香石竹DcPAL1基因的克隆及其原核表达

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物苯丙烷类代谢途径的关键酶。利用RT-PCR及RACE技术从香石竹茎中克隆到苯丙氨酸解氨酶基因的全长cDNA,命名为DcPAL1(GenBank登录号为FJ864719)。DcPAL1全长2 397bp,预测其开放阅读框长2 121bp,编码一个含有706个氨基酸的蛋白质,其分子量为76.8kD,等电点5.84,且含有PAL的特征序列和活性位点。构建pET-DcPAL1原核表达载体,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,获得1个与预测大小一致的外源蛋白,主要以包涵体形式存在。用Ni2+-NTA螯合琼脂糖层析柱亲和层析得到了纯化的表达蛋白。     

重组人FLT3配体的克隆、表达及功能鉴定

通过克隆人ＦＬＴ３配体（ｒｈＦＬ）基因,建立其原核高效表达系统,为大规模获得ｒｈＦＬ产品,促进干细胞体外扩增移植等新技术在临床的应用创造条件。他离人外周血单个核细胞,提取总ＲＮＡ,采用ＲＴ－巢式ＰＣＲ扩增可溶型ＦＬ基因,以双脱氧终止法进行ＤＮＡ序列分析,将目的基因与ｐＰｒｏＥＸＨＴ载体连接,重组本引入大肠杆菌并在ＩＰＴＧ诱导下表达;亲和层析纯化表达产物,观察其刺激ＣＤ３４＾＋细胞增殖的情况。从人外     

植物类黄酮3’-羟化酶（F3’H）基因的研究进展

本文介绍了植物F3’日基因的克隆、序列分析、表达分析、系统进化及转录调控的研究进展。     

猪POU1F1基因5’侧翼区克隆及序列分析

POU1F1基因是POU基因家族的成员之一,对哺乳动物的早期发育和相关基因启动表达起重要的调控作用。本文利用染色体步移技术,从长白猪基因组中首次克隆到了约1．5kb的POU1F1基因5’侧翼区序列,并利用相关软件对其进行了序列分析和物种间POU1F1基因5’侧翼区序列比对及进化树构建。结果表明所克隆的片段中含典型的TATA盒（-57）和类CAAT盒序列（-87）。TESS软件分析发现在启动子附近有一系列潜在的重要的转录因子结合位点。序列比对结果表明不同物种POU1F1基因的转录起始点上游-150bp区域保守性较强,可能是启动子的核心序列。其中猪与牛的同源性最高,其次是黑猩猩、人、狗,与大鼠、小鼠和鸡同源性较低,与斑马鱼序列同源性最低。同源序列主要集中在转录起始点上游-150bp至-1000bp区域。Vista中的MLAGAN程序构建的系统进化树真实反应了物种间进化关系。     

重组人FLT3配体的克隆、表达及功能鉴定

通过克隆人FLT3配体(rhFL)基因,建立其原核高效表达系统,为大规模获得rhFL产品,促进干细胞体外扩增移植等新技术在临床的应用创造条件。分离人外周血单个核细胞,提取总RNA,采用RT-巢式PCR扩增可溶型FL基因,以双脱氧终止法进行DNA序列分析;将目的基因与pProEXHT载体连接,重组体引入大肠杆菌并在IPTG诱导下表达;亲和层析纯化表达产物,观察其刺激CD34⁺细胞增殖的情况。从人外周血单核细胞中克隆得到长481bp的rhFL基因,测序结果与已知人FL基因序列一致;rhFL的表达量约占菌体蛋白总量的15%,经亲和纯化纯度达90%以上;rhFL⁺G-CSF⁺EPO刺激CD34^＋细胞增殖约400倍。获得了rhFL基因及其在大肠杆菌中的高效表达,初步建立了产物纯化途径,纯化后的rhFL具有较强的刺激造血干/祖细胞增殖的能力。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因截短体的克隆与原核表达

禽流感病毒H5N1 NS1蛋白是一种非结构蛋白,在病毒感染过程中发挥着重要的作用.构建基因截短的重组蛋白,可为进一步研究NS1不同结构域与宿主蛋白间的相互作用奠定基础.在成功克隆禽流感病毒H5N1全长NS1基因并测序的基础上,将部分截短基因序列克隆到表达栽体pET28a(+)上,构建基因截短的重组表达质粒pET28a-NS1-RBD和pET28a-NS1-ED,转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性重组质粒经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,然后利用Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化,并通过Western Blotting进一步确认NS1及截短体蛋白的表达.结果表明,实验成功构建禽流感病毒H5N1亚型的NS1蛋白截短体,并在大肠埃希菌中高效表达,这为进一步研究NS1蛋白不同结构域与宿主蛋白的相互作用提供了实验材料,为深入研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

百合黄烷酮3-羟化酶基因LhSorF3H的克隆与表达

为了探究百合花色的调控机制,以东方百合品种‘索邦’(Sorbonne)的花蕾为试验材料,根据前期转录组测序结果,成功克隆出黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因的编码序列和基因组序列,其中,编码序列全长1 110bp,可编码369个氨基酸;基因组序列全长1 438bp,包含3个外显子和2个内含子,命名该基因为LhSorF3 H(GenBank登录号为MF614135)。生物信息学分析结果显示,黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性。LhSorF3 H编码的蛋白与郁金香(Tulipafosteriana)最为相似。半定量RT-PCR结果显示,LhSorF3H在花被、柱头以及花柱中表达明显,在花丝、子房、嫩茎、茎生根及上部叶片中表达较弱,而在花药和中下部叶片中基本不表达。LhSorF3 H在不同发育阶段的花被片中均有表达(S2和S6阶段除外);黑暗处理使LhSorF3 H表达降低,黑暗处理2h的LhSorF3 H表达量降到最低,之后表达量开始上升;转入光照条件后,LhSorF3H的表达水平持续增加。研究表明,LhSorF3 H基因对昼夜节律和光照具有双重响应的特性。     

中华绒螯蟹组蛋白H3基因保守序列的克隆、表达及抗体制备

为了研究组蛋白H3在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精子发生中的动态特征,采用PCR技术扩增中华绒螯蟹H3基因编码区的DNA片段,将其重组至含有6个His标签序列的原核表达质粒pET-30a(+)上,转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中,以0.2 mmol/L的异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生pET-30a-H3重组蛋白。SDS-PAGE表明,重组菌成功表达出了分子量约为21 ku的目标蛋白质,融合蛋白以上清和包涵体的形式存在。采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备兔抗血清。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体具有较好的特异性。至此,成功地克隆了中华绒螯蟹H3编码区基因并制备了多克隆抗体,为进一步研究其在精子发生中的动态特征提供了基础。     

人TRAF3IP3基因剪接异构体2的克隆表达和生物信息学分析

[目的]克隆、原核表达并纯化人类TRAF3IP3基因剪接异构体2(TRAF3IP3iso2),对TRAF3IP3iso2蛋白进行生物信息学分析。[方法]从人骨髓单个核细胞c DNA中扩增TRAF3IP3iso2开放阅读框区,双酶切连入原核表达载体p ET-28a(+),重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达效果,Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白;根据测序结果对TRAF3IP3iso2蛋白进行生物信息学分析。[结果]成功克隆了人类TRAF3IP3iso2编码区并构建了原核表达载体p ET-28a(+)-TRAF3IP3iso2,在大肠杆菌中诱导表达、纯化获得了相对分子量约22.7k Da的融合蛋白;生物信息学分析显示TRAF3IP3iso2蛋白二级结构以α螺旋为主,无TRAF3IP3iso1蛋白的跨膜区结构。[结论]证明了人类TRAF3IP3iso2的存在,为TRAF3IP3功能的研究提供了实验依据。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

大鼠肝脏F抗原基因的克隆、表达及产物纯化

肝脏F抗原是一种新型的能直接反映肝损伤程度的血清学标志,它是1968年由美国学者Fravi从小鼠肝中分离出来的[1].F抗原是存在于哺乳动物肝细胞质中的一种水溶性不稳定的单链蛋白质,相对分子量为43kD[2],正常肝组织中的F抗原含量是血清中的1370倍,只有肝细胞被破坏时,F抗原才释放     

细菌mtl-D朌基因的克隆及在转基因八里庄杨中的表达

运用ＰＣＲ方法克隆了大肠杆菌１－磷酸甘露醇脱氢酶（ｍｔｌ－Ｄ）基因,序列分析表明与已发表序列相比,除第 ４１６位密码子由 ＡＡＡ代替 ＣＡＴ、相应的氨基酸由 Ｌｙｓ代替 Ｈｉｓ外,其他部分均相同。该基因插入植物双元载体中,经土壤农杆菌介导导入八里庄杨［１］,经卡那霉素筛选后再经盐胁迫筛选获得一批较高耐盐性的转化植株,在附加 ０.６％ＮａＣｌ的培养基中生长良好,而对照在附加 ０．４％ ＮａＣｌ的培养基中不能存活。对转化植株进行的 ＰＣＲ检测、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,说明外源基因已整合到染色体上并且有转录。     

拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和纯化

拟南芥abi5基因编码了一个碱性亮氨酸拉链类转录因子,它在ABA信号转导过程中发挥着关键调控作用。本文以拟南芥为材料,通过RT-PCR扩增、克隆了包含abi5基因编码区的片段。核苷酸序列分析表明,所克隆的基因与NCBI数据库收录的abi5基因（GenBank登录号NM129185.3）有99.0%的一致性;氨基酸序列存在4个残基差异。所克隆的abi5基因被进一步亚克隆至pET-32a表达载体。序列测定核实构建正确的重组质粒（pET32a-ABI5）转化入大肠杆菌BL21 Star（DE3）中诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果表明,重组abi5基因在大肠杆菌表达的较适宜条件为：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）终浓度为0.3 mmol L-1、30℃下诱导4 h,可达到细菌裂解液上清蛋白的29.1%。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后的ABI5融合蛋白在SDS-PAGE电泳分析时呈现一条蛋白带。该条带经串联质谱分析证明为重组ABI5融合蛋白。     

不动杆菌3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达

3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）作为拟除虫菊酯类农药的非特异性降解中间产物,具有抗雌激素特性,可扰乱生物体内分泌系统,比菊酯类农药迁移更广,半衰期更长,生物毒性更大,是拟除虫菊酯类农药在生物体中暴露的标志。通过构建4-D菌(Acinetobacter sp.)基因组文库,混合池驯化筛选得到4-D菌中降解3-PBA的关键酶基因,其开放阅读框为921 bp,编码306个氨基酸,Genbank登录号为KR024742。经同源比对和酶活验证,证实该酶为邻苯二酚双加氧酶。根据该ORF序列设计引物,引物两端分别加上NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位点,以4-D菌基因组DNA为模板,成功克隆到D34基因序列。构建表达载体pET-21b-D34并转化进宿主大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（0.1 mmol/L）诱导后,表达重组菌对3-PBA降解率为18.7%。研究结果为3-PBA污染的微生物环境修复提供了理论参考。     

番茄转录调控因子基因Pti5植物表达载体的构建及其转化烟草的研究 Construction of a Plant Expression Vector with Tomato Transcription Factor Gene Pti5 and Studies on Transgenic Tobaccos

本实验构建了含有CaMV35S启动子控制下的Pti5-VP16基因的植物双元表达载体pBI121UCH1。通过根癌农杆菌叶盘转化法,将Pti5-VP16基因导入烟草SRI中,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株。经PCR和Southern印迹分析,表明抗性植株中整合了Pti5-VP16基因,经抗病性鉴定转基因烟草植株的抗病性明显提高。 Abstract:The plasmid pBI121UCH1 carrying Pti5-VP16 gene under the control of the cauliflower mosaic virus 35s promoter was constructed.Leaf segments of tobacco SRI were infected by Agrobacterium tumefaciens EHA105 with plasmid pBI121UCH1,from which kanamycin resistant plants were obtained.PCR and Southern analysis proved that the Pti5-VP16 gene was integrated into the genomes of the tobacco plants.The disease resistance assay showed that the disease resistance was enhanced in the transgenic tobacco plants.     

菠菜14-3-3蛋白基因的克隆及硝酸盐胁迫下的表达分析

利用RT-PCR和RACE技术,从菠菜中首次获得了14-3-3蛋白基因的全长cDNA序列(GenBank登录号JX952165),命名为So14-3-3.该基因全长1 166 bp,开放阅读框801 bp,编码266个氨基酸.序列比对发现So143 3蛋白与其他植物14-3-3蛋白氨基酸序列一致性高达77.6％～84.7％.半定量RT-PCR表明,随NO3-胁迫处理时间的延长和浓度的增加,菠菜根和叶中So14-3-3基因的表达增强.实验构建了pGEX4T-So14-3-3原核表达载体,并通过IPTG诱导后获得分子量约为56 kD的蛋白.进一步的蛋白质印迹检测结果表明,随着NO3处理时间的延长和浓度的增加,So14-3-3蛋白表达也增加.该实验结果为进一步研究So14 3-3蛋白功能提供了基本的实验基础.     

Identification of the molecular basis for the functional difference between flavonoid 3'-hydroxylase and flavonoid 3',5'-hydroxylase

Flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) and flavonoid 3',5'-hydroxylase (F3'5'H) are cytochrome P450 enzymes and determine the B-ring hydroxylation pattern of flavonoids by introducing hydroxyl groups at the 3'- or the 3'- and 5'-position, respectively. Sequence identity between F3'H and F3'5'H is generally low since their divergence took place early in the evolution of higher plants. However, in the Asteraceae the family-specific evolution of an F3'5'H from an F3'H precursor occurred, and consequently sequence identity is substantially higher. We used this phenomenon for alignment studies, in order to identify regions which could be involved in determining substrate specificity and functionality. Subsequent construction and expression of chimeric genes indicated that substrate specificity of F3'H and F3'5'H is determined near the N-terminal end and the functional difference between these two enzymes near the C-terminal end. The impact on function of individual amino acids located in substrate recognition site 6 (SRS6) was further tested by site-directed mutagenesis. Most interestingly, a conservative Thr to Ser exchange at position 487 conferred additional 5'-hydroxylation activity to recombinant Gerbera hybrida F3'H, whereas the reverse substitution transformed recombinant Osteospermum hybrida F3'5'H into an F3'H with low remaining 5'-hydroxylation activity. Since the physicochemical properties of Thr and Ser are highly similar, the difference in size appears to be the main factor contributing to functional difference. The results further suggest that relatively few amino acids exchanges were required for the evolutionary extension of 3'- to 3',5'-hydroxylation activity.     

番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。