DNA微阵列(或芯片)技术原理及应用

DNA微阵列或芯片(DNA microarray or chip)技术是近年发展起来的又一新的分子生物学研究工具.它是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针,或将液相合成的探针由微阵列器或机器人点样于尼龙膜或硅片上,再与放射性同位素或荧光物标记的DNA或cDNA杂交,用于分析DNA突变及多态性、DNA测序、监测同一组织细胞在不同状态下或同一状态下多种组织细胞基因表达水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域.     

绿色木霉纤维素酶CBHII基因的分子克隆

本文以噬菌体lambda EMBL3 DNA为载体,通过克隆绿色木酶(Trichoderma viride)高分子量基因组DNA的部分酶解片段,并将重组分子进行体外包装后侵染Escherichia.coli K802,由此构建了绿色木霉基因文库。以李氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶CBHII基因的末端片段为探针,用轮迥噬菌斑原位杂交从文库中筛选出CBHII基因的阳性克隆5个,随机取其中3个克隆用上述探针作斑点杂交,结果进一步证明克隆了全长或近全长的绿色木霉CBHII基因,用李氏木霉CBHI基因的末端片段探针作斑点杂交,结果提示CBHI与CBHII基因的末端序列之间无同源性存在。从斑点杂交的阳性克隆中提取DNA,酶切鉴定插入片段的长度,并克隆于质粒pUC19,Southern杂交结果证明获得了含绿色木霉CBHII基因的重组质粒pCBHII-14。     

炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建

为制备炭疽芽胞杆菌的基因芯片探针文库,以炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02为原材料,用Sau3A I酶切pX01和pX02质粒DNA,Taq DNA聚合酶72℃补平加A,经AT克隆,PCR初步鉴定筛选出炭疽质粒片段的阳性克隆．DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定;用生物信息学方法对其片段进行同源性分析;并将克隆的探针打印于玻片上,制备成炭疽芽胞杆茵基因芯片,与炭疽杆茵质粒DNA样品进行初步芯片杂交的实验,杂交实验的阳性率达到了90％以上,证明大部分克隆探针属于炭疽芽胞杆菌．炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建为基因芯片探针的制备摸索出一条简便、高效、可行的方法．     

应用寡聚核苷酸检测c-Ha-ras癌基因点突变

人工合成的寡聚核苷酸探针能够准确地检测出克隆的c-Ha-ras癌基因第12位密码子是否发生点突变。将多聚酶DNA链延伸反应(PCR)与寡聚核苷酸探针结合起来测定组织或细胞株中的单拷贝基因c-Ha-ras第12位密码子的点突变,获得满意的结果。此方法的建立,有助于肿瘤的早期诊断、分型等方面的研究。     

cosmid克隆筛选的体内同源重组法——一个含有小鼠t复合体连锁DNA顺序的cosmid克隆的分离

一个从cosmid分子克隆库中筛选特别基因顺序的遗传学方法——体内同源重组(invlvo homologous recombination)法。即使探针DNA与分子克隆库中带有与探针同源顺序的克隆发生体内重组,然后以遗传学方法进行筛选。cosmid分子克隆库构建在rec宿主细胞内,经体内包装(in vivo Packaging)成λ噬菌体颗粒,把该噬菌体颗粒转入带有探针DNA的rec~+细胞内,探针是已被克隆在与cosmid载体没有同源顺序的质粒(如PUC8或PUC9)内的。经过一段时间(1—3小时),待重组发生后,把cosmid进行体内包装。此时探针DNA连同质粒已整合入cosmid基因组内,因此它带有原为两个载体所分别带有的双重抗性——Amp~r(氨苄青霉素,PUC8或PUC9)和Kan~r(卡那霉素,cosmid)。这种双重抗性菌落可在含有这2种抗菌素的培养平皿上选出,该重组cosmid借助于λ切除酶的作用将已被整合的探针质粒重新切除,再经体内包装后,该cosmid被还原并纯化,然后可用一含有Xgal的培皿识别和选出。本文用此法以有关DNA探针从cosmid分子克隆库中分离得到含有与小鼠t复合体连锁的基因组顺序的克隆,并对该克隆作了物理图谱分析。     

龙葵叶绿体ATP合酶α-亚单位基因的克隆

本研究以菠菜叶绿体DNA 2.45kb的SalI片段(含有ATP合酶α-亚单位基因)为探针,从龙英叶绿体DNA BamHI片段文库中筛选出含龙葵叶绿体atpA基因的克隆。通过Southrcn吸印与探针杂交,证明了重组质粒pSB 132的插入片段含有atpA基因。同时将atpA基因定位在龙葵叶绿体DNA SalI、BglI、XhoI和BamHI 4种酶切图谱的限制性片段上。     

利用锌指基序的保守性从人脑组织分离新的C_2H_2型锌指蛋白基因表达序列

本文利用锌指基序的保守性设计引物,在低严谨条件下扩增人基因组总DNA,获得8个长度呈梯度的PCR扩增产物电泳条带。取其中第2和第3电泳条带,回收DNA片段并将它们克隆,经测序和查新比较,共获得60个含有锌指蛋白基因基序的单一的序列,其中23个为新的锌指蛋白基因DNA片段。以它们为探针,杂交筛选人脑组织cDNA文库,得到初筛cD-NA克隆44个。对其中28个初筛cDNA克隆进行复筛之后,得到20个cDNA单克隆。对这些阳性克隆进行测序,读出18个含有锌指蛋白基因基序的序列,国际联网查新之后,证明其中16个是新的锌指蛋白基因片段。这些新的锌指蛋白基因片段为今后克隆有意义的全长锌指蛋白cDNA提供了重要的实验材料。     

转座子标签法克隆基因的改进——sAc/Ds双系统法

1　转座子及转座子标签法克隆基因基因标签法克隆植物组织中的基因是较为常用的一种方法 ,T-DNA和转座子均可作为基因标签。转座子最早由美国的细胞遗传学家 Mc-clintock在玉米中发现 ,它是指基因组中一段特定 DNA片段 ,能在转位酶的作用下从基因组的一个位点转移到另一个位点。转座子不仅能在本基因组中转座 ,也能转入其它植物的基因组中。转座的结果是使被转入的基因失活 ,从而有效地诱导产生表型突变株。然后构建一个对应于突变株的基因库 ,用作标签的转座子作为探针从基因库中筛选相对应的克隆 ,分离得到相对应于变异的基因 ,这就是…     

RecA蛋白介导的三链核酸结构形成及其序列提取

人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。     

“缺口翻译”法制备~(32)P 标记DNA探针和几种核酸杂交技术

定性或定量检测天然DNA或重组DNA中某些特殊的顺序片段,分子杂交是最常用的方法。近几年,核酸的分子杂交技术日趋完善,以不同材料为支持物的固相杂交技术取得了更为迅速的发展。核酸分子杂交方法的灵敏性主要取决于同位素标记杂交探针的比放射性强度。因此制备高比放射性探针是提高灵敏性的关键。用缺口翻译方法制备较稳定的高比放射性强度的杂交探针,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是一个理想的工具。本文介绍我们建立并改进“缺口翻译”制备P标记的探针方法,以及几种重要的核酸固相杂交技术。     

与甘蓝型油菜重要经济性状有关的DNA克隆在拟南芥遗传图谱中的整合

拟南芥与油菜同属十字花科植物芸寡族,亲缘关系很近,基因组间的同源性很高,在用拟南芥EST克隆和油菜DNA克隆作探针定位了甘蓝型油菜一系列重要性状的基础上,对25个与油菜雄性不育恢复基因,硼高效利用基因,抗菌核病QTL及油菜种间杂种营养优势相关联的克隆进行了测序,在拟南芥基因组数据库中寻找到与这25个克隆高度同源的序列,根据这些高度同源序列在拟南芥染色体上的相位位置,将油菜DNA克隆整合到了拟南芥遗传图谱上,其中油菜硼高效基因BE1两侧的标记克隆整合在拟南芥第一染色体长臂一个较小的区段内,以该目标区段内的拟南芥EST克隆PA24为探针对甘蓝型油菜基因组比较作图,将该克隆定位在油菜连锁图BE1两侧标记之间,表明了利用基因组间的相互比较作图来精细定位芸薹属作物重要基因的可能性。     

双加氧酶α亚基保守序列克隆及探针制备

制备地高辛标记的环羟基化双加氧酶的α亚基保守序列探针。利用PCR法成功地克隆了环羟基化双加氧酶的α亚基保守序列310 bp片段,并对其进行测序。利用PCR法制备地高辛标记探针,对新标记的探针进行检测,结果显示其标记效率在0.1 pg/μL;敏感性检测表明,对同源DNA的检出限量为100 pg;对提取的副溶血性孤菌质粒DNA、短小芽胞杆菌总DNA杂交均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

簇毛麦端体6VS的显微切割及其专化DNA序列的克隆和分析

从簇毛麦（Haynaldia villosa (L.)Schur.)组合CA9211／RW15（6D／6V异代换系）幼胚培养SC2后代中,用原位杂交方法鉴定出T240－6为6VS端体异代换系。以此为材料,采用微细玻璃针切割法及“单管反应”技术体系,对6VS进行切割分离及LA（Linker adaptor)-PCR扩增。扩增带在100－3000bp之间,大部分集中在600－1500bp。利用^32P标记的簇毛麦基因组为探针进行Southern杂交,证实扩增产物来源于簇毛麦。扩增产物纯化后,连续到pGEM-T载体上,构建了6VS DNA质粒库。对库的分析表明,库大约有17000个白色克隆;插入片段分布在100－1500bp,平均600bp。点杂交结果表明,37％克隆有中度到强烈的杂交信号,证明含有中度或高度重复序列;63％克隆有较弱的信号或没有信号,证明为单／低拷贝序列克隆。从库中获得8个簇毛麦特异克隆,对其中两个克隆pHVMK22和pHVMK134进行了RFLP分析和序列分析,并利用该探针对小麦抗白粉病基因Pm21进行了检测。RFLP结果表明,两个克隆一个为低拷贝序列克隆（pHVMK22),另一个为高度重复序列克隆,均为簇毛麦专化DNA序列。以pHVMK22为探针对抗、感病小麦（Triticum aestivum L.)品系的Southern杂交发现抗病品系有一条2kb的特征带,该探针可能作为检测抗病基因Pm21的探针。     

人胃癌细胞株BGC-823 DNA二轮转化细胞基因组文库的构建及其转化基因的克隆

以人胃癌细胞株BGC-823 DNA二轮转化的鼠成纤维细胞为材料,用λ噬菌体EMBL_3,作克隆载体,构建了转化细胞的基因组文库。用~(32)P标记的人Alu重复顺序和原癌基因c-Ha-ras为探针,对100万基因文库噬斑进行原位杂交筛选,找出了两个可以同时与上述探针杂交的阳性克隆。经对两个阳性克隆DNA进行分子杂交表明,它们均含有来自人胃癌细胞株BGC-823的转化基因Ha-ras,进一步运用质粒载体pBR322对这一转化基因进行次级克隆,并进行了限制性内切酶图谱的初探,从而为研究胃癌转化基因的结构、DNA序列及与原癌基因的异同奠定了基础。     

荧光探针研究新进展

自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(heterogeneousassay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneousassay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。     

温敏核不育水稻5460S细菌人工染色体文库的构建和鉴定

为了构建温敏核不育 (TGMS)基因区域的精细物理图谱并最终分离TGMS基因 ,以温敏核不育水稻 5 46 0S为材料 ,摸索优化了构建植物细菌人工染色体 (BAC)文库的方法 ,构建了一个高质量的BAC文库 .该文库由 1 95 84个克隆构成 ,插入片段平均长度为 1 1 0kb ,相当于水稻单倍体基因组大小的 5倍 ;以分子量分别为 1 40和2 5 0kb的 2个大BAC克隆进行稳定性传代实验 ,经 1 0 0代传代后其插入的DNA片段仍然稳定存在 ;以线粒体和叶绿体基因为探针筛选BAC文库 ,未检验出叶绿体和线粒体DNA的污染 ;以和tms1基因连锁的 3个分子标记作为探针对BAC文库进行了筛选 ,每个探针至少可获得一个阳性克隆 ,利用热不对称性交错PCR(Tail PCR)法成功分离了阳性克隆的左右末端序列 .     

簇毛麦端体6VS的显微切割及其专化DNA序列的克隆和分析

从簇毛麦(Haynaldia villosa (L.) Schur.)组合CA9211/RW15(6D/6V异代换系)幼胚培养SC2后代中,用原位杂交方法鉴定出T240-6为6VS端体异代换系. 以此为材料,采用微细玻璃针切割法及"单管反应"技术体系,对6VS进行切割分离及LA (Linker adaptor)-PCR扩增.扩增带在100～3 000 bp 之间,大部分集中在600～1 500 bp.利用32P标记的簇毛麦基因组为探针进行Southern杂交,证实扩增产物来源于簇毛麦.扩增产物纯化后,连接到pGEM-T载体上,构建了6VS DNA质粒文库.对文库的分析表明,文库大约有17 000个白色克隆;插入片段分布在100～1 500 bp,平均600 bp.点杂交结果表明,37%克隆有中度到强烈的杂交信号,证明含有中度或高度重复序列;63%克隆有较弱的信号或没有信号,证明为单/低拷贝序列克隆.从文库中获得8个簇毛麦特异克隆,对其中两个克隆pHVMK22和 pHVMK134进行了RFLP分析和序列分析,并利用该探针对小麦抗白粉病基因Pm21进行了检测.RFLP 结果表明,两个克隆一个为低拷贝序列克隆(pHVMK22),另一个为高度重复序列克隆,均为簇毛麦专化DNA序列.以pHVMK22为探针对抗、感病小麦(Triticum aestivum L.)品系的Southern杂交发现抗病品系有一条2 kb的特征带, 该探针可能作为检测抗病基因Pm21的探针.     

赤麂SRY基因的测序及其与部分偶蹄目动物SRY基因序列的比较

采用人SRY基因的一段保守序列的引物,通过PCR在雄性赤麂中扩增出了赤麂SRY基因的特异片段,通过DNA斑点杂交证实其扩增产物与人SRY基因探针进行菌落杂交筛选出赤麂SRY基因的阳性克隆,并对其进行了,将其序列与基因库中录入的所有偶蹄目动物的SRY基因序列进行同源性比较,用UPGMA法构建了其系统进化树,从分类和进化上对赤麂SRY基因进行分析。     

活化型及失活型SUMO1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化型及失活型SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)真核表达载体并鉴定其蛋白活性。方法:以野生型HA-SUMO1-pc DNA3.1为模板,采用PCR扩增目的基因,将其连接入克隆载体T vector,筛选阳性重组子;将目的基因酶切回收后亚克隆入真核表达载体pc DNA3.1。将阳性克隆转染HEK293细胞,免疫印迹鉴定底物蛋白与SUMO1的结合情况(即SUMO化水平)。结果:活化型及失活型SUMO1目的基因被扩增,并且亚克隆入pc DNA3.1,且测序结果与预期一致。免疫印迹分析显示,转染活化型SUMO1组检测到显著的蛋白SUMO化条带,而失活型组则无明显条带。结论:活化型及失活型SUMO1真核表达载体成功构建,并可于HEK293细胞高效表达。