人GST-14-3-3σ融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人14-3-3σ基因的原核表达载体,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化及活性检测。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增14-3-3σ基因编码序列,将其克隆到pGEX-KG载体中,重组质粒转化大肠杆菌Rossate后表达重组蛋白,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的表达,采用GST pull-down技术检测已纯化的蛋白与已知体外相互作用蛋白AKT之间的相互作用。结果:从人乳腺文库中扩增获得约750 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序与目的基因序列完全一致;在Rossate菌株中诱导表达出相对分子质量约52 000的目的蛋白,SDS-PAGE和Western印迹结果表明融合蛋白表达成功,并纯化得到GST-14-3-3σ融合蛋白;通过GST pull-down技术检测证实GST-14-3-3σ融合蛋白可以和AKT在体外结合,并证实其具有生物学活性。结论:获得了原核表达的活性较好的GST-14-3-3σ蛋白,为后续研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。     

大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2的表达、纯化及抗体制备

目的:原核表达、纯化大鼠丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B2(SERPINB2),并制备其多克隆抗体.方法:设计扩增大鼠Serpinb2全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克...     

小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体的构建及表达

目的:构建小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKXI原核表达载体并进行表达,以期得到大量的His标签融合蛋白.方法:根据GenBank中的TaCKXI序列以及pET-24a载体中的多克隆位点设计引物,以含有TaCKXl编码基因的批pMD-QRCKXI重组质粒为模板,经PCR扩增得到TaCKXI基因的DNA片段.将所得的片段与pET-24a载体连接,转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆,其测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pET-TaCKXI已构建成功.提取per-TaCKXI质粒转化到BL21(DE3)pLysS表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件.结果:在大肠杆菌中获得TaCKXI基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为58.91kD;IPTG终浓度为0.5、1.0、1.5.2.0mmol/L时,诱导融合蛋白产量相差不大.选用0.5mmol/L诱导15h获得大量的融合蛋白.经用原核表达蛋白纯化试剂盒纯化,得到了单一的融合蛋白.结论:小麦TaCKXI基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后TaCKXI蛋白多克隆抗体的制备奠定了基础.     

DNA损伤检查点蛋白调节子1片段的表达纯化及抗体制备

目的：原核表达、纯化DNA损伤检查点蛋白调节子1（MDC1）片段,并制备其多克隆抗体。方法：设计特异引物,通过RT-PCR扩增编码MDC1 N端194个氨基酸残基的基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果：原核表达并纯化了MDC1 N端片段,并获得了抗MDC1的多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹显示该抗血清能特异识别原核及真核细胞表达的MDC1。结论：MDC1 N端片段能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MDC1在Fhit特异信号通路中的作用奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化简

目的：构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到厅sE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果：构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0．1mmol/LIPTG诱导3h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论：实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

GST-Ets-1融合蛋白的表达与纯化

[目的]旨在原核表达Ets-1基因,纯化获得GST-Ets-1融合蛋白。[方法]以SD大鼠脑垂体cDNA为模板,利用PCR扩增含有Bam HI和Not I酶切位点的Ets-1基因;然后将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,再利用Magne GST particles亲和纯化GST-Ets-1融合蛋白;最后通过Western blot鉴定此融合蛋白。[结果]成功构建pGEX-4T-1-Ets-1原核表达载体;30℃条件下,0.2 mmol/L的IPTG能诱导出大量的可溶性GST-Ets-1蛋白;经Magne GST particles纯化的GST-Ets-1蛋白可被识别ETS-1的抗体特异识别。[结论]纯化的GST-Ets-1蛋白可用于后续的生物学研究。     

片球菌素pediocin PA-1基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建编码细菌素pediocin PA-1基因片段的原核表达载体,诱导表达,鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pET32-papA,IPTG诱导表达,用金属亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE与Westernblot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果双酶切和测序鉴定显示papA片段插入正确,诱导表达后获得分子量为19 kD的融合蛋白,表达量为25%,用金属亲和层析的方法获得纯化的片球菌素pediocin PA-1。结论papA基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,为下一步研究该功能域的生物活性奠定了基础。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的表达、纯化与初步鉴定

目的构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并对融合蛋白进行纯化。方法利用逆转录-PCR获得乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(Polymerase)反式调节人类新基因HBVD-NAPTP1,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌进行诱导,并利用组氨酸亲和层析方法对融合蛋白进行纯化。结果 HBVDNAPTP1原核表达载体转化宿主菌后,经0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h获得了分子量约为31 kD的HBVDNAPTP1融合蛋白的优化表达,Western blotting证实融合蛋白的特异性。亲和层析纯化后得到较纯的HBVDNAPTP1融合蛋白,每升培养菌液中可获得2.24 mg的纯化蛋白。结论成功获得纯化的HBVDNAPTP1融合蛋白,为今后开展HBVDNAPTP1的生物学功能研究奠定了物质基础。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

梅花鹿重组Galectin-1的表达及多克隆抗体的制备与鉴定

半乳糖凝集素-1（Galectin-1）是最先被报道的哺乳动物半乳糖凝集素,存在于多种组织和细胞内,参与细胞的粘附、增殖、凋亡和炎症反应等多种生理病理过程,并且与免疫系统的调节和肿瘤的发生发展密切相关。鹿茸是哺乳动物中罕见的能够周期性的脱落和再生的附属器官,作为研究哺乳动物器官再生的新模型受到关注。鹿茸再生是一个基于干细胞的过程,定位于角柄骨膜的干细胞是鹿茸再生的基础,Galectin-1在角柄骨膜细胞（pedicle periosteum cell, PPC）中高度表达,提示其在鹿茸再生中发挥着重要的作用。由于尚没有商用的鹿Galectin-1蛋白及其抗体,为进一步研究Galectin-1在鹿茸再生中的生物学功能,需要制备相应的蛋白和抗体,本实验将梅花鹿Galectin-1基因与pET28a连接,并将重组质粒pET28a-Galectin-1转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中诱导表达。用Ni-NTA Agarose亲和层析纯化融合蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体。酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法检测抗体效价、Western blot 检测抗体特异性、细胞免疫荧光检测Galectin-1在角柄骨膜细胞中的表达情况。结果表明,本实验成功诱导重组原核表达载体pET28a-Galectin-1在BL21(DE3)中表达,通过Ni纯化获得融合蛋白。ELISA结果显示,抗体效价达到1:64000,Western blot结果表明该抗体特异性良好,细胞免疫荧光显示Galectin-1在PPC全细胞中表达。本实验获得了纯化的鹿Galectin-1蛋白和特异性较好的多克隆抗体,为揭示Galectin-1在鹿茸再生调控中的作用提供了重要的实验材料。     

副溶血弧菌外膜铁蛋白受体pvuA基因的原核表达及产物的诱导条件优化

为构建弧菌铁蛋白受体pvuA重组质粒,提高其在大肠杆菌BL21中的表达产量,优化表达条件,并为其免疫原性研究奠定基础,从副溶血弧菌基因组DNA扩增了弧菌铁蛋白受体pvuA基因,构建了重组质粒pET-28a(+)-ferric vibrioferrin receptor,转入大肠杆菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达蛋白。在单因素试验的基础上,以菌体初始浓度、诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度为自变量,菌体蛋白浓度为响应值,根据响应面法的Box-Benhnken中心设计原理,研究自变量及其交互作用对弧菌铁蛋白产量的影响,利用Design-Expert和响应面分析相结合的方法对诱导条件进行优化。IPTG诱导获得的重组蛋白以包涵体的形式存在,优化后最终确定重组弧菌铁蛋白受体pvuA最佳表达条件为菌体初始浓度OD600=0.6,诱导时间10 h,诱导温度37℃,IPTG浓度为1.0 mmol·L-1,此时包涵体沉淀中蛋白含量最高,为11.00 mg·mL-1。构建了弧菌铁蛋白受体pvuA的大肠杆菌重组表达质粒,通过优化表达...     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

土拉弗朗西斯菌两种不同长度的外膜蛋白FopA抗原和抗体的制备

目的:根据外膜蛋白 FopA 的序列信息,建立土拉弗朗西斯菌 FopA蛋白全长(FopA-L)和部分(FopA-S)的特异性抗原的 BL21 表达系统,获得高活性的重组 FopA-L、FopA-S蛋白并制备相应的多克隆抗体,为土拉菌的监测、诊断和治疗提供依据。方法:通过 pET100 质粒构建FopA-L及FopA-S的表达载体,转化大肠杆菌BL21细胞并诱导表达FopA-L及FopA-S蛋白,螯合镍离子次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲合层析纯化FopA蛋白,用重组蛋白免疫大耳白兔制备多克隆抗体,通过 ELISA、Western 印迹、胶体金免疫层析技术等方法进行检测。结果:构建了FopA-L及FopA-S的表达载体,获得相应的高表达目的蛋白 BL21 细胞株,用表达的蛋白为抗原成功制备了 FopA特异性的抗体,效价皆在1 ∶100000以上且特异性良好。结论:FopA-S与FopA-L两种抗原和相应抗体的制备为建立土拉菌快速检测方法奠定了基础。     

小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。     

棉铃虫核型多角体病毒orf86基因的原核表达、抗体制备与免疫印迹检测

棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)orf86是一个功能未知的基因。从HearNPV基因组中通过PCR得到orf86基因编码序列,将其构建于原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21获得融合表达产物。融合表达蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体。用ELISA测定结果表明,ORF86多克隆抗体效价为1:5.12×105。利用该抗体Western印迹检测HearNPV感染的HZAM1细胞,检测到一个36kD的目的蛋白条带,与ORF86预期大小一致。结果表明该多抗可用于对orf86编码蛋白的检测和相关功能研究。     

斑马鱼Lefty1特异性多克隆抗体的制备

Lefty蛋白是TGFβ大家族的配体,通过与Nodal以及Nodal的受体结合而抑制Nodal信号转导。本文采用PCR技术扩增出斑马鱼lefty1基因（z—lefty1）的部分编码区,将其插入到pGEX-4T-1原核表达载体中。所构建的重组质粒（pGEX／z-Lefiy1）转化入BI21大肠杆菌,通过IPTG诱导表达GST—z—Lefty1融合蛋白。蛋白经尿素洗涤分离后用于免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blotting检测结果表明获得了高效价的特异性兔抗z—Lefiy1多克隆抗体。这为进一步研究斑马鱼心脏发育的分子机制创造了条件。     

Angioarrestin(hARPl)C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定

 Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestin C端 hFD cDNA 和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒 pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,经0.3 mmol/LIPTG 在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE 检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET 22b（+）表达系统获得的 hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明：通过基因重组可获得angioarrestin C端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.     

重组SCIRR39多克隆抗体的制备及检测

目的：在大肠杆菌中表达大鼠脊髓损伤与修复蛋白39（SCIRR39）的C端抗原表位,并制备其多克隆抗体。方法：从大鼠脊髓全横断损伤脊髓cDNA中扩增1386bp的Scirr39基因编码框,亚克隆该基因编码蛋白C端359～461位氨基酸残基的DNA片段,插入表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,切胶纯化目的蛋白;利用多克隆抗体制备技术,制备重组SCIRR39蛋白的多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性。结果：SCIRR39蛋白C端抗原表位与GST的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高表达,相对分子质量为37．9×103;获得抗SCIRR39蛋白C端抗原表位的兔抗血清,其效价达到1：104;Western印迹显示多克隆抗体能特异识别重组SCIRR39蛋白的C端抗原表位。结论：在原核系统中表达纯化了重组SCIRR39抗原表位蛋白,制备的重组蛋白多克隆抗体将用于检测SCIRR39在脊髓损伤过程中的表达变化。     

人DFF45蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

目的：表达、纯化带GST标签的DNA裂解因子45（DNA fragmentation factor 45 ,DFF45）融合蛋白并制备多克隆抗体。方法：构建pGEX-5X-1/DFF45原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达,经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用CNBr-activated Sepharose? 4B进行纯化。用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,同时用免疫荧光染色鉴定抗体特异性并观察DFF45的细胞定位。进一步检测DFF45在人类几种细胞系的表达差异情况。结果：成功构建原核表达质粒,表达、纯化DFF45蛋白并免疫动物后得到多克隆抗体。间接ELISA法显示抗体效价达1:20 000,Western blot确定抗体具有高度特异性。应用该抗体检测发现DFF45在人类几种细胞系中表达存在差异并观察到其细胞定位。结论：DFF45多克隆抗体的成功制备及其在人类细胞系的差异表达,为进一步研究DFF45基因与肿瘤及其相关疾病的关系奠定了基础。