嗜碱芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶基因启动子的克隆及应用

摘要: 利用TAIL-PCR方法从嗜碱芽孢杆菌PB92基因组中扩增出碱性蛋白酶基因上游启动子活性片段, 测序分析后登录GenBank(EU130686)。此序列具有多个启动子特征区域, 且在－538~－370 bp和－275~－128 bp两个区域存在反向读码框。对启动子片段进行功能缺失的分析结果表明, TSS上游105 bp片段具有明显启动子活性, 但以长为414 bp~619 bp时活性更为显著。此外, 对PB92碱性蛋白酶的信号肽分析结果表明, 此信号肽具有典型分泌型(Sec-type)信号肽结构。将PB92碱性蛋白酶基因启动子和信号肽序列克隆入pBE2, 构建成表达载体pBEAC, 并以其为载体实现了植物甜蛋白monellin基因在枯草芽孢杆菌1A751中的高效表达。     

嗜碱性芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达

从Bacillus alcalophillus PB92中扩增出碱性蛋白酶基因Mapr,Mapr分别插入到大肠杆菌载体pET-22b( )和枯草芽孢杆菌载体pWB980中构建成重组分泌型表达载体pET22b( )-Mapr、pWB980-Mapr。碱性蛋白酶基因分别在大肠杆菌宿主BL21和枯草芽孢杆菌DB104中得到表达。SDS-PAGE分析,重组蛋白酶的分子量为28kD。在大肠杆菌,所得酶活为231U/ml,而在枯草芽孢杆菌,其酶活为1563U/ml。大概是由于碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌折叠成熟机制与大肠杆菌的不同造成的。     

嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究II.诱变株选育及产酶条件

嗜碱性的短小芽孢杆菌R115(Alkaliphilic Bacillus pumilus)经0．4mg／ml亚硝基胍和0.4μg／ml利福平处理,获得一株具有高产稳产碱性蛋白酶的变异株(B45),产酶活力由2803μ／ml提高到6000u／ml(28℃测定),该诱变株的最适产酶条件为起始pH10．5-11．0,温度30—35℃,培养时间52—54b。0．4-0．6％K2HPO4．可增加酶的产量。     

嗜碱性短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究III．酶的性质及应用

本文对嗜碱性短小芽孢杆菌(Alkaliphilic Bacillus pumilus)B45菌株产生的碱性蛋白酶性质进行了研究。该酶对酪蛋白水解的最适pH为10．0—10．5,在PH7-l0之间稳定,最适反应温度为45℃,稳定性较好。最适底物浓度为1％。四硬酸钠、氯化钙对酶有激活作用,三聚磷酸钠及碳酸钠在常温下对酶话力无影响,而在40℃时对活力略有抑制,加入0．2g／LCaCl2可以保护酶的活性。B 45蛋白酶对血、奶污布的去污效果明显,其去污力比一般洗衣粉高10-13倍。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子的克隆、鉴定及其应用

利用TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)从短小芽孢杆菌基因组中扩增到碱性蛋白酶基因编码区上游的启动子片段。对该片段的序列测定和分析表明, 此片段长797 bp, 但与基因表达有关的序列长约390 bp。对启动子片段进行不同长度的缺失突变, 以获得最小的基因启动子片段, 结果表明, 该基因起始密码子上游约160 bp的DNA片段就可以启动基因的表达。将含有该片段的碱性蛋白酶基因WApQ3插入大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体pSUGV4中, 构建了碱性蛋白酶基因表达质粒pSUBpWApQ3。将该质粒分别转入枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中表达, 可在胞外检测到碱性蛋白酶活性, 最高酶活分别为466.5 U/mL和3060 U/mL。     

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达

目的:获得碱性蛋白酶基因。方法:用PCR的方法从枯草芽孢杆菌A-109中扩增碱性蛋白酶基因(apr),并进行测序分析,构建表达载体,最后转化大肠杆菌BL21,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该基因的表达情况。结果:apr基因片段含1092个碱基对。该基因片段核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens subtilisin DFE precursor有99%的同源性,对应的氨基酸序列与Bacillussp.DJ-4有99%的同源性。apr基因在大肠杆菌BL21中获得表达,并表现出蛋白酶活性。结论:获得了具有活性的新的碱性蛋白酶基因。     

嗜热脂肪芽孢杆菌启动子克隆载体pFDC4和表达型载体pFDC11的构建

以pPL703的衍生质粒pPGV5为载体,从嗜热脂肪芽孢杆菌CU21总DNA的Sau 3A酶切产物中得到1个0.54kb的启动子片段,它能促进载体上的无启动子的cat-86基因在嗜热脂肪芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌中表达。这一片段以正、反向插入pPGV5载体,都能使重组质粒转化CU21原生质体的效率提高10~(?)至10(?)倍。Southern杂交实验表明,这一启动子片段与Imanaka等报道的来自CU21中的隐蔽性质粒pBS02的能提高转化效率的1.6kb Eco RI片段是同源的。利用所得到的0.54kb Sau 3A片段构建了新的启动子克隆载体pFDC4和表达型载体pFDC11,二者都能以很高的效率转化CU21原生质体。     

产碱性纤维素酶嗜碱芽孢杆菌AH-8的研究

从贵州、云南、海南、安徽、四川、辽宁等地采集碱性土样,分离筛选到1株能稳定的产生碱性纤维素酶的嗜碱性芽孢杆菌AH-8。研究表明,该菌株最适产酶温度为37℃,最适发酵时间为36 h;采用均匀设计法对其发酵培养基进行优化,优化培养基配方(%):淀粉3.0,胰蛋白胨1.5,牛肉膏1.5,葡萄糖0.3,KH2PO40.1,初始pH 10.0。在优化培养基条件下,其产酶量提高了120%。碱性纤维素酶最适反应温度为60℃;最适反应pH 10.0;0.01%Co2 对酶活力有一定激活作用。     

地衣芽孢杆菌碱性果胶酶基因PelA的克隆与原核表达

通过PCR扩增的方法,从本实验室筛选保存的Bacillus licheniformis DG-3 菌株中扩增出碱性果胶酶的结构基因pelA , 序列分析表明,所获PelA 基因与已报道的B.licheniformis 14A菌株的pelA基因的同源性为100%. 将pelA 基因在大肠杆菌中表达,发酵液菌体的碱性果胶酶酶活为12U/mL. 4～8 mmol/L的Ca2 对碱性果胶酶具有显著的激活作用.     

枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。目前,枯草芽孢杆菌中常用的启动子为组成型、诱导物诱导型、时期特异性及自诱导型。详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统以及其常用启动子的优缺点,并对克隆新的启动子的方法做了总结,旨为完善枯草表达系统和工业生产外源蛋白奠定基础。     

解淀粉芽孢杆菌内源启动子的筛选及表达碱性果胶酶的应用研究

【目的】通过检测目的基因的转录水平和表达强度,筛选来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的内源启动子,确定适合碱性果胶酶基因表达的强启动子,并进一步对选用的强启动子进行分析。【方法】通过生物信息学手段对启动子片段进行预测与筛选,采用相对荧光强度、酶活力等表征手段进行分析,同时采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技术检测不同启动子的转录水平。【结果】启动子PrapA、PmetE-1、Phin-1表达碱性果胶酶的活力分别是P43启动子的9.8倍、4.8倍、3.0倍,筛选出的这3个强启动子为其他异源基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达奠定了基础。【结论】通过生物信息学手段预测及筛选启动子,筛选得到比较强的启动子PrapA、PmetE-1和Phin-1,有效提高了碱性果胶酶的表达量。     

嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究——Ⅰ.菌种分离、筛选及发酵条件的研究

从38份土样中筛选到一株嗜碱性短小芽孢杆菌R115,能在pH10以上的环境中生长,并在pH10条件下产生较高的碱性蛋白酶。酶反应的最适pH为10.5,最适温度45℃;在pH12条件下最适温度为28℃。     

产碱性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌的筛选及其研究

利用造纸黑液对土样进行富集,筛选出3株碱性蛋白酶酶活力较高的嗜碱芽孢杆菌X1、X2、X3。对它们的生长曲线,产酶曲线,在不同C、N源、pH值、盐浓度下的产酶活力进行的研究表明:3株嗜碱芽孢杆菌(Bacillussp.JBX1、X2、X5)酶活力较高(达到100U/mL),X2最高酶活可达140U/mL。最适pH值为9.5,碳源中的蔗糖,氮源中的酵母浸提物和硝酸钠均利于产酶。X1、X5两株嗜碱芽孢杆菌均表现出较强的耐盐耐高渗透压的能力。X1在11%的NaCl浓度下生长良好,酶活仍然达到80U/mL以上。而X2和X5对温度的耐受性比较强,在经70℃处理15min后依然保持了80%以上的酶活力,所产蛋白酶为高温碱性蛋白酶,从而为进一步的应用和研究奠定了基础。     

嗜热硫杆菌启动子的克隆及定位

用DNA体外重组技术,将嗜热硫扦菌(Thiobacillus sp．)染色体DNA的Hind III片段插人启动子探测质粒pSDSI(Apr、Tc2)的Hind III位点,在四环素平板上获得一批转化子。四环素抗性能力测定表明,有12个转化子可以在含240／μg／ml四环素的平板上生长,有2个可以在360μg／ml的四环素平板上生长,对这二个抗性表达能力较高、分子量较小的质粒pSDH7和pSDH11作了限制性酶切图谱分析,并利用PstI位点,通过亚克隆将pSDH11插人片段上的启动子定位在0．25kb片段内。分子杂交实验证明克隆的启动子活性片段确实来源于嗜热硫杆菌染色体DNA。     

嗜碱性芽孢杆菌N—227环状糊精葡基转移酶基因在枯草杆菌中的整合表达

大多数枯草杆菌载体在表达外源基因时会出现分离或结构不稳定,而将目的基因整合至染色体上的基因整合方法,近年来得到人们的普遍关注。通过构建一套整合载体,将β－环状糊精葡基转移酶基因随机整合至枯草杆菌１Ａ２８９的染色体上,从表达氯霉素抗性及β－ＣＧＴａｓｅ阳性株中选得菌株Ｂｓ２,其氯霉素抗性为５γ／ｍｌ,β－ＣＧＴａｓｅ酶活为２６６μ／ｍｌ。后又经多次整合及更高浓度氯霉素抗性的选择,获得一株Ｂｓ１６－７     

嗜碱芽孢杆菌产碱性纤维素酶研究概况

碱性纤维素酶是重要的洗涤剂添加剂,不仅可以去除衣物上的污渍,还可以软化衣物和增加衣物的鲜艳度。嗜碱芽孢杆菌是生产碱性纤维素酶的主要菌种。本文概述了其编码的碱性纤维素酶的性质,编码酶的基因、基因的克隆、表达以及作为洗涤剂添加剂的去污机理,指出了今后的研究方向。     

枯草芽孢杆菌中一种新型双向启动子的功能鉴定

本研究旨在通过转录组分析预测的方法,由地衣芽孢杆菌中筛选获得一种新型双向启动子,鉴定其启动强度。以已知强组成型启动子pShuttle-09为对照,检测其对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达活性。成功构建了3种重组碱性蛋白酶表达载体及对应的工程菌株。在新型启动子pLA和其反向启动子pLB调控转录下,克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164 U/mL和111 U/mL。结果表明,pLA的启动强度明显高于pShuttle-09和pLB,pLA启动子与pLB启动子均可表达碱性蛋白酶。从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向,也为原核生物中共同表达两种基因提供了新的思路。