杜氏盐藻psaB基因cDNA克隆及系统进化分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii及Chlorella vulgaris等光系统Ⅰ反应中心蛋白psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到的一段长为1.8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较,表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻光系统Ⅰ反应中心psaB基因的cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB的核苷酸序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB氨基酸序列相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92%,Chlamydomonas moewusii 91%,Chlorella vulgaris 86%,Mesostigma viride 85%,Phy -scomitrella patenssubsp.Patens 85%,Nephroselmis olivacea 84%。此外,psaB密码子偏爱性分析表明:杜氏盐藻psaB基因第三位密码子A和T的组成分别为35.7%和39.17%,而G和C分别为7.27%和17.85%,即杜氏盐藻psaB基因密码子的组成大多为NNA和NNT。根据psaB基因的特征,作者对绿藻门的50个物种的psaB基因作了进化分析,结果表明:杜氏盐藻与Haematococcaceae中的大多数种类进化地位最为接近,这为更进一步弄清杜氏盐藻的遗传背景提供了理论依据。     

杜氏盐藻psaB基因cDNA的克隆与序列分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydornonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride的psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RTPCR,得到的一段长为1．8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较．表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻psaB cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB基因相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92％,Chlamydornonas moewusii 91％,Chlorella vulgaris 86％,Mesostigma viride 85％,Physcomitrella patens subsp．Patens 85％,Nephroselmis olivacea 84％。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻psaB cDNA序列.     

SOEing 法构建EGFP真核表达载体及其在杜氏盐藻中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法（Gene splicing by overlap extension,SOEing）构建含有杜氏盐藻（Dunaliella salina）硝酸盐还原酶（NR）基因5′-上游序列（Pnr）and 3′-端序列（Tnr）的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,将杜氏盐藻NR基因Pnr与报告基因EGFP cDNA融合,并与pEGM-7zf克隆载体连接,顺序将盐藻NR基因Tnr序列与融合片段相连,构建含Pnr-EGFP-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NET。电击法转化杜氏盐藻,在盐藻转化株中观察到了EGFP的瞬时表达。此研究为转基因杜氏盐藻研究和成功建立杜氏盐藻生物反应器奠定了实验基础。     

杜氏盐藻泛素基因cDNA的克隆及系统进化分析

根据玉米,水稻等物种泛素序列设计一对简并引物.提取杜氏盐藻细胞的总RNA,利用RT-PCR方法扩增盐藻泛素基因的cDNA片断,回收两个长度不同的片断ubi-1和ubi-2,将其克隆到pMDl8-T载体上,测序后进行序列分析,为克隆杜氏盐藻泛素基因的cDNA序列并进行进化分析.结果 ubi-1经测序后得到一个完整拷贝(228 bp)和一个不完整的泛素cDNA序列(191 bp).Ubi-2经测序后得到两个拷贝(556 bp)和一个不完整的泛素cDNA序列(191 bp).盐藻3个不同拷贝泛素cDNA序列之间存在差异,但所编码氨基酸序列相同.盐藻泛素cDNA序列与其他物种的泛素cDNA序列具有高的同源(70%～85%),所推导的氨基酸序列与其他物种仅存在1～2个氨基酸的差异.进化分析显示,所分离的盐藻泛素基因与两个模式生物果蝇和衣藻的泛素基因共处一个进化支,彼此亲缘关系最近.盐藻泛素基因与其他物种的泛素基因可能来自共同的"祖先"基因.在进化中高度保守.     

高浓度钾抑制杜氏盐藻生长的生理机制

在含１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的杜氏盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌａｓａｌｉｎａ（Ｄｕｎａｌ）Ｔｅｏｄ．）培养液中加入５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上的ＫＣｌ可观察到Ｋ＋对杜氏盐藻生长有明显的抑制作用,而当ＫＣｌ达１００ｍｍｏｌ／Ｌ时,杜氏盐藻的生长被完全抑制。另一方面,当培养液中缺乏Ｋ＋时,杜氏盐藻的生长也被显著抑制。在正常培养条件下,伴随着杜氏盐藻的生长,培养液的ｐＨ由８左右升高至１０左右,而高浓度Ｋ＋则显著抑制杜氏盐藻培养液ｐＨ的升高;而在培养液ｐＨ为７．０至１０．０的范围内,不同ｐＨ对杜氏盐藻的生长无明显影响。将杜氏盐藻在高浓度Ｋ＋条件下预处理１２ｈ以上,杜氏盐藻的光合放氧速率显著下降,光合速率下降的程度与Ｋ＋浓度的高低和预处理的时间长短呈正相关。高浓度Ｋ＋处理也引起杜氏盐藻叶绿素含量的显著下降。对经高浓度Ｋ＋预处理的杜氏盐藻的光合放氧速率与培养液中ｐＨ变化同时进行测定的结果表明,Ｋ＋抑制杜氏盐藻光合速率的同时也显著抑制了光照条件引起的培养液ｐＨ的上升。实验结果表明,Ｋ＋抑制杜氏盐藻光合作用以及抑制杜氏盐藻生长与Ｋ＋影响跨盐藻质膜的质子运输之间可能存在一定关系。     

杜氏盐藻psaB基因cDNA的克隆与序列分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride的psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻（Dunaliella salina）细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到的一段长为1.8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较,表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻psaB cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB基因相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92%,Chlamydomonas moewusii 91%,Chlorella vulgaris 86% , Mesostigma viride 85%,Physcomitrella patens subsp.Patens 85%, Nephroselmis olivacea 84%。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻psaBcDNA序列。     

杜氏盐藻两种碳酸酐酶基因启动子的克隆和功能研究

将克隆得到的杜氏盐藻DCA7和CA基因的启动子区与bar基因和NOS polyA终止子片段融合,分别构建成pMDDC-B和pMDC-B转基因杜氏盐藻表达载体。用基因枪法将两种表达载体转化人杜氏盐藻细胞,通过除草剂草丁膦筛选培养获得转化藻株,对转化藻株进行分析。对转化杜氏盐藻藻株的筛选培养结果表明：pMDDC-B和pMDC-B载体中的外源bar基因能在杜氏盐藻细胞中稳定或瞬时表达。同时在氦气压力为690kPa条件下,微弹轰击2次比微弹轰击1次或3次的效果更好。对pMDDC-B转化杜氏盐藻得到的稳定表达的转化藻株进行的PCR和Southern印迹分析的结果表明：外源的bar基因确已整合到杜氏盐藻基因组中。Northern印迹分析表明：DCA7基因启动子驱动bar基因在杜氏盐藻细胞中的表达效率受氯化钠浓度梯度调控。推测首次克隆得到的DCA7基因启动子可能是一种活性高、安全性好的高渗诱导性启动子;杜氏盐藻DCA7和CA基因启动子区的GT高度重复序列,可能与杜氏盐藻高度耐盐的分子机制有关。     

杜氏盐藻分子生物学最新进展及展望

杜氏盐藻是一种无细胞壁的单细胞双鞭毛真核藻类,是一种十分重要的藻类资源。过去对杜氏盐藻的研究多集中在形态学、耐盐机理及β-胡萝卜素等方面,近年来,随着藻类基因工程的快速发展,本研究课题组及国内外在杜藻盐藻分子生物学方面做了大量工作,现就杜氏盐藻在这一领域的研究进展进行综述,主要是重要功能基因的克隆与分析、杜氏盐藻调控序列的研究以及杜氏盐藻作为宿主表达外源基因等。     

不同盐度胁迫下杜氏盐藻全转录组测序及注释

【目的】通过对杜氏盐藻的转录组进行测序和基因功能分析,阐明不同浓度盐胁迫对杜氏盐藻生长发育以及不同信号途径的影响。【方法】分别获取9%NaCl浓度和24%NaCl浓度培养下的杜氏盐藻转录组并通过Illumina平台进行测序。将所得的序列进行拼接、去冗余处理。【结果】获得40682个unigenes,其中注释到NR数据库的10905个,注释到NT数据库的2768个,注释到SWISS-PROT数据库的7261个,注释到COG/KOG数据库的6499个。受到高盐胁迫的杜氏盐藻细胞相比低盐环境下,有717个基因表达上调,1012个基因表达下调。进一步对60个显著差异基因进行了功能聚类,发现盐胁迫诱导了光合作用途径的基因表达。【结论】杜氏盐藻通过提高光合作用基因表达增强耐盐性。该研究最大范围上挖掘了杜氏盐藻在高盐和低盐环境的基因转录水平,为深入揭示杜氏盐藻盐胁迫下基因差异表达提供了平台,并为进一步研究杜氏盐藻耐盐机理提供理论依据。     

杜氏盐藻GAPDH cDNA的克隆鉴定及其启动子功能表达载体的构建

根据藻类甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)氨基酸高度保守序列设计简并引物,采用5',3'-RACE和巢式PCR的方法,得到了杜氏盐藻(Dunaliella salina)GAPDH cDNA全长序列.序列同源性比较和进化树等生物信息学分析结果表明,根据获得的盐藻GAPDH的核酸序列推导的氨基酸序列与其他已知物种的GAPDH有较高的同源性.定向克隆于原核表达载体的盐藻GAPDH cDNA在大肠杆菌中以融合蛋白的形式得到了高效表达,并成功构建了由盐藻GAPDH基因启动子驱动的cat(氯霉素乙酰转移酶)基因表达载体pUCGCat,为进一步研究杜氏盐藻GAPDH基因和启动子功能奠定了试验基础.     

杜氏盐藻外源基因稳定表达系统的构建

建立了一种单细胞海水绿藻--杜氏盐藻(Dunaliella salina Teod.)的外源基因稳定表达系统.通过电激法将携带乙肝病毒表面抗原基因(HBsAg)和氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)的质粒转入盐藻细胞内,CAT基因为筛选基因.PCR和Southern杂交结果显示,HBsAg基因已经整合到盐藻基因组中.Northern杂交结果表明,转化成功细胞内的该基因已转录成mRNA.HBsAgELISA和Western杂交检测证明,HBsAg蛋白在转化的盐藻细胞内稳定地表达.同时,PCR和Southern杂交显示,CAT基因也已整合到盐藻基因组中.且CATELISA检测证明,CAT蛋白在转化体中也已稳定地表达.进一步对转化盐藻进行无氯霉素筛选培养,60代后,HBsAg基因依然稳定地存在并表达.本实验第一次报道了外源基因在杜氏盐藻细胞内的稳定表达.     

丁草胺对杜氏盐藻生理生化的影响

采用室内模拟培养试验方法,研究了酰胺类除草剂丁草胺对杜氏盐藻(Dunaliella salina)生长和生理生化的影响。结果表明,低浓度的丁草胺对杜氏盐藻生长速率有促进作用,而高浓度的丁草胺对杜氏盐藻生长速率有显著的抑制作用,且随着浓度的加大,杜氏盐藻生长速率逐渐降低。丁草胺对杜氏盐藻藻细胞的光合色素含量、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性等也有影响。     

杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基STT3a功能结构域的克隆与表达分析

为了研究STT3a基因在杜氏盐藻耐盐及鞭毛再生方面的作用,根据衣藻、拟南芥等STT3a蛋白的氨基酸高度保守序列VCVFTA、DVDYVL设计一对简并引物,采用RT-PCR及3'RACE的方法扩增杜氏盐藻STT3a蛋白功能结构域的cDNA序列。序列分析显示克隆的cDNA全长1650bp,具有一定保守性,与衣藻、拟南芥和人的相似性分别为48%、50%和46%。实时荧光定量PCR结果显示杜氏盐藻STT3amRNA水平随着盐浓度的升高而逐渐增加,其水平在3.5mol/LNaCl浓度时比在1.5mol/LNaCl浓度时升高了11倍(P0.01)。另外,与没有脱鞭毛的杜氏盐藻相比,STT3amRNA在鞭毛再生过程中持续高表达。本研究显示杜氏盐藻STT3a基因的高表达可以增强其盐适应和鞭毛再生能力。     

氮源对杜氏盐藻生长及光合系统Ⅱ的影响

以NaNO3、CO(NH_2)_2、NaNO2、NH4Cl作为氮源,并设无氮处理,研究杜氏盐藻(Dunaliella salina)生长及其PSⅡ对不同氮源的响应特征,以明确杜氏盐藻对不同氮源的利用情况,为盐藻培养基的优化和营养盐的筛选提供理论依据。结果表明:(1)杜氏盐藻在CO(NH_2)_2环境中具更高的比增长速率[μmax,(0.482±0.032)/d]。(2)NaNO2、NaNO3、CO(NH_2)_2作氮源时,杜氏盐藻快速光响应曲线的初始斜率(α)、最大光量子产率(Fv/Fm)及反应活性中心所捕获的光能(ABS/RC)、反应活性中心捕获的激发能用于还原QA的能量(TR0/RC)、最大光化学效率(φP0)、t=0时捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过QA的其他电子受体的概率(ψ0)和t=0时用于电子传递的量子产额(φE0)在处理间均差异不显著(P0.05),但三者与无氮和NH4Cl处理组相比均具有显著差异。(3)与NaNO2、NaNO3、CO(NH_2)_2处理组相比,无氮环境使得盐藻相对可变荧光(Vj)显著升高,盐藻光合电子从QA-到QB的传递受阻,导致QA-大量积累;而NH4Cl做氮源时,杜氏盐藻叶绿素荧光动力学曲线的K相出现,使得其PSⅡ放氧复合体(OEC)受损。研究认为,杜氏盐藻在NaNO3、CO(NH_2)_2、NaNO2作为唯一氮源时均可良好生长,并在CO(NH_2)_2环境中生长得更快;缺氮胁迫使得盐藻生长受到显著抑制,PSⅡ反应活性中心的数量降低,电子传递受阻;而NH4Cl对杜氏盐藻的毒性效应使得其PSⅡ放氧复合体(OEC)受损,藻体在短期内开始死亡。     

盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其蛋白质结构预测

本文通过对盐生杜氏藻(Dunaliella salina) cDNA文库进行大规模EST测序并结合RACE实验克隆了盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因, 并且通过Southern blotting实验确定了该基因在这个物种中拷贝数。通过生物信息学的方法, 预测该基因所编码的蛋白质结构, 验证了该蛋白质具有3-磷酸甘油脱氢酶完整的功能性结构域和磷酸水解酶类结构域。本实验为解释盐生杜氏藻在面临高渗胁迫下快速合成甘油的机制提供了帮助。     

盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其蛋白质结构预测

本文通过对盐生杜氏藻（Dunaliella salina）cDNA文库进行大规模EST测序并结合RACE实验克隆了盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因,并且通过Southern blotting实验确定了该基因在这个物种中拷贝数。通过生物信息学的方法,预测该基因所编码的蛋白质结构,验证了该蛋白质具有3-磷酸甘油脱氢酶完整的功能性结构域和磷酸水解酶类结构域。本实验为解释盐生杜氏藻在面临高渗胁迫下快速合成甘油的机制提供了帮助。     

外源ble基因在杜氏盐藻中的瞬时表达

利用电击法将带有ble基因的pSP124S转入杜氏盐藻细胞内进行瞬时表达,研究了外源基因在盐藻内的存留及表达情况,确定了合适的电击转化条件,发现利用电击法可以使大量的质粒导入盐藻细胞,质粒在细胞中逐渐降解但至少96h内可以检测得到,外源启动子能够使ble基因有效转录,转录至少可以持续72h,ble基因能够在盐藻细胞中正确翻译,可以作为盐藻遗传转化研究的筛选标记。     

外源ble基因在杜氏盐藻中的瞬时表达

利用电击法将带有ble基因的pSP124S转入杜氏盐藻细胞内进行瞬时表达．研究了外源基因在盐藻内的存留及表达情况,确定了合适的电击转化条件,发现利用电击法可以使大量的质粒导入盐藻细胞,质粒在细胞中逐渐降解但至少96h内可以检测得到。外源启动子能够使ble基因有效转录,转录至少可以持续72h,ble基因能够在盐藻细胞中正确翻译,可以作为盐藻遗传转化研究的筛选标记。     

杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段的克隆及序列分析

根据莱因衣藻、卵形肾藻、普通小球藻等10种藻类的atpA全基因氨基酸高度保守序列,设计简并引物,利用PCR方法从盐藻叶绿体DNA中扩增出约400bp的片段,将该片段连接到T-vector上进行序列测定。结果表明,核苷酸长度为405bp,编码135个氨基酸。推导的氨基酸序列与莱因衣藻的同源性为92%,普通小球藻88%,Mesostigmaviride87%,卵形肾藻86%,Cyanidioschyzonmerolae85%。以所克隆的DNA片段为探针,与盐藻叶绿体基因组进行SouthernBlot杂交结果有明显的杂交信号。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段。该基因序列已被GenBank收录,接受号为AY435096。     

杜氏盐藻基因工程研究现状及应用前景

杜氏盐藻(简称盐藻)作为一种新型生物反应器,成为藻类基因工程的研究热点之一.利用基因工程手段对盐藻进行遗传重组改造以生产外源性物质是目前研究的重要领域.从盐藻相关基因的克隆、cDNA文库的建立、基因组文库的构建、筛选标记的确立和外源基因的表达等五个方面概述了国内外盐藻基因工程的研究进展,并对基因工程技术在盐藻深入研究中的应用作了前景展望.