MicroRNA在果蝇原始生殖细胞命运调控中的功能研究

果蝇原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是生殖干细胞的前体。该群细胞在果蝇幼虫期经历特征性的发育过程,这一过程涉及程序化的细胞命运及行为改变。为系统探讨mi RNA在上述PGCs命运调控中的作用,对雌蝇幼虫发育中的性腺组织进行了mi RNA表达谱分析,发现一组mi RNA分子持续在性腺组织细胞中表达。应用GAL4/UAS遗传操作系统验证了部分候选mi RNAs的功能,获得了mi R-33和mi R-278参与调控果蝇幼虫PGCs有序分化的实验证据。该文为发育过程中功能性mi RNA研究工作的开展提供了有益的借鉴。     

miR-31-3p对横纹肌肉瘤细胞增殖和迁移的抑制作用和机制

该文研究了micro RNA-31-3p(mi R-31-3p)在横纹肌肉瘤细胞中的表达水平及其对细胞增殖和迁移的影响。通过定量RT-PCR法检测mi R-31-3p的表达水平。采用脂质体介导法将mi R-31-3p成熟体转染入横纹肌肉瘤细胞,通过MTS法、克隆形成实验、流式细胞技术和细胞功能分析仪分别检测细胞增殖能力、生长能力、周期和迁移能力。萤光素酶法和Western blot验证mi R-31-3p的靶基因。通过si RNA抑制STAT3检测其对横纹肌肉瘤细胞增殖和迁移的影响。结果显示,横纹肌肉瘤细胞中mi R-31-3p的表达水平较正常横纹肌组织显著下调。上调横纹肌肉瘤细胞中的mi R-31-3p能显著抑制细胞的增殖、克隆形成和迁移能力,并诱导细胞周期发生G1期阻滞。萤光素酶和Western blot结果显示, STAT3为mi R-31-3p的靶基因。下调STAT3的表达水平能够显著抑制RD细胞的增殖和迁移能力。总之, miR-31-3p可能通过下调STAT3来抑制横纹肌肉瘤细胞增殖和迁移。     

精神分裂症相关miRNA筛选及miR-320a调控ITGB1机制研究

该文研究了精神分裂症(schizophrenia,Sz)患者血清中微小RNA(micro RNA,mi RNA)水平的变化,寻找其作用靶点并进行机制探索。通过mi RNA基因芯片分析4例患者、3例治愈患者及3例健康成年人血清中mi RNA表达的差异。使用荧光定量PCR对59例患者及60例对照血清进行验证。通过生物信息学分析寻找靶点,并在血清样本中检测;最后,在细胞水平进行mi RNA调控靶点的功能研究。芯片筛选发现,mi R-320a及mi R-320b在初诊患者中呈低表达,较治愈患者和健康人有显著性差异,并在59例初诊患者和60例健康人对照血清中得到验证。生物信息学分析发现,整合素β1(integrinβ1,ITGB1)可能是mi R-320a的作用靶点。ELISA结果发现,患者血清中ITGB1的浓度比健康成年人血清中的浓度呈显著升高。细胞水平的研究发现,mi R-320a模拟物可以下调ITGB1表达,mi R-320a抑制剂可以上调ITGB1表达。荧光素酶实验证实,mi R-320a可能通过结合于ITGB1m RNA 3′UTR的特异性位点,促使m RNA降解,从而调控其表达。结果表明,mi R-320a调控ITGB1的表达可能是Sz发病过程中的重要机制,这一发现有可能为Sz的早期诊断和治疗提供新的候选靶点。     

黑腹果蝇二元表达系统原理及应用

二元表达系统是简单、高效的遗传操作工具,提高了特定基因的重组效率,实现了基因精确时空表达。目前应用于黑腹果蝇的二元表达系统主要有GAL4/UAS、FLP/FRT、Lex A/lex Aop、Q系统以及Cre/lox P、CRISPR/Cas9系统,其中GAL4/UAS和FLP/FRT系统应用最为广泛。二元表达系统的联合成功应用于嵌合体的构建,为细胞谱系分析、细胞间相互作用等研究提供了强有力的工具。综述了果蝇二元表达系统的原理、应用及各系统之间的联合应用,为研究者选择遗传操作工具提供了参考。     

肌细胞特异性microRNAs生物学效应研究进展

micro RNAs(mi RNAs)是一类含有20~22个核苷酸的非编码单链小分子RNA,发挥转录后水平负调控基因表达和翻译的作用,具有生物学功能多样性,可作为多种疾病诊断和预后重要分子标志。该文介绍了肌细胞特异性mi RNAs,如mi R-1、mi R-133、mi R-145、mi R-206基因等染色体分布、序列、组织表达丰度、主要通路,并对肌细胞特异性mi RNAs在气管平滑肌、血管平滑肌、心肌等细胞中的生物学效应研究进展进行综述。     

氧化应激诱导内皮细胞凋亡microRNA表达改变的研究

目的:研究氧化应激诱导的内皮细胞micro RNA的表达变化。方法:ECM(Endothelial Cell Medium)培养人脐静脉内皮细胞,利用不同浓度双氧水(0μmol/L,200μmol/L,500μmol/L,800μmol/L)刺激24小时后应用流式细胞术检测其凋亡水平。提取细胞总RNA,利用实时定量PCR(Quantitive real-time PCR;q RT-PCR)检测micro RNA表达量变化,并利用生物信息学软件预测可能的靶基因。结果:加入不同浓度双氧水处理24 h后的内皮细胞总凋亡率均显著高于对照组,200μmol/L、500μmol/L和800μmol/L组的凋亡率分别为(13.31%vs 4.75%,35.9%vs 4.75%,89.75%vs 4.75%,P0.01)。200μmol/L的双氧水处理内皮细胞后,micro RNA的表达出现了明显的改变。其中mi R-92a、mi R-126的表达明显下调(P0.05),mi R-181a、mi R-217、mi R-34a和mi R-320的表达明显上调(P0.05)。靶基因预测显示mi R-320、mi R-92a可能调控多个和内皮细胞凋亡相关的基因表达。结论:在氧化应激诱导的内皮细胞凋亡中,mi RNA表达发生改变并可能参与调控内皮细胞功能。     

miR-223在结肠癌组织中的表达及促进结肠癌细胞迁移侵袭的机制研究

目的:探讨微小RNA-223 (mi R-223)在结肠癌组织中的表达及对结肠癌HT-29细胞侵袭、迁移能力的影响及机制。方法:检测mi R-223在结肠癌组织与癌旁组织中的表达。通过脂质体转染法将mi R-223模拟物(mi R-223 mimics,mi R-223 mimics组)及microRNA无关序列(mi R-223 NC,NC组)转染入结肠癌HT-29细胞。采用Real-time PCR检测转染后细胞中mi R-223和TWIST的表达,Western blot检测TWIST的蛋白表达,Tranwell检测细胞的迁移与侵袭能力。双荧光素酶报告基因检测mi R-223对TWIST基因启动子活性的影响。采用Transwell迁移与侵袭实验检测mi R-223 mimic及Twist si RNA共转染后人结肠癌细胞系HT-29迁移与侵袭能力的变化。结果:与癌旁结肠组织比较,mi R-223在结肠癌组织中呈现明显高表达(P0.05);与空白对照组和mi R-223 NC组比较,转染mi R-223 mimics后的HT-29细胞中的mi R-223表达显著增加(P0.05)。与阴性对照组和空载转染组相比较,mi R-223 mimics转染组穿透的细胞数目明显增加(P0.05),且mi R-223 mimics转染组的细胞侵袭能力显著增强(P0.05)。与mi R-223 NC组和空白对照组比较,转染mi R-223 mimics的HT-29细胞的TWIST基因m RNA和蛋白表达均显著增加(P0.05)。双荧光素酶检验结果显示TWIST为mi R-223的下游靶基因。共转染TWIST si RNA和mi R-223 mimics的结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭能力较单独转染mi R-223 mimics的HT-29细胞显著减弱(P0.05)。结论:mi R-223可能通过上调下游靶基因TWIST水平促进结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭。     

MARVELD1调控内含子miR-186、miR-335表达的研究

目的:前期研究发现,MARVELD1(具有囊泡运输和膜连接功能的MAL及相关蛋白1)在多种肿瘤细胞中表达下调,许多micro RNAs也随其发生变化。本研究探讨了MARVELD1调控mi R-186和mi R-335的表达方式。方法:本研究选取了多种肺癌细胞系,运用q RT-PCR的方法检测了MARVELD1以及mi R-186和mi R-335的表达情况,通过MARVELD1过表达体系和si RNA干扰MARVELD1表达的体系分析mi R-186和mi R-335表达变化情况,运用生物信息学网站对mi R-186和mi R-335进行分析,确认其是否为内含子mi RNA,并进一步应用MARVELD1过表达和RNAi体系检测MARVELD1对mi R-186和mi R-335的宿主基因的影响。结果:在肺癌细胞中,MARVELD1与mi R-186、mi R-335的表达呈现明显的正相关。在过表达MARVELD1之后,mi R-186、mi R-335出现高表达;当下调MARVELD1表达时,mi R-186、mi R-335则表现低表达。生物信息学分析发现mi R-186和mi R-335均为内含子mi RNA。进一步分析MARVELD1与mi R-186和mi R-335宿主基因的表达关系显示,MARVELD1可以上调它们的宿主基因的表达。结论:上述结果表明,MARVELD1可通过影响内含子mi R-186和mi R-335的宿主基因进而调控二者的表达,为进一步研究MARVELD1影响肿瘤细胞的发生机制奠定了基础。     

人肿瘤坏死因子α特异性结合miR-146b的新生物学特性研究

目的:探讨人肿瘤坏死因子α(TNF-α)作为micro RNA(mi RNA)结合蛋白的生物学特性。方法:Western印迹检测LPS激活的U937细胞中TNF-α蛋白表达水平,RT-PCR检测几种炎症相关的mi RNA在激活前后表达水平的变化;用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RIP)技术钓取U937细胞中TNF-α结合的mi RNA,RT-PCR检测RIP产物中上述几种mi RNA的含量;用凝胶阻滞实验检测TNF-α与mi RNA是否直接结合。结果:LPS激活的U937细胞中能检测到膜结合型和可溶性2种形式的TNF-α,细胞激活前后mi R-16和mi R-21的表达水平在检测的几种mi RNA中最高,mi R-146b和mi R155次之;而RIP产物中mi R-146b的水平在实验组和对照组中有显著差异,其他mi RNA差异不明显;凝胶阻滞实验结果显示mi R-146b能与人TNF-α直接结合。结论:首次证实人TNF-α能够直接特异地结合mi R-146b,提示TNF-α可能作为mi RNA结合蛋白发挥生物学功能。     

乏氧和辐射诱导的miR-1290 促进宫颈癌细胞EMT发生

目的:研究mi R-1290在宫颈癌Hela细胞上皮间质转化中的作用。方法:模拟肿瘤放射治疗的分割疗法,单次2 Gyγ射线连续照射宫颈癌Hela、Siha细胞诱导辐射抗性细胞株;采用micro RNA芯片技术比较辐射抗性细胞与亲本细胞中mi RNA的表达谱差异;经不同条件乏氧和辐射处理宫颈癌Hela细胞后检测mi R-1290的表达水平;借助mi R-1290及mi R-1290-inhibition慢病毒表达载体,调变mi R-1290在Hela细胞的表达;调变mi R-1290后,划痕实验及Transwell侵袭实验比较Hela细胞的侵袭和转移能力;蛋白质印迹法检测细胞中E钙黏素(E-cadherin)和N钙黏素(N-cadherin)的表达。结果:在宫颈癌辐射抗性细胞中mi R-1290表达水平显著升高(P0.05);乏氧和辐射可诱导mi R-1290在宫颈癌Hela细胞中表达(P0.05);上调表达mi R-1290,Hela细胞出现了明显的间质细胞的形态改变,细胞的侵袭和转移能力明显增强(P0.05)。在Hela细胞中上调表达mi R-1290,降低了细胞中E-cadherin的表达,同时升高了N-cadherin的表达(P0.05)。结论:乏氧和辐射可诱导mi R-1290在宫颈癌Hela细胞中表达,mi R-1290通过调控E-cadherin和N-cadherin的表达促进宫颈癌Hela细胞发生EMT。     

小鼠精子发生早期microRNA的表达谱和调控模式——miRNA在小鼠精子发生中的作用

精子发生是一个依赖于精原干细胞自我更新和精原细胞分化的精确而又复杂的调控过程,目前对这一过程知之甚少.mi RNA作为转录和转录后基因沉默的关键调节子,参与很多生物的多种发育过程.本研究采用高通量小RNA测序系统研究了mi RNA在小鼠B型精原细胞(BSc)和初级精母细胞(PSc)中的表达谱.结果显示,在这2种细胞类型中let-7mi RNA家族的表达水平都相当高.并且在BSc向PSc的转化过程中,mi R-21,mi R-140-3p,mi R-103,mi R-30a,mi R-101b和mi R-99b的表达水平明显降低.这些mi RNA参与调控与细胞凋亡、细胞增殖和分化、连接组装和细胞周期调控相关的诸多基因的表达.上述结果表明,mi RNAs在精子发生过程中发挥着不可替代的作用.     

miR-17-92、自噬在肿瘤中的研究进展

micro RNA(mi RNA)是一类在转录后水平调控目的基因表达的功能性小RNA分子。mi R-17-92基因簇是一个高度保守的基因簇,编码6个mi RNAs,分别为:mi R-17、mi R-18a、mi R-19a、mi R-19b-1、mi R-20a和mi R-92a。细胞自噬(autophagy)是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程。mi RNA的异常表达可影响自噬水平,从而影响肿瘤的发生发展。研究证明mi R-17-92基因簇与细胞自噬及肿瘤的发生密切相关,有望成为具有潜在价值的肿瘤标志物或肿瘤治疗的新靶点。现对mi R-17-92基因簇与细胞自噬和肿瘤的关系进行综述。     

miR-183家族在肿瘤中作用机理的最新进展

micro RNA是真核生物中一类长约18~25个核苷酸的小分子非编码RNA,它们可以与m RNA的3′-UTR结合在转录后水平调控基因的表达。很多报道表明,mi RNA参与了肿瘤的发生发展调控。mi R-183家族的三个成员mi R-183、mi R-96和mi R-182都与肿瘤密切相关。研究发现,在前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤中mi R-183家族表达异常,其机制是通过调控多种靶基因参与其中。本文综述了mi R-183家族在常见高发肿瘤中的研究现状。     

miR-199a-3p负调控CBX7影响肺癌细胞NCI-H460的生物学行为研究

目的:探讨mi R-199a-3p负调控CBX7影响肺癌细胞NCI-H460的生物学行为。方法:qRT-PCR法检测并比较肺癌组织、癌旁正常组织、肺癌细胞、正常肺上皮细胞中的mi R-199a-3p m RNA相对表达量。比较远处转移肺癌组织、未转移肺癌组织中mi R-199a-3p m RNA相对表达量。qRT-PCR法、Western Blot法检测并比较肺癌组织、癌旁正常组织中的CBX7 m RNA及蛋白的表达水平。荧光素酶活性法检测mi R-199a-3p与靶基因CBX7的结合。比较mi R-199a-3p模拟物转染组与阴性对照组的肺癌细胞中的CBX7 m RNA相对表达量及CBX7蛋白表达水平。CCK8实验检测mi R-199a-3p对肺癌细胞增殖的促进作用。Tranwell实验检测mi R-199a-3p对肺癌细胞侵袭与迁移能力的影响。结果:肺癌组织中mi R-199a-3p明显高于癌旁正常组织,发生远处转移的肺癌组织中mi R-199a-3p m RNA的表达量明显高于未发生转移的肺癌组织,差异有统计学意义(P<0.001)。肺癌组织中CBX7m RNA、CBX7蛋白表达水平均明显低于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P<0.001)。荧光素酶活性法证实mi R-199a-3p可与靶基因CBX7结合抑制CBX7的表达。肺癌细胞中mi R-199a-3p m RNA的相对表达量明显高于正常肺上皮细胞,CBX7 m RNA相对表达量明显低于正常肺上皮细胞(P<0.05)。对于肺癌细胞,mi R-199a-3p模拟物转染组的CBX7 m RNA相对表达量及CBX7蛋白表达水平均明显低于阴性对照组(P<0.001)。CCK8实验证实mi R-199a-3p能够促进肺癌细胞的增殖,Tranwell实验证实mi R-199a-3p对肺癌细胞侵袭与迁移具有积极的促进作用。结论:mi R-199a-3p在肺癌的发生发展过程中发挥重要作用,能够通过抑制CBX7基因的表达,促进肺癌细胞的增殖、侵袭和转移。     

GAL4/UAS系统在果蝇Tis11基因RNA干扰中的应用

TTP在哺乳动物许多关键基因表达的转录后水平上起调控作用,Tis11是TTP蛋白在果蝇中的同源物.目前还没有现成的可用于研究Tis11功能的基因敲除或敲低的果蝇.为了获得肌动蛋白启动子或者热激蛋白启动子驱动表达Tis11 mRNA干扰序列的具有较高干扰效率的Tis11基因干扰果蝇,将肌动蛋白启动子或者热激启动子驱动表达的GAL4果蝇品系与融合有Tis11 mRNA干扰序列的UAS品系杂交,收集同时带有GAL4基因和UAS序列的子一代果蝇.提取所收集果蝇的总RNA,将其中的mRNA逆转录成cDNA,并设计检测Tis11基因的特异性引物,然后通过Real-time PCR检测Tis11 mRNA的表达情况.结果显示所收集的能表达Tis11基因干扰序列的子一代果蝇与不能表达Tis11基因干扰序列的对照果蝇相比,其体内Tis11 mRNA的表达水平下降明显.收集的果蝇其体内所表达的干扰序列对Tis11 mRNA干扰效果显著,我们成功获得了Tis11基因的RNA干扰果蝇.     

MicroRNA在子宫肌瘤发病机制研究中的现状

微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类非编码单链小分子RNA,参与调控细胞增殖、分化、凋亡及迁移等多种生理过程。最新研究发现,mi RNA在子宫肌瘤发生发展中的细胞转化、组织重构、血管生成及炎症反应等方面均起着重要调控作用。这提示,mi RNA不但可以作为探索子宫肌瘤发病机制的新途径,而且可能成为子宫肌瘤诊断、治疗和预后判断的新靶点。该文就近年来mi RNA在子宫肌瘤发病机制研究中的现状进行综述。     

循环miR-155作为肿瘤生物标志物的研究进展

microRNAs(mi RNAs)是一类在转录后水平影响生物体基因表达的小分子非编码RNA,参与调控机体正常发育和疾病发生发展等过程。新近研究发现,循环mi RNA由于具有取样方便和高度稳定性等优点,迅速成为目前的研究热点。micro RNA-155(mi R-155)在多种肿瘤中高表达。循环mi R-155已被证实与多种肿瘤的发生、发展相关,可作为一种分子标志物用于肿瘤的早期诊断和实时监测。该文围绕循环mi R-155作为肿瘤标志物的研究进展予以综述。     

结合GAL4/UAS系统与CyO-GFP平衡子获取表达RNA干扰序列果蝇幼虫并有效干扰Tis11表达

TIS11是转录后调控因子TTP在果蝇中的同源物,在果蝇幼虫免疫、发育和代谢等多种生理过程中都发挥重要作用.为研究TIS11的功能,需要利用GAL4/UAS系统获得整体高干扰效率的Tis11 RNAi果蝇幼虫．为平衡GAL4转基因果蝇高活性启动子的致死效应,需要使用带有成蝇卷翅标记CyO的第二染色体的平衡子,但CyO标记在幼虫中无可见表型,因此无法区分杂交幼虫的基因型．为解决这一问题,引入了带有CyO-GFP标记的平衡子．携带CyO-GFP平衡子的G-Actin果蝇与携带Tis11 RNAi序列的101765果蝇杂交,杂交幼虫可以通过GFP标记进行区分,剔除带有CyO-GFP平衡子的幼虫,从而挑选出表达Tis11 RNAi序列的幼虫,最后经real-time PCR检测所得幼虫具有整体高干扰效率．     

miR-24对心脏成纤维细胞生长和迁移的影响及机制研究

目的:探讨miR-24对心脏成纤维细胞的生长和迁移的影响及机制。方法:采用RT-PCR检测心肌细胞和心脏成纤维细胞中mi R-24的表达水平。在心脏成纤维细胞中转染mi R-24 mimics、mimics control、mi R-24 inhibitors、inhibitors control后,通过Western blot检测细胞中Col-1、α-SMA的表达,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Transwell小室检测细胞迁移能力。通过靶基因预测库预测mi R-24的靶基因,荧光素酶鉴定靶基因的正确性,并通过RT-PCR和Western blot检测转染后细胞中Furin的表达。结果:心脏成纤维细胞HEH2中mi R-24的表达水平与心肌细胞H9C2相比差异显著(P0.01),心脏成纤维细胞中mi R-24表达上调。mi R-24 mimics组中Col-1、α-SMA的表达水平明显低于mimics control组(P0.01)。mi R-24 mimics组中细胞OD值较mimics control组显著降低(P0.01),mi R-24 inhibitors组中细胞OD值较inhibitors control组显著升高(P0.01)。mi R-24 mimics组、mimics control组、mi R-24 inhibitors组、inhibitors control组细胞凋亡无显著性差异(P0.05)。mi R-24 mimics组细胞迁移数目明显低于mimics control组,差异显著(P0.01),mi R-24 inhibitors组细胞迁移数目高于inhibitors control组,差异显著(P0.05)。mi R-24 mimics组细胞中Furin蛋白和m RNA水平明显降低,野生型Furin和mi R-24 mimics共转染的细胞中荧光素酶活性最低。结论:mi R-24在心脏成纤维细胞中高表达,通过靶基因Furin抑制心脏成纤维细胞合成Col-1、α-SMA,抑制心脏成纤维细胞增殖和迁移。