月 收治的上消化道疾病患者243 例纳入研究,根据胃镜及病理组织学结果,按照胃癌、慢性萎缩性胃炎、慢性非萎缩性胃炎、不典型 增生以及胃溃疡分为5 组,对照组为57 名来我院检查的健康的人群。应用酶联免疫法测定各组血清PGI、PGⅡ的含量并计算胃 蛋白酶原比值(PGR),比较胃癌患者手术前后血清PGI、PGⅡ的含量以及PGR,并通过ROC曲线下面积评价血清PGI、PGⅡ以及 PGR 诊断胃癌的效能。结果：与对照组比较,胃溃疡组PG I、PG II均明显升高,PGR 降低(P<0.05),慢性萎缩性胃炎组、不典型增生 组及胃癌组PGI、PGR均明显降低(P<0.05);与慢性萎缩性胃炎组比较,不典型增生组和胃癌组PGR 显著降低(P<0.05)。手术治疗 后,胃癌患者血清PGⅠ、PGⅡ含量较手术前明显下降(P＜0.05)。血清PGⅠ、PGⅡ以及PGR含量诊断胃癌的ROC 曲线下面积依 次为0.779、0.920 以及0.991。结论：胃癌患者血清PGI、PGR均明显降低,二者可用于初步筛查胃癌。