大别山野生油茶中茶氨酸检测与茶氨酸合成酶基因克隆

茶氨酸是茶树叶片中最丰富的游离氨基酸,具有重要的生理药理功能,但迄今仅在蘑菇、蕈和一些山茶科(属)植物中检测到茶氨酸。茶氨酸因有一种独特的风味特色"umami鲜爽味"而被人类营养学广泛研究,并发现合成茶氨酸的植物不仅在植物分类上具有积极意义,而且对于植物资源的有效发掘有巨大经济价值;同时还可以间接去研究茶树中茶氨酸的代谢机理以及茶氨酸合成酶的分离纯化和TS基因的克隆表达。该文运用HPLC、LC-TOF/MS对大别山地区野生幼年与成年油茶根、叶中茶氨酸进行检测,并结合分子生物学手段对油茶中茶氨酸合成酶(theanine synthetase,TS)基因进行克隆与生物信息学分析。结果表明:在幼年的油茶根中检测到茶氨酸,含量为0.08mg·g-1(鲜重),而在幼年的油茶叶片和成年油茶根、叶中均未检测到茶氨酸;在幼年油茶根中克隆出一条长为1 071bp油茶TS基因开放阅读框,其基因序列与茶树谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,AB117934)基因和TS(DD410896)序列的同源性达到98%,氨基酸序列与茶树中GS(AB117934)和TS(DD410896)的相似性高达99%。经生物信息学分析,该序列编码的TS蛋白具有20个磷酸化位点,不存在信号肽序列与跨膜结构,含有卷曲螺旋结构的亲水性细胞质蛋白。该研究将为油茶新经济价值的发掘,为茶氨酸在油茶中合成代谢途径的研究提供一定的理论基础,同时也为进一步研究茶氨酸在茶树中代谢机理提供了新的研究思路。     

茶树茶氨酸合成酶基因的酶活性验证与蛋白三维结构分析

针对NCBI上已登录的茶氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶基因序列进行克隆、原核表达与酶活性验证,利用多种生物信息学数据库和软件,对Cs TS与Cs GS基因进行结构、性质和功能预测,采用同源建模法对蛋白三维结构进行预测,比较并预测催化作用位点的差异;用系统进化树分析从裸子植物到高等被子植物的谷氨酰胺合成酶基因序列,推测其进化的演变过程;通过对原核表达的基因工程菌提取粗酶液进行酶活性测定。结果表明:尽管茶树TS与GS序列高度同源,但是原核表达后的融合蛋白仍然显示了不同的催化能力,蛋白一、二级结构分析显示Cs TS与Cs GS差异不大,但是通过同源建模形成的蛋白三级结构分析显示,Cs TS与Cs GS存在3个催化位点上的差异,这可能是导致其酶活性差异的关键。系统进化分析结果首次确定茶氨酸合成酶应为谷氨酰胺合成酶基因家族成员,按照其细胞定位预测应为胞质型GS,其亲缘关系与同为双子叶植物的葡萄、陆地棉、巴西橡胶树、拟南芥较接近。     

氮素水平对花生氮素代谢及相关酶活性的影响

 在大田高产条件下研究了氮素水平对花生(Arachis hypogaea)可溶性蛋白质、游离氨基酸含量及氮代谢相关酶活性的影响, 结果表明, 适当提高氮素水平既能增加花生各器官中可溶性蛋白质和游离氨基酸的含量, 又能提高硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶等氮素同化酶的活性, 使其达到同步增加; 氮素水平过高虽能提高硝酸还原酶和籽仁蛋白质含量, 但谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性下降; N素施肥水平不改变花生植株各器官中可溶性蛋白质、游离氨基酸含量以及硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶活性的变化趋势, 但适量施N (A2和A3处理)使花生各营养器官中GS、GDH活性提高; 氮素水平对花生各叶片和籽仁中GS、GDH活性的高低影响较大, 但对茎和根中GDH活性大小的影响较小。     

浑球红假单胞菌氨同化途径的研究

本文测定了浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株601谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和丙氨酸脱氢酶(ADH)的活性。低氨时,GS/GOGAT活力高,GDH活力低,高氨时,GS/GOGAT活力低,GDH活力高。在以分子氮或低浓度氨为氮源的培养条件下,加入GS抑制刑MSX(L—methionine—DL—sulphoximine),细菌生长受到抑制。但是,生长在以谷氨酸为氮源的细菌则不受影响。上述结果表明,浑球红假单胞菌菌株601氨同化是通过GS/GOGAT途径和GDH途径。     

茶树谷氨酰胺合成酶同源基因的克隆及表达分析

在实验室前期构建cDNA幼根文库获得谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,EC 6.3.1.2)同源序列(contig48)的基础上设计引物,通过SMART RACE技术克隆了该基因cDNA全长序列(命名为GS1-2,GenBank登录号:JQ925873.1)。结果显示:(1)GS1-2基因全长为1 710bp,开放阅读框长1 071bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子质量为39.3kD,理论等电点为5.65;核酸序列分析表明,GS1-2基因与从安吉白茶中克隆的茶氨酸合成酶基因相似性为99%。(2)将GS1-2基因克隆至原核表达载体pET-32a和pMAL-c5x,转化至大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测结果表明,pET-32a-CsGS1-2转至Rosetta中诱导表达的蛋白与预测蛋白大小一致,主要以包涵体形式存在;而pMAL-c5x-CsGS1-2转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达可产生可溶性蛋白。(3)进一步构建茶树GS1-2酵母表达载体pYES-DEST52-CsGS1-2并转化至酿酒酵母(WAT11)菌液中,添加底物(谷氨酸钠100μmol/L和盐酸乙胺500μmol/L)震荡培养并离心,UPLC-MS测定酶反应产物结果初步表明,目的蛋白不能催化盐酸乙胺和谷氨酸钠合成茶氨酸,但可以合成谷氨酰胺。     

纯化腐植酸对氮胁迫下黄瓜幼苗生长和氮代谢的影响

为研究纯化腐植酸(PHA)在不同水平氮胁迫下对黄瓜植株生长和氮代谢的影响,探明PHA对逆境胁迫的缓解作用机制,采用水培方式,选用新泰密刺为供试品种,以正常氮水平(11 mmol·L^-1 NO₃^-)为对照,进行低氮(1.0 mmol·L^-1 NO₃^-)和高氮(101 mmol·L^-1 NO₃^-)胁迫处理,研究纯化腐植酸对氮胁迫下黄瓜幼苗生长和氮代谢的影响.结果表明: 低氮和高氮胁迫均抑制了黄瓜幼苗生长,株高、茎粗、叶面积、干物质积累量均低于正常氮水平处理.施用纯化腐植酸促进了正常氮水平及低氮胁迫下黄瓜干物质积累,在高氮胁迫下差异不显著.PHA影响了黄瓜幼苗NO₃^-的吸收,呈低氮下促进、高氮下抑制吸收的趋势;PHA显著降低了低氮、高氮胁迫下根系和叶片中的铵态氮含量;与正常氮水平相比,低氮、高氮胁迫下根系和叶片的硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)活性及根系中亚硝酸还原酶(NiR)活性均显著降低,PHA不同程度地提高了NR、NiR、GS、GOGAT、GDH活性,还提高了根系和叶片中游离氨基酸、可溶性蛋白的含量.综上,添加PHA缓解了氮胁迫对黄瓜幼苗生长的抑制作用.     

快生型大豆根瘤菌的渗透调节

弗雷德中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)RT 19是快生型大豆根瘤菌。该菌株在不同浓度NaCl条件下,其细胞内的游离谷氯酸和钾离子含量随盐浓度的提高而急剧增加。在无盐和低浓度NICl条件下,测不出细胞内有游离苏氨酸,但在较高浓度盐存在时,其含量也随着盐浓度的提高而递增。RT19在对数生长后期,突然加入NaCl,使其培养液中的NaCl的最终浓度达到300mmol／L,定时取样测定细胞内氨基酸含量,发现5分钟后谷氨酸含量急剧上升,比不加盐的对照高出5倍,而且在3小时内保持不变．苏氨酸也出现类似情况。测定了RT 19及其转化子RTt1 9和gTt50的谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)在盐压下的活性,发现在300 mmol／L NaCl或300mm。I／L KC1存在时,GDH酶活性稍为下降或不变,而GS和GOGAT酶活性则显著提高。     

氮素水平对茶树叶片氮代谢关键酶活性及非结构性碳水化合物的影响

以福鼎大白茶(FD)、保靖黄金茶1号(HJ1)、白毫早(BHZ)为材料,设置不施氮N_0(0 g)、低氮N1(11 g)、中氮N_2(22 g)和高氮N_3(33 g)4个氮素水平的盆栽实验,研究了铵态氮对3个品种茶树的根系活力、氮代谢关键酶及非结构性碳水化合物(NSC)的影响。结果表明:随着施氮水平的提高,N_2、N_3处理的茶树根系活力较对照N0显著增加(P0.05),但二者间无显著差异;叶片谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性总体呈上升趋势;与对照比较,茶树叶片全氮和可溶性蛋白含量增加,其中HJ1在N_2和N_3处理后显著增加(P0.05);在3个茶树品种中,非结构性碳水化合物中可溶性总糖含量均呈上升趋势,淀粉含量具有品种特异性,施氮处理后3个茶树品种氮代谢关键酶活性及NSC含量变化存在差异,以HJ1的氮同化关键酶GS、GOGAT酶活性较高、根系活力较强,氮代谢产物显著增加,表明其具有较高的氮同化速率。施氮后HJ1的总NSC的含量及碳氮比的变化幅度较另外2个品种小,能够更好的保持碳氮平衡,游离氨基酸含量增幅较高,品质更优。因此,通过茶树氮代谢关键酶活性及非结构性化合物的研究能为茶树品种的品质评价以及提高茶树的品质和氮素利用效率提供依据。     

水稻永绿色基因超表达和突变对其叶片氮碳代谢若干指标的影响

通过水培实验,研究了水稻永绿色(Stay-green rice,SGR)基因超表达和突变对叶片氮碳代谢的影响。结果表明,在正常生长条件下,SGR基因超表达降低了水稻叶片可溶性蛋白、叶绿素及淀粉的含量,但可溶性糖和游离氨基酸含量增加,并提高了谷氨酰胺合成酶(GS)活性和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性;SGR基因突变增加了水稻叶片淀粉和可溶性蛋白质含量,并提高了硝酸还原酶(NR)活性。在缺氮条件下,SGR基因超表达与野生型叶片各生理指标的变化趋势一致,但是SGR基因突变体叶片中淀粉含量的变化趋势与野生型及SGR基因超表达的不一致。这说明SGR蛋白水平的变化在一定程度上影响了水稻叶片的氮碳代谢。     

用氨基酸分析仪测定茶氨酸

茶氨酸是茶中主要的和特有的氨基酸。除山茶、茶梅等茶科植物外,至今尚未在其它植物中检出。茶叶中茶氨酸的含量甚高,约占游离氨基酸总量的50—70％,直接影响茶树的新陈代谢和茶叶品质。绿茶茶氨酸含量与滋味等级呈正相关,红茶汤味也受茶氨酸     

蓝藻的光合固氮和谷氨酰胺合成酶之间的关系初探

蓝藻一类固氮生物固定空气中分子氮所形成的氨的进一步同化虽然不属于生物固氮的概念和研究范畴,但是,由于氨对蓝藻固氮酶有阻抑效应,所以细胞中要不断进行固氮作用,则必须将固氮产物氨立即通过氨基酸合成蛋白质。这一过程是通过谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)的偶联,以及各种氨基酸和蛋白质合成酶参与下     

铁观音原生质体高效瞬时转化方法的建立

近年来, 茶树基因组测序的完成为茶树在分子和基因水平的研究奠定了基础。但由于转基因技术尚不成熟且茶树生长周期较长, 茶树的基因功能研究依然不能有效开展。采用铁观音(Camellia sinensis var. sinensis cv. ‘Tieguanyin’)实生幼苗叶片, 通过筛选多种纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇的浓度组合, 并结合原生质体的数量、活性和杂质含量综合确定了最佳配方, 成功建立了铁观音茶苗叶片原生质体提取和PEG介导的高效瞬时转化体系, 转化率达56.25%。利用该系统探索了茶氨酸代谢通路中2个重要合成酶(茶氨酸合成酶(TSI)和谷氨酰胺合成酶(GSII-1.1))的亚细胞定位。研究发现, 这2种酶均定位于铁观音原生质体细胞质中。茶苗叶片原生质体提取和瞬时转化体系的建立为茶树基因组功能研究奠定了技术基础。     

氨基酸在茶叶制造中的转化机理及对茶叶品质的影响

<正> 茶鲜叶的氨基酸含量为干物的1.5～4.0％,嫩叶中含量较多,老叶较少。已分离鉴定的氨基酸有25种以上,其中茶氨酸约占氨基酸总量的50％以上,约占茶叶干物量的1％,其次是谷氨酸,精氨酸,丝氨酸,天冬氨酸等。由于氨基酸本身就是滋味物质     

外源γ-氨基丁酸（GABA）对低氧胁迫下甜瓜幼苗根系GABA代谢及氨基酸含量的影响

采用水培法,通过准确控制营养液溶氧浓度,研究了外源γ-氨基丁酸（GABA）对低氧胁迫0~8 d ‘西域一号’甜瓜幼苗根系GABA代谢及氨基酸含量的影响.结果表明：与通气对照相比,低氧处理的甜瓜幼苗正常生长受到严重抑制,其根系谷氨酸脱羧酶（GAD）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酰胺合成酶（GS）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性以及GABA、丙酮酸、丙氨酸、天冬氨酸含量均显著提高,而谷氨酸和α 酮戊二酸含量在处理4~8 d均显著降低.与低氧处理相比,外源GABA处理有效缓解了低氧胁迫对幼苗根系生长的抑制作用,同时甜瓜根系内源GABA、谷氨酸、α-酮戊二酸、天冬氨酸含量显著提高,但GAD、GDH、GOGAT、GS、ALT、AST活性在整个处理过程中均显著降低,丙酮酸和丙氨酸含量也显著降低.低氧同时添加GABA和γ-乙烯基 γ-氨基丁酸（VGB）处理显著降低了低氧胁迫下GABA的缓解效应.低氧胁迫下外源GABA被植物根系吸收后,通过反馈抑制GAD活性维持较高的Glu含量,保持植物体内碳、氮代谢平衡,维持正常生理代谢,从而缓解低氧胁迫对甜瓜幼苗的伤害.     

农杆菌介导的转谷氨酰胺合成酶基因小麦的抗除草剂特性研究

 谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS,E.C. 6.3.1.2）是植物氨同化过程中的关键酶,对植物的氮素吸收和代谢起着至关重要的作用。谷氨酰胺合成酶还是除草剂草胺膦(Phosphinothricin　(PPT)或Basta)的靶标酶。前期工作已从我国特有的豌豆(Pisum satium)品种中克隆了细胞质型谷氨酰胺合成酶（GS1）cDNA和叶绿体型谷氨酰胺合成酶（GS2）cDNA。为了验证谷氨酰胺合成酶的功能,构建了同时含有GS1 cDNA和GS2 cDNA的植物表达载体p2GS。以该表达载体通过农杆菌介导法,转化小麦(Triticum aestivum)的未成熟胚愈伤组织,经PPT筛选及分化再生培养,获得了抗PPT的转基因小麦植株41株。PCR和基因组Southern 杂交分析证实了GS1 和GS2基因已经整合到转基因小麦的基因组。用除草剂草胺膦Basta溶液涂抹转p2GS小麦叶片,结果证明GS转基因植株可以抗高达0.3%的 Basta溶液,而对照植株叶片逐渐变黄直至枯死。转基因小麦植株能正常结实。上述实验结果表明：1) GS基因在小麦植株中获得了有效表达,从而赋予小麦植株抗PPT特性;2) GS基因能够作为研究小麦遗传转化的筛选标记基因。     

茶氨酸的制取及应用

茶氨酸是茶叶中的一种主要氨基酸 ,通常占茶叶干重的 2 %左右 ,约占茶树体内游离氨基酸5 0 %。茶氨酸具有鲜甜味 ,是茶叶特征物质之一 ,与茶叶品质呈正相关。现已作为食品添加剂应用于食品领域。除此以外 ,茶氨酸还具有一些重要的药理作用。如抗肿瘤、降压安神、拮抗咖啡碱等医疗功效。本文综述了茶氨酸的性质、制取方法及应用前景等方面的内容。     

遮阴对柠檬香茅类黄酮及其合成酶基因差异表达研究

为了解柠檬香茅(Cymbopogon citratu)中类黄酮及其合成酶基因信息,以阳光直射及遮阴环境下生长的柠檬香茅嫩叶为材料,进行代谢组、转录组结合qRT-PCR验证分析。结果表明,柠檬香茅中含有11类共69种黄酮化合物,其中芦丁、去甲基托罗沙黄酮、紫云英苷及葡萄糖醇等类黄酮化合物在遮阴环境下相对含量显著降低;类黄酮生物合成涉及10类酶54个基因,其中类黄酮3''羟化酶(c99177.1)等4个酶基因在遮阴环境下相对表达量显著降低,而异黄酮合成酶(c51975.0)等6个酶基因相对表达量正好相反;其中5个类黄酮合成酶基因在光照及遮阴柠檬香茅中的上下调表达趋势与转录组测序结果中FPKM值变化一致,而二者检测结果中差异表达倍数存在差异。遮阴使柠檬香茅中大多黄酮类化合物相对含量降低,而其合成酶基因上下调表达趋势规律不明显。     

遮阴对柠檬香茅中萜类化合物及其合成酶基因影响研究

为获取柠檬香茅(Cymbopogon citratus)中萜类化合物及其合成酶基因信息,以正常生长及遮阴下的柠檬香茅嫩叶为材料,进行代谢组学和转录组学结合q RT-PCR验证分析。代谢组分析结果表明,柠檬香茅所含萜类共23种,包括单萜4种、倍半萜4种、二萜8种、三萜3种和四萜4种。在遮阴下,柠檬香茅的二萜类银杏内酯C和四萜类虾青素相对含量更高。转录组测序结果表明,单萜生物合成涉及4类合成酶的24个基因,二萜生物合成涉及11类合成酶的49个基因,倍半萜和三萜生物合成涉及12类合成酶的58个基因,其中6类合成酶的8个基因在遮阴下的相对表达量显著提高,而前萘二烯加氧酶(c64786.0)基因正好相反。q RT-PCR分析表明,遮阴下4个FPKM值差异明显的萜类合成酶基因表达的变化趋势与转录组测序结果一致,但不同合成酶基因的差异表达量存在差异。因此,柠檬香茅所含4类共23种萜类化合物由27类合成酶共131个基因编码而来,不同光照强度影响9个合成酶基因的表达和2种萜类化合物含量。     

刺芹侧耳谷氨酰胺合成酶编码基因克隆和表达分析

谷氨酰胺合成酶（GS）是真菌氮素同化代谢和谷氨酸合成中的关键酶,采用3’RACE和5’RACE实验技术,克隆获得刺芹侧耳（杏鲍菇）谷氨酰胺合成酶编码基因（PE-GS）全长序列,长度为1 271bp,具有4个内含子和5个外显子,编码353个氨基酸残基。系统进化树分析表明,刺芹侧耳PE-GS与糙皮侧耳GS在分子进化关系上相近。通过real time RT-PCR方法对PE-GS基因在刺芹侧耳基质菌丝体和子实体中的表达情况进行了分析,结果表明,刺芹侧耳PE-GS基因在子实体具有较高的表达水平,这暗示刺芹侧耳PE-GS基因在子实体的氮素代谢中可能承担重要功能。     

光质对韭菜碳氮代谢、生长和品质的影响

以‘平韭2号’为试材,以白光(W)处理为对照(CK),研究白+红(WR)、白+蓝(WB)、白+绿(WG)、白+紫(WP)4种不同光质处理对韭菜碳氮代谢、生长和品质的影响.结果表明: WR处理韭菜的光合速率(P_n)显著高于CK,而WB、WG和WP与CK无显著差异,但RuBP羧化酶(RuBPCase)活性均显著高于CK.各处理相比,总糖含量以WR最高,WP其次,WB和WG最低.WR下韭菜蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性显著高于CK,其余三者均显著低于CK,其中以WB最低,但蔗糖合成酶(SS)和淀粉酶(AMS)活性均以WB最高,WR最低,WG和WP的SS活性与CK无差异,但AMS活性显著低于CK.可见,增加红、紫光比例可促进韭菜碳的同化和转化,加速糖的积累.总氮、蛋白氮含量、硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性以WB最高,显著高于CK,但WB下谷氨酸脱氢酶(GDH)活性最低,显著低于CK;WR的蛋白氮和非蛋白氮含量、NR和GS活性最低,显著低于CK,GOGAT和GDH活性显著高于CK,且GDH在所有处理中最高;WG的全氮、非蛋白氮含量及GDH活性均显著低于CK,但蛋白氮含量、NR和GOGAT活性显著高于CK,WP的氮含量及相关酶活性呈现出与WG相同的趋势,且GS活性亦同样高于CK.说明增加蓝光、紫光和绿光可使韭菜氮代谢增强,而增加红光对蛋白质的合成有一定的抑制作用.红光和紫光下韭菜生长较好,而蓝光则抑制其加粗生长,叶片较薄,单株生长量较低.紫光下韭菜的粗纤维含量最低,营养品质最优,因此,紫光对韭菜的生长最有利.