CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达

本研究的目的是将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中,利用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中,PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。     

表达多肽抗生素apidaecin的转基因烟草及其抗病性的初步分析

将多肽抗生素apidaecin基因与病程相关蛋白的信号肽序列融合,构建了apidaecin的分泌型植物表达载体、apidaecin与另一多肽抗生素Shiva\|I的双价分泌型植物表达载体,以本实验室原来构建的Shiva-I分泌型植物表达载体做对照,转化了模式植物烟草。对3种转基因植物进行了分子检测,转化再生苗95%为PCR阳性,Southern杂交结果进一步证明外源基因已经整合到了烟草基因组中,RT-PCR检测表明外源基因可以在转基因烟草内正常转录。对T0代转基因烟草进行烟草野火病的抗病性实验,从3种转基因烟草中都得到了抗病植株,病情指数分析的初步结果显示,双价转基因烟草抗病性最好,apidaecin的次之,Shiva-I的最差。     

棉花乙烯合成基因促进拟南芥和烟草不定根发生的研究

从棉花纤维cDNA中克隆获得乙烯合成基因GhACO3,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO3.通过花序侵染法和叶盘法分别转化拟南芥和烟草,利用卡那霉素筛选及分子检测获得转基因阳性拟南芥和烟草植株.结果表明,GhACO3基因已整合到拟南芥和烟草基因组中;经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株;与野生型拟南芥相比,GhACO3基因对拟南芥不定根发生具有显著促进作用;与野生型烟草植株相比,转GhACO3基因烟草不定根发生得到了显著的促进.研究表明,GhACO3基因的过量表达能够促进拟南芥和烟草不定根的形成发育,为进一步探讨GhACO3的生物学功能和进行转基因育种奠定了基础.     

草酸氧化酶基因转化烟草的研究

为研究草酸氧化酶基因(OxO)对植物抗病的作用,将含有CaMV 35s启动子的植物表达载体以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘方法,转化了烟草97131。具有卡那霉素抗性的再生植株经PCR检测,得到了与阳性对照一致的470bp的片段,进一步对PCR产物测序表明OxO基因已整合进烟草基因组中。在对草酸的耐受性实验中,转基因烟草对草酸的抗性明显高于未转化烟草。     

激发子基因peaT1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有激发子基因peaT1的植物表达载体pCAM-BIA2300-G4AS-peaT1转化三生烟,获得了转基因烟草植株。用PCR检测确认了阳性转化株,用Southern杂交、RT-PCR和Western杂交进一步证实了peaT1基因的整合、转录和表达。对T1代转基因阳性株进行TMV接种试验,结果显示,与非转基因对照相比,表达peaT1的烟草叶片枯斑数量减少,表明蛋白激发子基因peaT1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

转小麦冷胁迫蛋白截短基因烟草及其抗病性分析

TA3-13是克隆于小麦冷胁迫蛋白基因的截短片段。原核表达的TA3-13蛋白能够诱导烟草产生显著的抗烟草花叶病毒(TMV)的作用。文章将TA3-13基因片段克隆到植物表达载体pBI121上,构建成转基因重组体pB-3-13,通过冻融法转化农杆菌EHA105,构建成转基因侵染菌株。采用叶盘法将pB-3-13转化三生烟草,经卡那霉素抗性筛选,获得48株T0代再生植株。通过PCR检测,鉴定出33株转基因单株,收获了20株种子作为T1代株系。PCR-Southern杂交结果显示,PCR阳性条带与TA3-13探针有特异性杂交,说明外源基因被转化到烟草的基因组中。选取两个T1代株系的烟草植株用于各项测定。GUS组织化学活性鉴定和RT-PCR检测结果显示,外源基因可以成功地表达。接种TMV病毒后,转基因烟草抗TMV的能力较转空载体烟草提高3～5倍。转基因烟草具有抗TMV侵入和抗病毒病害发展的作用,同时转基因烟草可以抗细菌软腐病菌的扩展。     

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。     

含VHb基因和GFMcryIA基因的双价基因植物高效表达载体的构建

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体PGBI4ASVHBBt,vgbM基因表达盒中含2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;Bt基因表达盒中,除含有以上提高转录和翻译的调控元件外,还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。利用根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株;PCR及Southern blot检测,证实了双价基因在烟草基因组中的整合;Western blot检测证实了vgbM基因在转基因烟草中的表达;杀虫实验表明GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。     

根癌农杆菌介导的乙肝表面抗原基因对烟草的转化

构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于农杆菌的转化;通过冻融法将重组质粒pBRSAg转入根癌农杆菌LBA4404中,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,经筛选培养获得烟草植株。抗性植株经GUS染色和PCR检测为阳性,初步表明乙肝表面抗原基因在烟草中得到表达。     

美洲商陆抗真菌蛋白转化烟草的研究和抗病性检测

本研究为美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因首次对植物遗传转化的研究,转入烟草中研究此蛋白对烟草立枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转染烟草获得了大量再生转基因植株。PCR、Southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中,并且已经得到转译。转基因植株苗期抗立枯病试验表明,转基因烟草植株对立枯丝核菌表现出了抗性。     

羽衣甘蓝胁迫应答基因BoRS1转化烟草的初步研究

将克隆于羽衣甘蓝的胁迫应答基因BoRS1连入中间载体p35S-2300：：gus：：noster相应位点,成功地构建了含BoRS1基因的植物双元表达载体p35S-2300：：BoRS1：：noster,并通过农杆菌介导法对烟草进行了遗传转化。PCR检测结果表明目的基因BoRS1已成功地导入并整合到烟草基因组中。RT-PCR分析显示,在不同的转基因烟草植株中BoRS1表达量存在差异。转BoRS1烟草的耐干性和甘露醇胁迫研究表明,BoRS1基因的表达对提高植物抗干旱胁迫能力有一定的作用。     

甜味蛋白thaumatin基因转入烟草的研究

利用基因工程技术 ,将分别克隆在两个不同载体上的甜味蛋白 thaum atin c DNA基因片段连接成一个完整的 c DNA基因 ,并将该基因克隆进 p BI12 1,构建成表达载体 p BI12 1- tha.通过冻融法导入农杆菌 ,农杆菌介导叶盘法转入烟草 ,经过组培 ,得到转基因的植株 .提取转基因烟草总 DNA,经 PCR,PCR- Southern和 Southern杂交证实 ,甜味蛋白基因已整合到烟草基因组中 .RT- PCR结果证明 ,thaumatin基因已在转基因烟草中转录成 m RNA,但SDS- PAGE和甜味尝试都表明 thaumatin基因在转基因烟草中没有表达出甜味蛋白     

植物介导的RNA干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的转基因番茄的研究

本研究构建了植物干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的载体pBI-RNAi;建立了番茄再生体系和番茄农杆菌侵染后的再生体系;并利用该体系转化了对照空载体pBI121和干扰载体pBi-RNAi,经过卡那霉素抗性筛选和基因组DNA中报告基因及RNAi片段的PCR检测筛选,一共获得5株pBI121转化的阳性植株,获得9株p BI-RNAi转化的阳性植株。该研究为今后进行转基因植株介导的干扰线虫目的基因的表达,降低线虫侵染能力的研究奠定了基础。     

拟南芥AtPI基因植物表达载体的构建及其在烟草中的遗传转化

花是被子植物主要的繁殖器官,在繁育后代的过程中,发挥着极其重要的作用,PISTILLATA(PI)基因作为控制花器官发育的B类功能基因中的一员,在花器官发育中起到重要的作用。为探究PI基因在花瓣和雄蕊发育中的功能,本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的PI基因作为研究对象,利用PCR技术从拟南芥花序c DNA扩增出At PI基因,构建植物表达载体(p ROKⅡ-At PI)并进行烟草(Nicotiana tobacum)转化。转基因植株的PCR检测结果表明,At PI基因已经整合到了烟草基因组中。在T2代植株中,通过实时定量荧光PCR检测显示,At PI在m RNA水平也均有表达。过量表达PI的转基因烟草在花器官中存在明显表型,与野生型相比主要表现为转基因植株花冠变小,雄蕊缩短,果实畸形且子房基部比野生型长5~10 mm,上述结果表明At PI基因是特异性参与雄蕊和花瓣的发育并起着至关重要的作用。     

拟南芥CYCD2;1基因植物表达载体的构建及在烟草中的遗传转化分析

细胞分裂是生物的基本特征之一,在植物生长发育的过程中,发挥着极其重要的作用,细胞周期蛋白CYCD2;1基因作为一个调控因子,对调节细胞周期具有重要作用。本文以拟南芥细胞周期蛋白(At CYCD2;1基因)作为研究对象,利用PCR技术从拟南芥花序c DNA扩增出At CYCD2;1基因,构建植物表达载体(pROKIIAt CYCD2;1)并利用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草。转基因植株的PCR检测结果表明,At CYCD2;1基因已经整合到了烟草基因组中。在T2代植株中,通过实时定量荧光PCR检测显示,At CYCD2;1在mRNA水平也均有表达。过量表达CYCD2;1的转基因烟草在花器官中存在明显表型,与野生型相比主要表现为转基因植株花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,上述结果表明At CYCD2;1基因影响花的发育。     

含VHb基因和GFMcryIA基因的双价基因植物高效表达载体的构建

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体PGBI4ASVHBBt,vgbM基因表达盒中含2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;Bt基因表达盒中,除含有以上提高转录和翻译的调控元件外,还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。利用根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株;PCR及Southern blot检测,证实了双价基因在烟草基因组中的整合;Western blot检测证实了vgbM基因在转基因烟草中的表达;杀虫实验表明GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。     

桃蚜MpAChE基因RNAi表达载体构建及转化

通过害虫取食植物表达害虫发育关键基因dsRNA的转基因植株,分析能否通过抑制害虫特定基因的表达来防控害虫。本研究利用RT-PCR技术从桃蚜中克隆乙酰胆碱酯酶基因383 bp cDNA片段,命名为MpAChE。进一步利用该MpAChE基因片段构建植物RNAi表达载体RNAi-MpAChE,并通过浸花法转化野生型拟南芥,通过卡那霉素抗性筛选转化植株,PCR及Southern杂交进一步鉴定转基因植株。结果表明:克隆的cDNA片段与桃蚜中已克隆的乙酰胆碱酯酶(GenBank登录号AY147797)cDNA序列核苷酸一致性为99%。卡那霉素抗性初步筛选和PCR进一步鉴定,获得25株阳性转基因植株。从25株中随机选择的5株阳性植株,Southern杂交均为阳性。经接种桃蚜初步鉴定,转基因植株对蚜虫的抗性效果不显著。     

绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用(英文)

用合成的cry1Ac基因与绿色荧光蛋白基因 (GFP)构成融合蛋白基因 ,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg ,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下 ,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光 ;经抗虫试验、PCR、Southernblot和Westernblot等检测 ,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因 ,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统 ,简化了抗虫转基因植物筛选程序 ,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

绿色荧光蛋白基因（G卯）在抗虫转基因植物研究中的应用

用合成的crylAc基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)构成融合蛋白基因,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光;经抗虫试验、PCR、Southern blot和Western blot等检测,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统,简化了抗虫转基因植物筛选程序,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

转popW基因烟草的构建及相关表型分析

PopW是克隆于青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum ZJ3721中的一种新的编码harpin蛋白的基因,原核表达的PopW蛋白能够诱导烟草对TMV的抗性、促进烟草生长、提高烟草品质。将popW基因连接到植物表达载体pBI121上,构建成重组转基因载体pB-popW,通过冻融法转化根癌土壤杆菌EHA105,获得阳性转化子。再采用叶盘法转化三生烟Nicotiana tobacum cv.Xanthi nc.,经卡那霉素抗性筛选、PCR检测、RT-PCR分析获得21个株系的T3代阳性植株。PCR及RT-PCR检测结果表明popW基因已经整合到烟草基因组中,并在转录水平正常表达。GUS染色进一步证明popW基因在翻译水平上进行了表达,且不同株系之间表达存在差异。对烟草花叶病毒(TMV)的抗病性测定结果表明,转基因烟草对TMV的抗病性增强,防效最高达54.25%。转基因烟草在生长上也具有一定优势,生长15 d的根长最高为野生型的1.7倍,移栽后60 d的株高、鲜重、干重最高分别为野生型烟草的1.4、1.7和1.8倍。