光照对大豆叶片苯丙氨酸裂解酶(PAL)基因表达及异黄酮合成的调节

异黄酮是大豆体内特别是种子中积累的一类重要的次生代谢产物,它具有特殊的生物效能。本实验在不同水平（ＲＮＡ／酶／产物）上研究不同光照条件对大豆叶片异黄酮合成过程中的第一个关键酶苯丙氨酸氨基裂解酶（ＰＡＬ）基因表达的影响。研究发现,在光照条件下ｐａｌ表达量比黑暗条件下高,而且其影响程度与品种有关系,种子中异黄酮含量低的品种表现更敏感;其ｍＲＮＡ的合成受红光、蓝光、紫外光的促进,其中紫外光最有效;随着处     

干旱胁迫对苗期大豆异黄酮合成的影响

以不同耐旱性的2个大豆品种(高耐旱JP-6、低耐旱JP-16)为研究材料,采用高效液相色谱和实时荧光定量PCR技术,分析不同时间持续干旱胁迫下,大豆叶片和根系中异黄酮的积累变化及关键酶基因的表达情况.结果表明:大豆根部异黄酮含量显著高于叶部,而异黄酮关键酶基因的表达量则在叶片中更高,耐旱品种JP-6根部的异黄酮积累量更大.随着干旱胁迫持续时间的增加,不同耐旱品种的异黄酮合成与积累变化规律存在显著差异:强耐旱品种JP-6的根和叶中,异黄酮积累量均呈现先下降后升高的趋势;而弱耐旱品种JP-16则相反,异黄酮积累量在不同部位中均呈现先上升后降低的趋势;除JP-6叶中C4H、4CL、IFS2等异黄酮合成上游基因外,其他不同品种、不同部位的关键酶基因表达量均随着干旱胁迫持续时间的增加,呈现先下降后上升的趋势.大豆叶片是异黄酮的主要合成部位,大豆根部也存在少量的异黄酮合成.弱耐旱大豆根部的异黄酮合成和最终积累量均较低,强耐旱品种则较高.根部异黄酮积累量高的大豆品种,其耐旱性更强.     

大豆籽粒发育过程中异黄酮合成相关酶基因的表达模式与异黄酮积累的相关分析

利用高效液相色谱法和实时定量PCR方法,分别测定了2个异黄酮含量显著差异的大豆品种鲁黑豆2号(LHD2)和南汇早黑豆(NHZ)在子粒发育过程中的异黄酮含量变化以及异黄酮合成相关酶基因的表达模式变化,试图分析异黄酮积累与各基因表达量变化的相关关系。结果表明在大豆子粒发育过程中,异黄酮含量逐渐升高,而不同异黄酮合成相关酶基因的表达趋势不同,CHS7、CHS8、CHR、CHI1A和IFS2的表达趋势与异黄酮积累模式基本一致,而IFS1和CHI1B1的表达趋势与异黄酮积累模式相反。IFR的表达模式在2个大豆品种中存在相反的趋势,在LHD2中与异黄酮组分积累趋势相反,而在NHZ中与异黄酮组分积累趋势相同。结果还表明,同一基因家族中不同基因在子粒发育过程中的表达量也存在差异。查尔酮合酶基因家族中CHS7和CHS8以及查尔酮异构酶基因家族的CHI1A的表达水平相对其他成员较高,异黄酮合酶基因家族中IFS2的表达量显著高于IFS1的表达量,预示这些基因家族在大豆子粒异黄酮积累过程中存在功能分化。此外,各基因表达模式与异黄酮积累的相关分析结果表明,不同基因表达模式与异黄酮积累的相关性在2个品种中也不尽相同。LHD2中CHS7、CHS8和IFS2在子粒发育过程中的表达量变化与不同异黄酮组分呈显著正相关,CHI1B1基因的表达量变化与不同异黄酮组分呈显著负相关。而在NHZ中,IFR在子粒发育过程中的表达量变化与多个异黄酮组分呈显著正相关。这预示了不同大豆品种异黄酮含量差异的潜在遗传基础。各异黄酮合成相关酶基因表达量变化的相关分析表明,在2个品种中,苯丙氨酸水解酶PAL1与4CL,4CL与CHS2以及CHS1与IFS2基因的表达量均呈现显著正相关。表明这些基因可能通过协同作用共同调控异黄酮的合成与积累。这些结果为今后利用基因工程提高大豆异黄酮含量奠定了基础。     

盐生野大豆的异黄酮积累及其生态学意义

以自然生长在盐碱地上的野大豆(Glycine soja)和不耐盐的栽培大豆(G. max)为材料,测定了它们在不同盐度条件下叶片、根部和种子的异黄酮含量,并测定了它们叶片的L-苯丙氨酸含量和苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性,还测定了它们根部的结瘤量和固氮酶活性。通过两者比较,分析了它们的大豆异黄酮代谢和盐渍环境的关系。结果表明:盐渍处理不抑制盐生野大豆PAL酶的活性,其大豆异黄酮大量积累;相反,盐渍处理明显抑制栽培大豆PAL酶活性,其大豆异黄酮含量减少,而大豆异黄酮合成前体L-苯丙氨酸积累。结果还显示:在盐渍条件下,盐生野大豆根部异黄酮积累的同时,其根瘤结瘤量较多,且固氮酶活性也较高;而栽培大豆随着其根部异黄酮的减少,其根瘤结瘤量大大减少,且固氮活性大大下降。野大豆和栽培大豆的这些差别说明:盐生野大豆积累大豆异黄酮有其生态学意义,这很可能是野大豆通过异黄酮次生代谢途径适应盐渍环境的一种重要机制。     

光照对大豆幼苗组织中异黄酮含量和分布的影响

利用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）测定了不同光照处理的大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉ．）幼苗不同组织的异黄酮类含量。子叶中最高,叶片和根部相对较少。子叶的异黄酮以大豆甙和染料木甙及其丙二酰基结合体为主,且在光照条件下,异黄酮含量随光照时间的增加而显著升高;相反,黑暗中的异黄酮含量随苗龄的增加呈下降趋势;当子叶由黑暗转为光照处理以后,异黄酮含量同样随光照时间的增加而升高。在叶片和根部异黄酮含量和种类也因光照条件的不同而有很大差异。光照条件下,叶片中以染料木甙及其丙二酰结合体和黄酮芦丁为主,且随时间增加呈上升趋势;黑暗中的黄化叶片,则以大豆甙和丙二酰结合体为主,但随时间的变化不明显。在幼苗根部,黑暗条件下几乎检测不出异黄酮的存在;光照条件下,则可检测到５种异黄酮,其中以大豆甙元及其衍生物占主要部分。实验证实了光照对大豆异黄酮的积累有明显的促进作用     

荫蔽信号对大豆幼苗异黄酮合成的影响

荫蔽导致植物所受红光/远红光(R/FR)比值下降,为探究荫蔽对大豆幼苗异黄酮合成的影响,本试验以耐荫性差异显著的大豆品种"ND12"和"C103"幼苗为研究材料,分别施以不同比例红光/远红光(R/FR)处理,对其叶片、下胚轴、根系中异黄酮积累量及关键酶基因表达情况进行比较研究。结果表明,低R/FR条件下,强耐荫品种"ND12"叶片中总异黄酮及染料木素GE的含量极显著上升,下胚轴中极显著下降,弱耐荫品种"C103"则相反。同时,低R/FR使强耐荫品种"ND12"叶片中异黄酮合成关键基因IFS2、4CL、C4H和CHI的表达量极显著上调,其变化趋势与异黄酮积累变化规律一致,而弱耐荫性品种"C103"则存在较大差异。荫蔽信号诱导耐荫型大豆品种异黄酮合成,并在受胁迫部位叶片中大量积累。本研究初步揭示了荫蔽信号(低R/FR)对苗期大豆异黄酮的调控规律,为研究大豆异黄酮响应荫蔽信号的调控机理奠定了基础。     

大豆异黄酮合成途径相关基因差异表达分析

大豆异黄酮是一种应用广泛、具有医用和保健功能的活性物质。为揭示异黄酮合成途径相关基因表达差异,本研究采用实时定量PCR技术分析相关基因在不同大豆品种、发育时期及组织部位的表达。结果发现,苯丙氨酸解氨酶基因PAL、肉桂酸羟化酶基因C4H、香豆酸辅酶A连接酶基因4CL在高异黄酮品种中豆27 R2期叶片中的表达量显著高于低异黄酮品种楚秀;查尔酮合成酶基因CHS、异黄酮合成酶基因IFS在中豆27 R8期子粒中的表达量显著高于楚秀;细胞色素还原酶基因CPR在中豆27 R7期叶片与子粒的表达量与楚秀相比显著降低。这些差异表达的基因可能是形成大豆品种异黄酮含量高低的重要原因。     

大豆种子发育过程中异黄酮的积累

3个大豆品种种子中的异黄酮含量随着种子的发育进程而逐渐提高,尤其在种子成熟的最后1周内,异黄酮含量迅速增加,且与发育天数是显著正相关,与水分含量呈极显著负相关。在种子积累的不同异黄酮组分中,以雨二酰基结合体的含量最多,达总量的65％左右,而游离态积累的较少。     

温度对大豆(Glycine max)种子发育过程中蛋白质、脂肪和淀粉积累过程的影响

目前人们仍不清楚温度是如何影响发育中的大豆（Glycine max L．）种子蛋白质和脂肪积累过程以及基因型不同的大豆是否对温度具有相同的反应。研究拟通过对3个基因型大豆在不同温度处理下,种子发育过程中的蛋白质和脂肪的积累模式研究,以了解温度对种子组分的调节机理。3个基因型大豆品种（Evans,PI132．217,和Proto）种子盆栽在温度为27／20％（中温）的生长箱中生长到开花。在开花后第10天,将其中的一个生长箱的温度调节到35／27℃（高温）;另一个调到20／12℃（低温）。生长在高温和中温条件下的大豆,在开花的第21天开始收集豆荚,每3d取1次样。生长在低温条件下的大豆,在开花的第25天开始收集豆荚,每5d取1次样。结果表明,3个基因型大豆种子均在高温下生长快,成熟早,在中温下生长速率最大,低温下生长速率低但种子生长期延长。当种子获得60％-70％总干重时种子脂肪含量达到最大（中温）,高温使其提前出现,低温则被推后。在低温下,种子中蛋白质和脂肪两者积累模式相同,但蛋白质积累速率低。在高温和中温条件下,种子蛋白质和脂肪的积累模式不同。在种子获得60％～70％的总干重之前,蛋白质和脂肪积累模式相同,但在种子获得60％～70％的总干重之后,蛋白质积累呈上升趋势,而脂肪积累停止或下降。同时在种子发育的晚期伴随着蛋白质含量增加,淀粉和蔗糖含量快速下降。虽然3个基因型大豆种子的蛋白质和脂肪积累模式均明显受温度影响,但在不同温度条件下和不同生长阶段中高蛋白质品种Proto和PI132．217（蛋白质稳定型）蛋白质含量总是高于低蛋白质品种Evans,而且两者差异显著。这一研究表明温度不能改变品种在蛋白质和脂肪合成上的遗传特性。遗传育种在提高大豆种子蛋白质含量上仍起决定作用,但是合理的播种时期在提高大豆种子蛋白质和脂肪含量上也是不可忽视的问题。     

响应面法优化酶法水解大豆异黄酮糖苷

采用 Design-Expert 软件中 Central Composite Design（CCD）响应面分析方法对β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的4个主要因素（水解温度、水解时间、pH 以及加酶量）进行优化。方差分析发现,影响大豆异黄酮糖苷水解最主要的因素有温度、水解时间和 pH。对各因素进行回归拟合,得到最佳实验条件分别为：温度46．2℃,反应时间94 min,pH 5．1,酶量61单位,此时大豆异黄酮苷元含量达到0．096 g·L－1,比优化前提高了22％。     

抗氧化剂对农杆菌介导的大豆下胚轴GUS基因瞬时表达的影响

大豆(Glycine max)下胚轴作为大豆遗传转化的外植体材料,能快速高频再生不定芽。然而,在遗传转化过程中褐化影响基因转化效率。在该研究中,我们用含有GUS染色基因和hpt II(Hygromycin phosphotransferase II)筛选基因的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404侵染大豆下胚轴,并用组织化学定位法测定了GUS基因的瞬时表达,以确定大豆的优化基因转化条件。结果显示,在共培养基中加入硫代硫酸钠、L_半胱氨酸以及二硫苏糖醇等抗氧化剂,可以有效地抑制大豆下胚轴在组培过程中褐化的发生,并大幅度提高农杆菌在下胚轴的瞬时表达率。这些结果说明抗氧化剂可以降低这种影响并有效提高基因转化效率。     

外源Ca2+对水杨酸诱导番茄抗灰霉病的增效机制

探讨了外源Ca²⁺对水杨酸(SA)诱导番茄抗灰霉病的增效机制.以番茄灰霉病敏感型品种‘L402’幼苗为材料,分别进行H₂O(对照)、SA、SA+Ca和SA+EGTA(Ca²⁺螯合剂)处理,期间(1～5 d)分析各处理植株叶片活性氧(ROS)含量,苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及病程相关蛋白编码基因PR1、PR2和PR3表达水平的变化,并调查处理3 d后灰霉病情指数.结果表明： 与对照(病情指数为74.8)相比,SA、SA+Ca和SA+EGTA处理的植株叶片灰霉病的病情指数分别为46.9、38.5和70.3;SA处理明显提高叶片ROS含量以及苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,这些参数在SA+Ca处理的植株中被进一步提高,但在SA+EGTA处理的植株中则被降低;SA处理明显提高了PR1、PR2a和PR3b的表达水平,Ca²⁺进一步加强了这一效果,而EGTA则起抑制作用.SA或SA+Ca处理期间的PR2b和PR3a表达较未处理的对照上调了1～2倍,而PR1、PR2a和PR3b上调了2～5倍.表明Ca²⁺对SA诱导番茄抗灰霉病具有增效作用,其机理至少与Ca²⁺和SA协同作用促进ROS形成有关,而ROS作为信号分子增加植株抗病相关酶活性以及PR1、PR2a和PR3b等防卫基因的表达.     

外源Ca2+对水杨酸诱导番茄抗灰霉病的增效机制

探讨了外源Ca²⁺对水杨酸(SA)诱导番茄抗灰霉病的增效机制.以番茄灰霉病敏感型品种‘L402’幼苗为材料,分别进行H₂O(对照)、SA、SA+Ca和SA+EGTA(Ca²⁺螯合剂)处理,期间(1～5 d)分析各处理植株叶片活性氧(ROS)含量,苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及病程相关蛋白编码基因PR1、PR2和PR3表达水平的变化,并调查处理3 d后灰霉病情指数.结果表明： 与对照(病情指数为74.8)相比,SA、SA+Ca和SA+EGTA处理的植株叶片灰霉病的病情指数分别为46.9、38.5和70.3;SA处理明显提高叶片ROS含量以及苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,这些参数在SA+Ca处理的植株中被进一步提高,但在SA+EGTA处理的植株中则被降低;SA处理明显提高了PR1、PR2a和PR3b的表达水平,Ca²⁺进一步加强了这一效果,而EGTA则起抑制作用.SA或SA+Ca处理期间的PR2b和PR3a表达较未处理的对照上调了1～2倍,而PR1、PR2a和PR3b上调了2～5倍.表明Ca²⁺对SA诱导番茄抗灰霉病具有增效作用,其机理至少与Ca²⁺和SA协同作用促进ROS形成有关,而ROS作为信号分子增加植株抗病相关酶活性以及PR1、PR2a和PR3b等防卫基因的表达.     

鲁黄1号大豆与根瘤菌的共生匹配性

大豆可与中华根瘤菌属及慢生根瘤菌属的多种根瘤菌共生固氮.研究大豆品种与不同种根瘤菌之间的共生匹配性,对获得高效根瘤菌用于接种,提高大豆的产量及品质有重要的理论和实践意义.本研究使用黄淮海地区的优质高蛋白大豆品种鲁黄1号从当地土壤内捕捉并分离纯化到27株根瘤菌.经持家基因recA的序列分析,发现其中18株属于中华根瘤菌属,9株属于慢生根瘤菌属.选用两个属的代表菌株各一株(Sinorhizobium fredii S6和Bradyrhizobium sp. S10),分别在蛭石、土壤盆栽及大田试验条件下,研究这两株菌单独及混合接种对鲁黄1号大豆的生长、结瘤、固氮活力、产量、种子蛋白含量及含油量的影响.结果表明： 与S10菌株相比,S6菌株对大豆的促生能力更强,对提高产量和品质的效果更好,从而确定S6为与鲁黄1号大豆相匹配的高效根瘤菌,可作为黄淮海地区推广种植鲁黄1号大豆时接种高效根瘤菌的菌种资源.
     

丛枝菌根真菌对西瓜嫁接苗生长和根系防御性酶活性的影响

在温室盆栽条件下,研究丛枝菌根(AM)真菌地表球囊霉(Glomus versiforme)对连作土壤中西瓜自根苗和嫁接苗生长、根系膜透性、丙二醛(MDA)含量和防御性酶活性的影响.结果表明： 接种AM真菌能显著增加西瓜自根苗和嫁接苗的生物量,提高根系活力,降低根系膜透性和MDA含量.接种AM真菌的自根苗地上部鲜质量、地上部干质量和根系活力分别增加了57.6%、60.0%和142.1%,而接种AM真菌的嫁接苗分别增加了26.7%、28.0%和11.0%;自根苗（C）、嫁接苗（G）、接种AM真菌自根苗（C+M）和接种AM真菌嫁接苗（G+M）的根系细胞膜透性为C>G>C+M>G+M,根系MDA含量为C>G>G+M>C+M.接种AM真菌能提高西瓜自根苗和嫁接苗根系的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、几丁质酶和β 1,3 葡聚糖酶活性,而且接种AM真菌的西瓜自根苗和嫁接苗根系POD、PAL和β-1,3-葡聚糖酶活性的峰值比不接种的提前2周出现.接种AM真菌能激活西瓜自根苗和嫁接苗与抗逆性有关的防御性酶反应,使根系对逆境产生快速反应,从而提高其抗连作障碍的能力.     

丛枝菌根真菌对西瓜嫁接苗生长和根系防御性酶活性的影响

在温室盆栽条件下,研究丛枝菌根(AM)真菌地表球囊霉(Glomus versiforme)对连作土壤中西瓜自根苗和嫁接苗生长、根系膜透性、丙二醛(MDA)含量和防御性酶活性的影响.结果表明： 接种AM真菌能显著增加西瓜自根苗和嫁接苗的生物量,提高根系活力,降低根系膜透性和MDA含量.接种AM真菌的自根苗地上部鲜质量、地上部干质量和根系活力分别增加了57.6%、60.0%和142.1%,而接种AM真菌的嫁接苗分别增加了26.7%、28.0%和11.0%;自根苗（C）、嫁接苗（G）、接种AM真菌自根苗（C+M）和接种AM真菌嫁接苗（G+M）的根系细胞膜透性为C>G>C+M>G+M,根系MDA含量为C>G>G+M>C+M.接种AM真菌能提高西瓜自根苗和嫁接苗根系的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、几丁质酶和β 1,3 葡聚糖酶活性,而且接种AM真菌的西瓜自根苗和嫁接苗根系POD、PAL和β-1,3-葡聚糖酶活性的峰值比不接种的提前2周出现.接种AM真菌能激活西瓜自根苗和嫁接苗与抗逆性有关的防御性酶反应,使根系对逆境产生快速反应,从而提高其抗连作障碍的能力.     

长期连作对大豆根际土壤镰孢菌种群的影响

利用中国科学院海伦农业生态试验站大豆连作长期定位试验区,进行了大豆根际土壤镰孢菌分离鉴定及大豆根腐病致病力检测,结合核酸序列和限制性片段长度多态性(RFLP)的系统发育分析,研究了长期连作(20年)较短期连作(3年)对大豆根际土壤镰孢菌种群密度和结构、致病力及遗传多样性的影响.结果表明： 3年连作大豆根际土壤镰孢菌种群密度为6.0×10⁴ CFU·g^-1,且以强致病力的尖镰孢菌、禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌及中等致病力的腐皮镰孢菌为优势种;连作20年大豆根际土壤镰孢菌种群密度和优势菌的优势度均显著低于3年连作,其中尖镰孢菌、禾谷镰孢菌和腐皮镰孢菌的种群密度仅为3年连作的36%、32%和22%,没有分离到致病力最高的轮枝镰孢菌,而种群多样性和均匀度显著高于3年连作;仅分离自20年连作土壤的三线镰孢菌、砖红镰孢菌及燕麦镰孢菌均为非致病菌种,且与强致病力镰孢菌种在基于转录间隔区(ITS)和转录延长因子(EF-1α)序列的聚类分析中显示了系统进化亲缘关系的差异性.因此,大豆20年连作会导致根际土壤镰孢菌种群生长受抑制、使其种群结构和遗传多样性发生改变,同时降低大豆根腐病菌种群致病力.     

两株镰孢菌的鉴定及其粗毒素对甜瓜幼苗的化感作用

从甜瓜枯萎病发病植株及其根际病土中分离到8株真菌,以甜瓜品种“西甜1号”为材料,采用回接试验和种子萌发试验确定真菌分离物对甜瓜的致病性和生长抑制作用;通过测定盆栽幼苗根系诱导酶活性、抗性物质含量及细胞膜相对透性,研究两株有害真菌粗毒素对甜瓜幼苗的化感作用;根据形态学特征及ITS序列分析对两株有害真菌进行初步鉴定.结果表明： 两株有害真菌TF和HF粗毒素对甜瓜种子萌发以及胚轴、胚根生长具有抑制作用,可导致甜瓜幼苗根系丙二醛(MDA)含量、可溶性蛋白含量及细胞膜相对透性增加,其中TF粗毒素原液处理下甜瓜幼苗根系MDA含量和细胞膜相对透性较对照分别增加108.6%和40.6%.两株有害真菌粗毒素可提高甜瓜幼苗根系保护性诱导酶活性,其中,TF粗毒素10倍稀释液处理下根系苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)活性较对照分别增加25.6%和23.2%;HF粗毒素原液处理下根系PAL活性较对照提高30.0%.两株有害真菌TF和HF初步鉴定为木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)和层出镰孢菌(F. proliferatum).两株镰孢菌虽然不能通过回接侵染甜瓜,但能通过分泌毒素影响甜瓜正常生长和生理生化代谢,同时提高甜瓜根系保护性诱导酶活性,具有有害和有益双重作用,其化感危害是引起甜瓜连作障碍的主要原因之一.