尿激酶B链cDNA及其与水蛭素12肽cDNA融合基因的构建

尿激酶原是一种溶栓效果好、副作用小的溶栓药物。研究证明尿激酶B链,即低分子量单链尿激酶,具有与尿激酶原相同的溶栓特性,对血栓溶解具有特异性,引起系统性出血的副作用较小,有可能成为一种较为理想的溶栓药物。它的氨基酸序列相当于尿激酶原的144～411aa,国外已通过缺失突变获得了它的结构基因,并在中国仓鼠卵巢细胞中表达成功。由于尿激酶B链分子量较小,且含尿激酶原的酶活功能区,     

水蛭素12肽与低分子量单链尿激酶融合基因的构建、表达及产物特性分析

用化学合成的方法合成了水蛭素12肽基因的编码序列,通过DNA重组技术将水蛭素12肽基因片段与低分子量单链尿激酶cDNA片段连接构建了融合基因。融合基因在大肠杆菌中获得表达。体外实验结果表明,表达的融合蛋白具有溶纤活性和抗凝活性。     

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建,表达和？…

将化学合成的ＲＧＤ肽（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）编码寡核苷酸与尿激酶Ｂ链ｃＤＮＡ相连成为融合基因后,克隆至原核表达质粒ｐＢＶ２２０中,在ＰＲＰＬ自动子的作用下,经４２℃热诱导,在大肠杆菌ＤＨ５α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的９．２％,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性,     

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建、表达和功能的初步分析

将化学合成的RGD肽(Arg-Gly-Asp)编码寡核苷酸与尿激酶B链cDNA相连成为融合基因后,克隆至原核表达质粒pBV220中,在P-RP-L启动子的作用下,经42℃热诱导,在大肠杆菌DH5α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的9.2%,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物,经Western blotting分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性,体外活性分析显示其具有一定的纤溶和抗血小板聚集的活性。     

hVEGF165 和嵌合水蛭肽融合基因的构建、表达和活性检测

根据抗 PTCA 或支架后再狭窄的基因治疗需要多基因治疗的特点,用基因重组技术构建了 hVEGF165 和嵌合水蛭肽 (fused hirudin , FH) 融合基因,并克隆到真核表达载体 pcDNA3.0 中,通过脂质体介导将 pcDNA3.0/hVEGF165 - FH 转染到人内皮细胞株 (ECV304) 中, RT-PCR 及蛋白质印迹证明融合基因 hVEGF165 - FH 在 ECV304 细胞中得到表达 ( 分子质量为 24 ku 左右 ). 通过体外活性检测——— MTT 法检测 hVEGF165 - FH 对 ECV304 细胞增殖的影响,通过体外血管生成分析 hVEGF165 - FH 对内皮细胞株 ECV304 增殖的影响 . 通过体外抗栓活性检测,表明表达产物具有促进内皮细胞株增殖及加快血管生成的作用,同时显著抑制了 ADP 诱导的血小板聚集率 (P < 0.05) 并显著延长 APTT 和 TT (P < 0.05) . 实验结果表明,融合基因在内皮细胞株中得到表达,表达的融合蛋白具有 hVEGF165 和嵌合水蛭肽 (FH) 的双重活性,这为以后的融合基因治疗再狭窄的动物实验打下了良好基础 .     

抗CEA单链抗体与链亲和素融合基因的表达

克隆分泌CEA杂交瘤细胞重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）,以Linker连接V_H及V_L构建抗CEA单链抗体.同时以Spacer连接单链抗体和链亲和素,构建成功单链抗体和链亲和素融合基因,克隆该融合基因至原核表达载体,pET21a(+),经IPTG诱导表达出该双特异性融合蛋白.活性鉴定表明该融合蛋白具有结合CEA及生物素的双特异性.该融合蛋白在生物领域中有较广阔的应用前景.     

开发中的抗栓剂——水蛭素及其12肽

血栓病是严重危害人类生命与健康的疾病,多年来人们一直在致力于寻找和研制治疗血栓病的有效药物。至今,已有尿激酶、链激酶,组织型纤溶酶原激活剂以及尿激酶原等溶栓药物。与此同时人们也一直在寻找效果更好的抗栓药物。水蛭素就是一种正在开发的抗栓药物。早在1884年就发现了水蛭素,但直到     

抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单克隆抗体的重链可变区与人的恒定区（Ｃγ３） 连接, 制备抗癌胚抗原嵌合重链用于放免治疗及其他导向治疗, 可减少人抗鼠抗体反应（ＨＡＭＡ） 。为纯化及核素标记抗体, 将嵌合重链基因与核心链霉亲和素基因融合。融合基因在大肠杆菌得到高效表达, 表达量占菌体总蛋白的２４ ％ 。ＳＤＳＰＡＧＥ 和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为７０ ｋＤ, 与其基因编码蛋白质的理论推算值相符。以ＨＲＰ标记的生物素作为抗体进行蛋白质印迹, 在７０ ｋＤ 处可见表达条带, 表明融合蛋白能特异性地与生物素结合, 使嵌合重链经生物素柱进行廉价纯化成为可能。表达产物在胞内主要以不溶性的包含体存在, 经变性和复性处理后, ＲＩＡ 表明表达产物具有结合其特异性抗原ＣＥＡ的能力。     

重组水蛭素相关肽Hi-lys的表达与纯化(英文)

为开发一种新的有临床应用价值的抗血栓药物,根据水蛭素保持抗凝活性的2 0肽片段,设计并构建了水蛭素相关肽(Hi lys)与天冬酰胺酶C端的融合表达系统.为方便目的肽与融合伙伴的分离,增加了富含带电序列的8肽(KRKRKKSR)及酸敏感的天冬氨酰 脯氨酸(Asp Pro)位点,获得了表达质粒pED P8 Hi lys.将其转化E .coliBL 2 1,玉米浆培养基(kanr)培养,乳糖诱导获得融合蛋白(AnsB C P8 Hi lys)的高效表达.通过细菌裂解、包涵体洗涤、尿素溶解、乙醇沉淀、酸水解和DEAE 纤维素5 2柱层析纯化获得目的肽Hi lys ,用凝血酶测定法测得其抗凝活性为5 0ATU mg .     

低分子量单链尿激酶与血纤蛋白粘附肽融合基因的构建、表达及产物活性分析

低分子量单链尿激酶(scu-PA-32)可通过激活纤溶酶原转变成纤溶酶溶解血栓,其溶栓具有一定的选择性,出血副作用比双链尿激酶小,但缺少对纤维蛋白的特异亲和力;2种血纤蛋白粘附肽(四肽A4;十二肽A12)都可和纤维蛋白特异性地结合,具有抗纤维蛋白单体聚合的功能,并因此有一定的抗血栓形成作用。本研     

人可溶性VEGFR2和IL-12融合基因真核表达质粒的构建与表达

[目的]构建和表达人可溶性血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)与白细胞介素12(IL-12)融合基因的真核表达质粒,并初步验证其抗肿瘤活性。[方法]根据Gen Bank公布的基因序列,设计并分别全基因合成全长人VEGFR2和IL-12基因,VEGFR2与IL-12通过Furin/2A(F2A)进行连接,融合基因克隆入真核表达载体p VAX1,构建p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12表达质粒。将p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12质粒瞬时转染293T细胞后,通过ELISA法测其真核表达能力。质粒注射B16荷瘤小鼠模型后,分析其抗肿瘤效果。[结果]质粒p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12构建成功;ELISA检测293T细胞转染上清液结果显示,VEGFR2和IL-12都能够在293T细胞中得到表达。质粒注射荷瘤小鼠模型后,显示出了较强的抑制B16肿瘤生长的能力,达到50%。[结论]p VAX1-VEGFR2-F2A-IL-12质粒成功构建和表达,该质粒具有较好的抑制B16肿瘤生长的能力,其抑制率达50%。     

血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶融合基因在大肠杆菌中的表达

人工合成了血纤蛋白粘附肽基因,构建了粘附肽与低分子量单链尿激酶cDNA的融合基因,在大肠杆菌中表达了融合基因。融合基因表达产物的抗原性和天然尿激酶相同,并具有尿激酶的溶纤活性和粘附肽的抗纤维蛋白单体聚合的功能。     

不同连接肽的双价单链抗体基因的构建及表达

采用基因重组技术分别借助不同长度的连接肽[G4S和(G4S)3],将两个相同的抗人大肠癌单链抗体基因ND-1scFv共价连接,构建表达载体pET-28a( )ND-1sc(Fv)2,并在大肠杆菌BL21中表达ND-1sc(Fv)2的融合蛋白。应用Ni2 亲和层析方法对表达产物进行纯化,SDS-PAGE、免疫荧光法(IFA)和ELISA对纯化后的蛋白质进行纯度和免疫活性分析。结果表明成功构建了表达载体pET-28a( )ND-1sc(Fv)2,并在大肠杆菌中获得高效表达,其表达产物以不溶性包涵体形式存在。纯化后ND-1sc(Fv)2-5、ND-1sc(Fv)2-15的蛋白质纯度分别为90%和86%。IFA及ELISA结果表明,二者均保留了亲本抗体的免疫活性,对表达在人大肠癌细胞上的肿瘤相关抗原LEA具有特异结合活性,其免疫活性均明显高于ND-1scFv,其中ND-1sc(Fv)2-15的免疫活性更接近于亲本单抗ND-1,该抗体有望成为大肠癌临床导向诊断和治疗的理想载体。     

嵌合水蛭肽的构建与活性分析

血管成形术或动脉粥样斑块破裂等因素所致血管壁损伤而引起的血栓形成过程中 ,血小板的激活和凝血酶的形成起着关键作用 .因此 ,抗血小板和抗凝是治疗血栓的两个重要方面 .血小板膜糖蛋白GPⅡb Ⅲa受体拮抗剂 ,如含Arg Gly Asp(RGD)序列的多肽 ,在临床上已显示了良好的抗血小板     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链融合基因的克隆及原核表达分析

构建了霍乱毒素B亚单位(choleratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素(insulin)B链的融合基因CTB-INSB,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pETCIB;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经IPTG诱导后的表达产物经15％SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,其分子量约为15.4kDa,且主要以包涵体形式存在,约占全菌蛋白的30％。含CTB-INSB重组蛋白的包涵体经变性和复性后,可在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果显示CTB-INSB可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别,表明该蛋白具有霍乱毒素B亚单位与胰岛素的双重抗原性。同时GM1-ELISA分析结果表明CTB-INSB在体外可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异结合,进一步证实了它能够形成类似CTB五聚体的高级结构,具有生物活性。     

两种人源化单链抗体-尿激酶融合基因的构建与表达

Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ是单链尿激酶 (Ｓｃｕ ＰＡ)分子的Ｎ端肽段被水解后的产物 ,其分子量小但具有与Ｓｃｕ ＰＡ相同的体内外生物活性[1] 。在过去的工作中 ,本实验室利用噬菌体表面呈现技术筛选到 1株对人纤维蛋白特异的鼠源单链抗体[2 ] ,并构建了鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体—Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ融合基因。为解决该融合基因在大肠杆菌中的高表达问题 ,通过在大肠杆菌中表达构建的一系列融合基因的缺失突变体 ,初步认定Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ基因中两个连排的大肠杆菌稀有密码子ＡＧＧ(精氨酸 )是影响该融合基因表达的主要因素。用ＰＣＲ定位诱变法…     

新型水蛭素嵌合抗栓剂的构建表达与功能研究

水蛭素（Hirudin,HV）作为新一代抗凝剂,它是目前已知最强的天然凝血酶抑制剂,并有望在临床上完全取代肝素。虽然水蛭素有许多优点,但出血倾向是其在临床应用上的主要副作用。目前尚没有好的解决办法。针对水蛭素在临床应用中所出现的这个问题,依据血栓形成的生理生化机制,构建出了含FXa识别序列水蛭素嵌合抗栓剂,来降低水蛭素在非血栓部位的活性从而减小出血的危险。小鼠尾部血栓模型实验表明：此新型嵌合抗栓剂能在不减少水蛭素抗凝血活性的同时,又能大幅度地降低出血副作用。具有非常重要的临床意义。     

人组织型纤溶酶原激活剂-水蛭素融合基因的构建及其在毕赤酵母中的表达

构建并表达兼有溶栓和抗凝活性、减少出血副作用的人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和水蛭素(HV2)的融合蛋白。通过提取总RNA和RT-PCR获得t-PA基因,与HV2基因通过活化凝血因子X(Fxa)识别序列（IEGR）的对应碱基序列连接构成融合蛋白基因,融合蛋白基因经pGEM-T、pIC9克隆至表达载体pIC9K上,电转导入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115。转化子摇瓶内甲醇诱导表达。纤维蛋白平板溶圈法和纤维蛋白凝块法分别检测溶栓和抗凝活性。琼脂糖凝胶电泳结果显示克隆的t-PA基因片段大小为1700bp,序列测定结果表明其35位氨基酸由文献报道的精氨酸突变为色氨酸。限制性酶切和PCR鉴定结果均表明融合蛋白基因已克隆入表达载体和宿主菌。甲醇利用实验、G418抗性筛选获得多拷贝甲醇利用快型克隆。甲醇诱导表达产物具有纤溶活性并可被抗t-PA抗体抑制。完整融合蛋白无抗凝活性,但以Fxa裂解后可释放抗凝活性。同时,融合蛋白以单链和双链两种形式存在。融合蛋白在血栓部位特有的Fxa作用下靶向释放抗凝活性,具有溶栓抗凝双功能,有望降低临床出血副作用。     

水蛭肽基因的克隆及其转化甘蓝

将合成的水蛭肽基因转入甘蓝,构建了水蛭肽的植物表达载体pBOK-L,使用甘蓝的下胚轴和根癌农杆菌的共培养实现转化,再生植株经卡那霉素筛选,检测结果表明所得到的抗性植株均为转基因植株,获得了转水蛭 肽基因的甘蓝植株。