沙眼衣原体生长依赖MEK/ERK信号通路的激活

衣原体感染可激活宿主细胞的MEK/ERK信号通路,但该信号通路对表原体生长的影响尚不清楚.通过Western blot和免疫荧光试验分别检测MEK/ERK信号通路阻断后沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP)表达及沙眼衣原体感染滴度的变化.研究MEK/ERK信号通路对沙眼衣原体生长的影响.研究发现,MEK/ERK信号通路阻断后MOMP表达减少,同时衣原体感染滴度也明显降低.结果表明沙眼衣原体的生长依赖MEK/ERK信号通路的激活.     

PDGF-BB下调血管平滑肌标志物SM22α表达的机制

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）表型转化是血管重塑性疾病的细胞病理学基础,血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）-BB抑制平滑肌分化标志基因表达、加速其降解,是VSMC表型转化的关键。该研究用PDGF-BB刺激VSMC诱导细胞发生表型转化,利用Western blot和免疫共沉淀等技术,检测PDGF-BB对早期分化相关基因平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha,SM22α）磷酸化与泛素化的影响。实验结果显示,PDGF-BB促进VSMC增殖;上调增殖相关蛋白PCNA的表达,下调分化相关蛋白SM22α与SMα-actin的表达;诱导SM22α发生磷酸化和泛素化,而且,该过程与SM22α水平下调具有时相相关性;抑制剂阻断分析证实,ERK和PKC参与介导了PDGF-BB诱导的SM22α磷酸化。以上结果提示,在VSMCs表型转化中,PDGF-BB可能是通过激活ERK-PKC信号通路,促进SM22α的磷酸化和泛素依赖的蛋白质降解。     

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测 p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量（TCID_５０）,以及观察感染细胞的细胞病变效应（CPE）等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与 ERK通路的关系. 结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.     

14-3-3参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径研究

本室以前已经报道了G蛋白偶联受体APJ的内源性配体多肽,apelin-13,通过激活ERK1/2促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.本文研究14-3-3信号蛋白是否参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径,探讨apelin/APJ系统的细胞信号转导机制.组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs;Western blotting方法检测14-3-3、pRaf-1、Raf-1、pERK1/2、ERK1/2、cyclinD1、cyclinE的表达;MTT方法观察14-3-3抑制剂Difopein对VSMCs的增殖作用;免疫共沉淀方法检测14-3-3和Raf-1蛋白复合物的形成.Western blotting方法结果显示,apelin-13(0、0.5、1、2、4μmol/L)浓度依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,以2μmol/L最为明显;2μmol/L apelin-13时间依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,在4 h增加最为显著;14-3-3蛋白抑制剂Difopein明显抑制apelin-13诱导的Raf-1磷酸化、ERK1/2磷酸化、cyclinD1及cyclinE表达;免疫共沉淀方法发现apelin-13诱导14-3-3与Raf-1结合增加,而Difopein明显抑制两者结合;MTT法显示Difopein明显抑制apelin-13诱导的血管平滑肌细胞增殖.上述结果表明,Apelin-13通过14-3-3/Raf-1复合物-ERK1/2信号转导通路促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.     

细胞外信号调节激酶活化在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

本文旨在探讨细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）增殖中的作用。建立慢性哮喘大鼠模型,用ERK激动剂表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和抑制剂PD98059干预慢性哮喘大鼠ASMCs的培养。采用流式细胞仪、四甲基偶氮唑盐（MTT）法、^3H-thymidine（TdR）掺入法和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）免疫组织化学法检测ASMCs增殖情况,观察ERK信号通路对ASMCs增殖的影响。RT-PCR和Western blot检测ERK mRNA和ERK1／2、磷酸化ERK1／2（p-ERK1／2）蛋白的表达。与正常对照组ASMCs比较,慢性哮喘组ASMCs的G0/G1期细胞所占比例明显减少,S＋G2／M期细胞所占比例增高;吸光度（A490）值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量均明显增加,ERK mRNA、ERK1／2蛋白、P-ERK1／2蛋白的表达量以及ERK活化率显著增高。经PD98059干预之后,慢性哮喘组ASMCs的S＋G2／M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量明显降低,ERK mRNA、ERK1／2蛋白、p-ERK1／2蛋白的表达量以及ERK活化率显著降低。经EGF干预后,慢性哮喘组ASMCs的S＋G2／M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量进一步增高,而这一作用可以被PD98059抑制。以上结果提示,慢性哮喘大鼠ASMCs内源性增殖活性增加,ERK1／2参与其增殖活性的调控,ERK信号通路在哮喘气道重建的ASMCs增殖调控中具有重要作用。     

血小板源生长因子-AA对高血压血管平滑肌细胞钙信号的影响

目的 :明确自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞 (SHR VSMC)增殖与血小板源生长因子 AA(PDGF AA)、PDGF α受体表达的关系及钙信号在其中的作用。方法 :在培养的血管平滑肌细胞模型中 ,采用免疫印迹 (Westernblot)、3 H TdR及3 H Leu掺入、荧光探针标记测定单细胞内钙浓度等方法 ,观察不同来源大鼠 (SHR/WKY)VSMC ,PDGF AA、PDGF α受体和PDGF β受体表达的差异性以及在PDGF AA刺激下 ,VSMC增殖肥大反应、胞内 [Ca2 ]i变化和钙离子阻断剂 (nimodipine)对其的影响。 结果 :与WKY VSMC相比SHR VSMC中PDGF AA、PDGF α受体蛋白表达明显增加 ,而PDGF β受体蛋白表达在SHR VSMC与WKY VSMC无明显变化。在PDGF AA刺激下 ,增殖细胞核抗原 (PCNA)、3 H掺入率及胞内 [Ca2 ]i浓度在SHR VSMC明显增强 ;钙离子阻断剂 (nimodipine)明显抑制PCNA表达及3 H掺入 ,胞内 [Ca2 ]i浓度明显下降。结论 :自发性高血压大鼠VSMCPDGF A链及其α受体的自发性增高 ,可能是导致SHR VSMC异常增殖、肥大 ,从而触发血管反应性和血管构型变化的重要原因之一 ;细胞膜钙通道在调控VSMC的钙内流时起主要作用     

酸化环境对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及姜黄素对此的作用

探讨姜黄素对缺血缺氧引起细胞外环境酸化下血管平滑肌增殖的影响及可能机制。在pH 6.9的环境下体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),分别以姜黄素、PCTX-1等处理细胞,并设置空白对照组;采用Western-Blot法测定ASICS 1a蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白表达,CCK-8法测定各处理组对VSMC增殖影响。结果显示pH 6.9组显著刺激VSMC的ASICS 1a和ERK1/2磷酸化表达,并促使VSMC增殖;而姜黄素显著抑制大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞上ASICS 1a及细胞内磷酸化ERK1/2蛋白表达,从而抑制VSMC增殖。在缺血缺氧所致酸化环境下,大鼠胸主动脉血管平滑肌上的ASIC 1a表达增多,引起细胞内ERK1/2磷酸化,从而对血管平滑肌的增殖进行调控,而姜黄素则表现出抑制作用。     

MEK/ERK信号通路与脑缺血再灌注损伤

在脑缺血病灶中,中心区神经元坏死为主,周围以缺血半暗带凋亡为主,抑制半暗带细胞的凋亡,可以减少细胞的死亡和脑梗死的面积,因此改善半暗带是治疗脑卒中的关键环节.目前发现MAPK分布于整个中枢神经系统中,MEK/ERK信号通路参与细胞生长、发育、细胞抗凋亡等过程,在脑缺血再灌注损伤过程中有MEK/ERK信号通路的参与,MEK/ERK通路通过影响Bcl-2家族成员的活化和表达调控内源性凋亡途径,ERK通过对细胞周期的调控,抑制胶质细胞大量活化和过度增殖,减少了有害因子并改善局部微循环,从而减少神经元的凋亡.可能为脑血管的防治开辟一条新的途径.本文就MEK/ERK信号通路的结构特点与脑缺血再灌注损伤相关作用机制作一综述.     

自发性高血压大鼠中血小板源生长因子—AA及其受体表达与血管平滑机细胞增殖的关系

为明确血小板源生长因子 AA(plateletderivedgrowthfactor AA ,PDGF AA)及PDGF α受体在自发性高血压大鼠 (spontaneouslyhypertensionrats,SHR)血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖中的作用 ,采用Westernblot、[3 H]TdR及 [3 H]Leu掺入率等方法 ,观察在SHR和WKY大鼠VSMC中PDGF AA及PDGF受体表达的差异 ;在PDGF AA刺激下VSMC增殖和肥大反应的变化。结果显示 ,SHR VSMC中PDGF AA、PDGF α受体蛋白表达明显高于WKY VSMC(P <0 0 1) ,而PDGF β受体蛋白表达在SHR VSMC与WKY VSMC无明显差异 ;在不同浓度PDGF AA刺激下 ,增殖细胞核抗原 (PCNA)及3 H掺入率在SHR VSMC明显增强且呈剂量依赖性增加 (P <0 0 1)。本研究表明PDGF A链及其α受体的自泌性增高 ,可能是导致SHR VSMC异常增殖和肥大 ,并导致血管构型变化的重要原因之一     

Cyclosporin A通过MEK/ERK1/2信号通路调节滋养细胞titin表达

探讨MEK/ERK1/2信号通路在Cyclosporin A(CsA)诱导滋养细胞表达titin中的作用。应用RT-PCR、Western blot检测CsA诱导的滋养细胞titin的表达水平,Western blot检测CsA作用于滋养细胞后ERK1/2的活化程度,并观察MEK特异性抑制剂U0126对其mRNA转录的影响。发现CsA以时间和剂量依赖方式诱导titin表达,并刺激滋养细胞ERK1/2的活化,U0126以剂量依赖方式抑制CsA诱导的titin表达。结果表明CsA通过活化MEK/ERK1/2信号通路诱导滋养细胞titin 的表达,改变其生物学行为,从而有利于胚胎着床及早期发育。     

SM22α抑制球囊损伤诱导的新生内膜形成

观察外源性SM22α对球囊损伤诱导的大鼠颈总动脉新生内膜形成的影响,并探讨其机制。雄性SD大鼠经球囊剥脱颈总动脉内皮后随机分为3组:未感染组、pAd组和pAd-SM22α组。术后14天取颈总动脉标本,HE染色观察血管内膜增生情况,用Western blot和免疫组化方法检测外源性SM22α、PCNA和p27在血管壁中的表达水平,以及Raf-1、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平。实验结果显示,外源性SM22α在血管壁中得到稳定表达;过表达SM22α可显著抑制球囊损伤诱导的血管新生内膜的增厚,与pAd组比较,内膜/中膜比值(I/M)降低70%;Western blot结果显示,在pAd-SM22α组中增殖标志物PCNA表达水平降低(P0.05),而增殖抑制蛋白p27表达水平增高(P0.05),同时伴有增殖相关信号转导分子Raf-1、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平降低(P0.05)。结果提示,过表达SM22α可抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生,其机制可能与阻断Raf-1-MEK1/2-ERK1/2通路的级联活化有关。     

大鼠高血压相关基因表达蛋白抑制血管平滑肌细胞增殖

大鼠高血压相关基因 ( r HRG- 1 )编码一新细胞内信号传递蛋白 .体外转染 r HRG- 1表达蛋白发现 r HRG- 1表达蛋白能抑制自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞内 Raf蛋白 ( Raf- 1 )和丝裂素活化蛋白激酶 ( MAPK)活性 ,抑制抗细胞凋亡基因 ( bcl- 2 )和增殖细胞核抗原 ( PCNA)基因 m RNA表达 ,同时还抑制该细胞 DNA的合成 .r HRG- 1是一正常血压大鼠血管平滑肌细胞内高度表达的基因 ,由此推测在自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞内转染 r HRG- 1表达蛋白抑制其细胞 DNA合成的作用可能是抑制细胞内 Raf- 1活性与 MAPK活性及抑制 PCNA和 bcl- 2基因表达的结果     

血小板源性生长因子对血管平滑肌细胞效应的机制研究进展

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖及迁移是动脉粥样硬化(arteriosclerosis,AS)、支架后再狭窄(in-stent restenosis,ISR)发生、发展中共同的病理过程。血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是一种强效的促有丝分裂剂,在VSMCs增殖及迁移过程中具有重要作用。本文综述PDGF的生物学作用及其促进VSMCs增殖及迁移的机制研究新进展,特别是通过抑制该靶点对VSMCs增殖及迁移的意义。     

17β—雌二醇下调血管平滑肌内皮素A型受体的表达

为进一步探讨雌激素对心血管的保护作用,实验在双侧卵巢去势大鼠模型和培养的血管平滑肌细胞（VSMCs)上,观察17β－雌二醇（E2）对血管反应性及VSMCs增殖的影响,以RT－PCR和Western blot检测内皮素受体（ETAR）的表达,结果显示：去势雌性大鼠血管对内皮素（ET－1）的反应性明显增高,ETAR特异性受体阻断剂BQ123能完全阻断ET－1对VSMCs增殖的影响,E2能明显抑制ET－1对VSMCs增殖的作用,RT－PCR结果显示E2能抑制ETAR mRNA的表达,Western blot进一步证实E2能抑制ETAR蛋白表达,E2受体阻断剂Tamoxifen能部分抑制ET－1对VSMCs的增殖及ETAR的mRNA和蛋白 的表达。以上结果提示;ET－1促VSMCs增殖的效应主要是由ETAR介导的,雌激素能通过下调ETAR来抑制ET－1对VSMCs 促增殖的作用和血管对ET－1的反应,且此作用与雌激素受体有关。     

血管紧张素-(1-7)对大鼠血管平滑肌细胞PKC和ERK1/2的抑制作用

采用Westernblot、氚 胸腺嘧啶 ( 3H TdR)和氚 亮氨酸 ( 3H Leu )掺入等技术和方法 ,用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ )和血管紧张素 ( 1 7) [Ang ( 1 7) ]刺激大鼠血管平滑肌细胞 (VSMCs) ,观察和分析Ang ( 1 7)对VSMCs增殖及蛋白激酶C (PKC)和胞外调节蛋白激酶 (ERK)表达的影响。Ang ( 1 7)能明显抑制基础和AngⅡ刺激下的VSMCsPKC ζ和ERK1/ 2蛋白表达 (P <0 0 1或P <0 0 5 ) ,减少3H TdR和3H Leu掺入量 (P <0 0 1或P <0 0 5 )。结果提示 ,Ang ( 1 7)对VSMCs增殖有抑制作用 ,这可能与影响PKC ζ和ERK1/ 2蛋白表达有关。     

白藜芦醇通过下调MEK/ERK/c-Jun信号通路抑制H2O2诱导的肺癌细胞增殖

目的:探讨白藜芦醇(Res)是否通过下调ERK激酶/胞外信号调节激酶/原癌基因(MEK/ERK/c-Jun)信号通路抑制小剂量过氧化氢(H2O2)诱导肺癌细胞增殖。方法:采用MTS实验检测小剂量20μM H2O2以及分别加入MEK阻断剂U0126和Res后H2O2对肺癌细胞NCI-H1395增殖的影响,采用Western Blot检测H2O2对ERK1/2和Akt蛋白磷酸化水平以及加入Res后H2O2对MEK、ERK1/2和c-Jun蛋白磷酸化水平的影响。结果:小剂量H2O2对肺癌细胞NCI-H1395具有促增殖作用,H2O2通过活化ERK1/2和Akt蛋白的磷酸化水平促进肺癌细胞NCI-H1395增殖,加入MEK阻断剂U0126后H2O2对肺癌细胞NCI-H1395增殖作用降低(P<0.05)。Res可抑制H2O2诱导的肺癌细胞NCI-H1395增殖,加入Res后,H2O2引起的MEK、ERK1/2和c-Jun蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05)。结论:小剂量H2O2对肺癌细胞NCI-H1395具有促增殖作用,Res通过抑制MEK/ERK/c-Jun信号通路来抑制H2O2对肺癌细胞NCI-H1395的促增殖作用,其具体机制还需进一步研究。     

黄芩苷对血管平滑肌细胞增殖的调控作用及相关信号通路研究

血管平滑肌细胞(VSMC)过度增殖是多种血管疾病发生的根本原因,黄芩苷作为一种传统植物天然药物,具有抗菌、消炎以及保护血管等多种功能。本研究采用细胞学及分子生物学手段,通过CCK-8法检测不同浓度的黄芩苷(0μmol/L,50μmol/L和100μmol/L)对VSMC增殖的作用,同时测定增殖细胞核抗原PCNA的转录水平,进一步对VSMC增殖进行基因水平上的验证。同时,对MAPK信号通路中的关键因子ERK的表达量进行定量检测,分析黄芩苷调控VSMC增殖的信号通路。结果显示黄芩苷对VSMC增殖具有抑制作用,且呈药物剂量依赖效应;此外,VSMC中ERK的表达水平也随黄芩苷使用浓度增大而降低,从而推测黄芩苷可能通过调控ERK介导的相关信号途径实现对VSMC增殖的阻抑,达到防止血管发生病变的目的。此研究对保护血管功能和开发治疗血管疾病新药物具有积极的意义,也为代谢工程在天然药物开发方面的应用提供理论依据和实践基础。     

PBK/TOPK在乳腺癌细胞中介导MEK非依赖性ERK激活中作用机制分析

该文探讨了乳腺癌细胞中表皮生长因子(EGF)介导的MEK非依赖性ERK激活通路。Western blot检测EGF刺激下,siRNA抑制MEK1/2后的T47D细胞的p-ERK水平,以验证T47D细胞中存在EGF介导的MEK非依赖性ERK激活的通路。接着使用可能参与MEK非依赖性ERK激活的激酶的小分子抑制剂抑制相关激酶(AC、PKC、Src、PI3K、PDK1和Akt)活性后,检测T47D细胞EGF介导ERK的磷酸化水平。siRNA抑制MEK1/2表达后,T47D细胞在EGF刺激后的仍保留部分p-ERK,即在T47D细胞中,存在EGF介导的MEK非依赖性的ERK磷酸化通路。小分子抑制剂抑制AC、PKC、Src对MEK非依赖性ERK激活途径影响不大。而使用小分子抑制剂抑制PI3K、PDK1和Akt后,ERK的磷酸化水平显著降低,提示PI3K/Akt通路下游的激酶参与T47D中EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径。siRNA干扰PI3K/Akt通路下游PBK/TOPK后并使用U0126抑制MEK功能后,几乎检测不到p-ERK,提示PBK/TOPK参与T47D细胞中EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径。乳腺癌抗雌激素药物耐药株T47D细胞存在EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径,且该途径受PI3K/Akt下游的PBK/TOPK调控。     

ERK1/2在食管鳞状细胞癌中促进细胞增殖、抑制凋亡及其调控机制的研究

探讨ERK1/2在食管鳞状细胞癌(ESCC)中对肿瘤细胞增殖、凋亡的调控及其机制。平板克隆、细胞凋亡和细胞周期实验结果发现ERK1/2 MAPK通路抑制可减弱Eca109细胞克隆形成和增殖,促进细胞凋亡,减慢细胞周期;进一步发现ERK1/2 MAPK通路抑制可以反转由mi R-21过表达诱导的Eca109细胞增殖、凋亡和周期的变化;q RT-PCR和Western-blot免疫印迹结果发现ERK1/2 MAPK信号通路抑制可以下调内源性mi R-21表达和反转外源性mi R-21诱导的ERK1/2 MAPK信号通路活化。实验结果提示ERK1/2 MAPK通路抑制可能通过下调Eca109细胞中mi R-21表达阻碍Eca109细胞增殖、促进细胞凋亡和减慢细胞周期,最终导致ESCC细胞生长抑制。     

MEF2A基因突变对血管平滑肌细胞增殖迁移及其表型的影响

目的:观察肌细胞增强因子2A(MEF2A)基因突变对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖迁移及其表型的影响。方法:分别将野生型(WT)MEF2A质粒(WT组)、21个核苷酸缺失突变型(△21,显性负突变)MEF2A质粒(△21组)以及MEF2A siRNA(siRNA组)转染进人主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),通过溴化噻唑基蓝四唑(MTT)法和Millicell小室观察各组VSMC的增殖和迁移变化,免疫印迹(Western blotting)检测各组VSMC之间MEF2A蛋白、平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)、SM22α、骨桥蛋白和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路表达差异。结果:MEF2A△21组和MEF2A siRNA组的VSMC增殖增加,迁移数量增多;同时此两组中α-SM-actin和SM22α表达减少,骨桥蛋白表达增加;磷酸化p38和ERK1/2表达也明显增强。结论:MEF2A基因显性负突变及沉默可使VSMC向合成型转化,其增殖和迁移能力增加。而p38和ERK1/2MAPK信号通路可能参与MEF2A基因介导的血管平滑肌细胞表型转化。