XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

辛德毕斯病毒载体的研究进展

辛德毕斯病毒（Sindbis virus,SIN）属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）,全世界各大洲均有分布,是由吸血的蚊虫等传播的虫媒病毒,可引起“辛德毕斯综合热”,表现为发热、倦怠、头痛、关节痛和皮疹等,可自愈。无论从病毒形态、结构、病毒复制和翻译等功能辛德毕斯病毒均集中体现了动物病毒的特征,使其成为研究动物病毒基本规律的模型病毒,因此对该病毒的研究成为热点。 　　自1983年Brenard Moss首次将痘苗病毒改造为痘苗病毒载体以来［1］,病毒载体的研究一直是病毒学中一个十分活跃的领域。早期的人们主要把精力集中在DNA病毒载体上,如痘苗病毒、腺病毒、疱疹病毒等［1］。     

nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒XJ-160复制子载体特性的影响

为观察nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)XJ-160复制子载体特性的影响,以XJ-160病毒复制子载体pBRepXJ为分子基础,利用定点诱变方法分别构建突变载体pBRep-726L、pBRep-726S、pBRep-726V和pBRep-726A。将新霉素抗性基因(Neomycinr,Neor)克隆到pBRepXJ和各突变载体中,通过细胞培养方法观察nsP2-726Pro定点诱变对载体致细胞病变作用(Cytopathic effect,CPE)的影响;并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green-fluorescent protein,EGFP)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因分别插入到各载体中,定性与定量检测定点诱变对复制子载体自主复制能力的影响。实验结果表明,突变载体pBRep-726V和pBRep-726A在BHK-21细胞中的自主复制能力高于pBRepXJ,所诱发的细胞病变进程更快。替换突变nsP2-726Pro→Leu的引入使载体在保持包装能力的同时,完全丧失在细胞上引起CPE的能力。而pBRep-726S则具有中间表型。提示nsP2-726Pro定点诱变在影响XJ-160复制子载体自主复制能力的同时,也改变了CPE的进程。这将为研究辛德毕斯病毒基因组结构与功能的关系及构建非细胞病变的甲病毒载体奠定基础。     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

XJ-160病毒为辛德毕斯病毒新亚型

ＸＪ－１６０病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,在对其全基因组核苷酸序列测定的基础上,对病毒基因组序列、病毒同源性和病毒系统进化等进行了较为详细的分析,结果表明：ＸＪ－１６０病毒具有典型的甲病毒属德毕斯病毒的序列特征。该病毒ｎｓｐ３蛋白基因中１１处制失及两处插入（４５１７￣５４８５）,涉及９０年核苷酸。核苷酸序列的系统进化分析表明,ＸＪ－１６０病毒属于辛德毕斯病毒欧洲／非洲亚组。病毒全基因组核苷酸序     

中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析

报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定。利用RT—PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6RNA聚合酶启动子之后,基因组3’末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆。该克隆可在大肠杆菌DH5a中稳定扩增。经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到10^7～10^8PFU／ml。全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8453位核苷酸由C变为T)产生XbaⅠ酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在。从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆。该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具。     

辛德毕斯病毒蛋白质结构与功能的研究进展

本文在中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室合作完成. 辛德毕斯病毒(Sindbis virus)属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus).该病毒无论在病毒形态、病毒结构与病毒复制等方面均集中体现了动物病毒的许多具有普遍性的基本特性.因此对该病毒的研究,尤其是病毒功能蛋白质结构与功能的研究不仅能够回答该病毒本身的分子致病机理,而且从中得出的信息对于其它动物病毒的研究也具有借鉴意义[1].近年来,通过对辛德毕斯病毒各功能蛋白质的晶体结构的研究,对其结构与功能的关系积累了大量材料,取得重要进展,本文概述如下.     

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验,耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血压 凝特性、空斑和毒力等试验研究,结果符合披膜病毒科的病毒特性。交 因抑试验和免疫荧光试验,以及空斑减小中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒,其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符,纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义,其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。     

三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆

利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR。通过此融合片段两端引入的XbaI和XhoI酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cD-NA克隆,命名为pBR-XJ160YE1。该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变。间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达。提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆。此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具。     

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。     

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

狂犬病毒街毒株全长基因cDNA克隆的构建及鉴定

利用分子克隆的方法,将狂犬病毒街毒株的全基因组分为4个片段按照它们基因组上的顺序克隆到真核表达载体pVAX1上,并将G-L间隔区的非编码区替换为表达绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸,构建出表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组狂犬病毒HN10株全长基因组cDNA真核表达质粒,同时,在全长cDNA的两侧嵌入锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)的序列,并置于CMV启动子的控制下,为下一步拯救出该嵌合病毒提供了可直接使用的全长cDNA真核表达质粒。     

IS-98-ST1 West Nile Virus Derived from an Infectious cDNA Clone Retains Neuroinvasiveness and Neurovirulence Properties of the Original Virus

Infectious clones of West Nile virus (WNV) have previously been generated and used to decipher the role of viral proteins in WNV virulence. The majority of molecular clones obtained to date have been derived from North American, Australian, or African isolates. Here, we describe the construction of an infectious cDNA clone of a Mediterranean WNV strain, IS-98-ST1. We characterized the biological properties of the recovered recombinant virus in cell culture and in mice. The growth kinetics of recombinant and parental WNV were similar in Vero cells. Moreover, the phenotype of recombinant and parental WNV was indistinguishable as regards viremia, viral load in the brain, and mortality in susceptible and resistant mice. Finally, the pathobiology of the infectious clone was examined in embryonated chicken eggs. The capacity of different WNV strains to replicate in embryonated chicken eggs closely paralleled their ability to replicate in mice, suggesting that inoculation of embryonated chicken eggs could provide a practical in vivo model for the study of WNV pathogenesis. In conclusion, the IS-98-ST1 infectious clone will allow assessment of the impact of selected mutations and novel genomic changes appearing in emerging European strains pathogenicity and endemic or epidemic potential. This will be invaluable in the context of an increasing number of outbreaks and enhanced severity of infections in the Mediterranean basin and Eastern Europe.     

表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建

为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒。采用体外拼接策略,将BsaI酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5’端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’端具有polyA尾巴结构。然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性。本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础。