牛睾丸支持细胞分离、纯化及体外生长行为的研究

了解牛睾丸支持细胞体外培养的生物学特性,试验采用组合酶消化和选择贴壁法,将5月龄、6月龄牛胎儿及新生牛睾丸支持细胞分离纯化后进行体外培养。试验结果显示,这一阶段牛睾丸适宜支持细胞分离纯化用;采用0.25 %胰蛋白酶+0.02 %EDTA二次消化法是一种经济有效的牛胎儿睾丸支持细胞分离方案;试验发现,牛胎儿睾丸支持细胞体外研究时间应控制在3天～20天内,处于对数生长期的牛胎儿睾丸支持细胞,对牛体外受精卵体外发育有明显的促进作用。     

小鼠睾丸支持细胞的生物学特性研究

目的:获得高纯度的小鼠支持细胞,用以研究睾丸支持细胞在诱导胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中的作用,同时借助睾丸支持细胞减少进行体内诱导试验时可能产生的免疫排斥反应。方法:用胶原酶和胰蛋白酶组合消化结合选择性贴壁法从1周龄昆明白小鼠睾丸分离获得睾丸支持细胞,纯化后进行体外培养,观察其体外培养的生物学特性。结果:睾丸支持细胞体外培养3～4h即贴壁,贴壁后伸出3～4个突起,为成纤维型细胞,在体外培养2～3d即长满全瓶。油红Ο染色显示,其胞质含有大量脂滴。透射电镜观察结果表明,支持细胞核仁周围有卫星核小体。RT-PCR结果显示获得的细胞表达缪勒管抑制物,不表达促黄体素受体和小鼠VASA同源物。结论:获得了较高纯度的小鼠睾丸支持细胞,可以用于诱导小鼠胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的体内和体外试验。     

鸡胚睾丸支持细胞的分离、纯化与鉴定

以18天鸡胚睾丸为实验材料,经胶原酶和胰蛋白酶两步酶消化法得到生精上皮细胞悬液.在原代培养过程中经差异贴壁和低渗处理后,获得了纯度约为90%的单层支持细胞.对纯化的培养物染色鉴定,结果显示支持细胞为碱性磷酸酶(AKP)阴性,而混杂在其中的另一种体细胞管周细胞为AKP阳性;油红O染色显示,支持细胞胞质内含有大量的脂肪滴,核内见双极小体;吖啶橙染色证实支持细胞富含RNA;罗丹明123染色显示支持细胞富含线粒体;Hoechst 33342染色显示支持细胞细胞核呈长卵圆形,核的长轴与细胞长轴平行;免疫荧光染色显示支持细胞胞质中表达波形蛋白.建立了一套简单、易行的鸡胚睾丸支持细胞分离纯化与鉴定方法.     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果 0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显;DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

猫骨髓间充质干细胞的体外分离培养、纯化、鉴定

目的:分离、培养、纯化家猫的骨髓间充质干细胞,并对获得细胞的表面标志物进行鉴定,为进一步利用骨髓间充质干细胞的细胞移植实验奠定基础。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化家猫骨髓间充质干细胞,通过多次更换培养液获得较纯化的骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下对细胞形态进行观察;根据第1、3、5、7、9代细胞的镜下增殖情况绘制出生长曲线;通过流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD34、CD44和CD90的表达率。结果:在倒置相差显微镜下观察,分离培养的骨髓间充质干细胞贴壁呈梭形或纺锤形;原代细胞生长丛集成片,5~7 d达到融合,进行传代;培养到第三代以后,细胞出现相对均匀的梭形扁平外观,迅速增殖的细胞呈涡流样排列;第3、5代骨髓间充质干细胞增殖能力强于第7、9代;采用流式细胞仪分析结果显示细胞的CD34、CD44和CD90阳性率分别为17.5%、97.9%和91%,这与骨髓间充质干细胞表面抗原的表达一致。结论:分离培养的细胞具有骨髓间充质干细胞特性,成分相对单一,第3、5代细胞纯度高,增殖能力强,适用于进一步的实验研究。     

胰酶对皮肤角质细胞分离和传代的影响

考察不同的胰酶浓度及其作用时间对角质细胞分离和传代的影响。实验发现在胰酶浓度 0.25%时作用5min可获得的总活细胞量和有克隆形成能力的细胞量均优于其它培养条件 ;而在胰酶浓度0.05%时作用 5min可获得最大的原代角质细胞贴壁率。随着胰酶浓度的提高 ,传代角质细胞的贴壁率和贴壁速率常数以及克隆形成率均随之增加 ,因此在传代培养时使用 0.25%胰酶浓度进行消化较为适宜.     

两种精原干细胞高效能纯化方法的比较研究*

目的: 比较贴壁分离法和免疫磁珠法纯化小鼠精原干细胞(mSSCs) 的优缺点。方法: 分别选取10只12-15日龄的雄性C57BL/6小鼠,颈椎脱臼法处死,摘取睾丸用酶消化法获得曲细精管单细胞悬液,分别用贴壁分离法和免疫磁珠法从单细胞悬液中分离纯化mSSCs,并针对两种方法在细胞数量、分离效率以及对细胞增殖生长的影响等方面进行比较。结果: 两种纯化方法均可从小鼠曲细精管单细胞悬液中分离纯化得到干细胞,并可在体外培养后呈现出典型的精原干细胞特有的葡萄串状克隆,体外连续培养增殖超3个月。10只小鼠的睾丸经差异贴壁法纯化后可以得到3×10⁵±0.4×10⁵个mSSCs(n=5),细胞回收率(纯化后细胞数/曲细精管单细胞悬液细胞数)为1.5%±0.1%(n=5);经免疫磁珠法可以得到6×10⁵±0.4×10⁵个mSSCs(n=5),细胞回收率为3.0%±0.1%(n=5),免疫磁珠法得到的干细胞数量更高。差异贴壁法得到的干细胞更纯,因为体外培养5 d左右即得到干细胞集落,而免疫磁珠法得到的干细胞则约10 d才可以看到明显的细胞集落,但是两种纯化方法对细胞体外长期增殖生长没有明显的影响。结论: 两种方法均可以纯化得到高质量的mSSCs,,但两种方法各有优缺点。差异贴壁法较免疫磁珠法经济、实用,无需购买专门的设备和抗体磁珠,但获得的细胞数量相对较低,用时也较长。     

山羊精原干细胞的鉴定及培养体系优化的研究

该研究优化了山羊精原干细胞(goat spermatogonial stem cells,g SSCs)培养体系,使山羊精原干细胞能在体外长期培养,维持自我更新的能力并保持未分化状态。取3~5月龄山羊睾丸,采用两步酶消法结合差速贴壁方法得到山羊精原干细胞悬液,分别通过形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色、特异基因表达及蛋白质水平的分析对培养的细胞进行鉴定;并以山羊睾丸支持细胞(goat sertoli cells,g SCs)、小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和层黏连蛋白(laminin,L)为饲养层,观察饲养层对山羊精原干细胞体外增殖的影响。结果表明,山羊精原干细胞体外增殖形成克隆簇,AKP染色呈阳性。经RT-PCR检测,Oct-4、C-myc、Cyclin D1、Ngn3和TERT等干细胞特异基因均有表达。细胞免疫组化结果显示,Oct-4、SSEA-1、α6-integrin、Vasa和Thy-1蛋白质呈阳性。克隆簇统计显示,在山羊睾丸支持细胞上形成的山羊精原干细胞(goat spermatogonial stem cells,g SSCs)克隆数与其他两组比较差异显著(P0.05)。山羊睾丸支持细胞饲养层上的精原干细胞可在体外传3~4代,培养时间为2个月。结果证明,通过两步酶消法和差速贴壁法可以分离获得山羊精原干细胞,且山羊睾丸支持细胞能够促进g SSCs的增殖。     

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。     

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞（male germ stem cells, mGSCs）来源于原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs),且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到 95.8%。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示：SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明：20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干（embryonic stem, ES）细胞。     

成人胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定

目的:建立人胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定的方法.方法:胶原酶分次消化剪切的人胰腺组织,经过Ficoll密度梯度离心后去除胰岛组织,培养于含,10%胎牛血清的CMRL1066培养液中,7-10天可行成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取2-3代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、Insulin及Glucagon的表达.结果:经过胶原酶消化、Ficoll密度梯度离心及后续的培养,去除了胰岛组织及外分泌腺,可获得较纯化的鹅卵石样的胰腺导管细胞.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(87.5±6.2)%、(77.5±8.6)%和(50.9±9.5)%,而Insulin染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因,而未观察到Insulin及Glueagon基因的表达.结论:该方法可较好的分离纯化出人胰腺导管细胞,经鉴定获得细胞具有胰腺干细胞的特性.     

五指山猪近交系精原干细胞体外培养研究

对不同发育阶段五指山小型猪(WZSP)近交系的睾丸组织,采用不同的消化和培养方法进行了一系列的探索、研究。实验显示培养SSCs的最佳时限为仔猪出生后1~20日龄;对不同日龄仔猪采用不同消化方法,以DMEM为基础培养液并添加不同成分,34℃,5%CO2培养箱中饱和湿度条件下培养,可获得较好的分离培养结果;原代SSCs在培养8d后,SSCs开始增殖,桑椹状的SSCs集落半悬浮隆突生长;SSCs集落AKP染色,细胞呈阳性反应;对SSCs细胞团在STO饲养层上进行传代培养,SSCs贴壁良好,培养4d左右大部分SSCs集落和单细胞消失;采用曲精细管组织贴壁培养法也同样获得桑椹状SSCs集落,细胞集落在培养5d后出现,半悬浮生长。此外,睾丸组织在4℃PBS液中存放24h后,仍可作为SSCs分离、培养的材料。结果表明本研究初步掌握了WZSP近交系精原干细胞体外分离、培养的技术方法,为其进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性

目的:建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法,并探索其生物学特性。方法:取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤,配制2种血清的细胞培养液,采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养,通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度;通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。结果:背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7 d无细胞游出,CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少;经组织块贴壁法细胞生长慢,培养周期长;酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。尾尖取材量少,得到细胞少;耳部皮肤取材方便,但细胞纯度低。CCK8增殖曲线呈S型;相较于对照组,UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。结论:CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案,可增加细胞得量、缩短培养周期,降低成本。     

体外人表皮细胞对胰蛋白酶耐受的探讨

目的:观察人表皮细胞对胰酶消化的耐受能力,通过不同细胞恢复贴壁时间不同来探索分离和纯化表皮细胞的新方法,并探讨胰酶耐受细胞的干性表达,及其与muse细胞的可能相关性。方法:中性蛋白酶及胰酶消化获取表皮细胞,用0.25%的胰酶悬浮表皮细胞,以3.0×105/m L的细胞密度种植于12孔板,每间隔半小时或1小时终止胰酶1孔,其中胰酶作用时间最长达46小时。记录不同细胞贴壁时间、生长状态,并在接种后第7天,对贴壁细胞进行Nestin、Sox10抗体免疫细胞化学染色。结果:随着胰酶作用时间的延长,贴壁细胞数目递减,细胞贴壁所用时间也延长。所有孔中最早出现的贴壁细胞为树突状细胞,这些细胞开始生长缓慢,大约4天后生长迅速,10天后部分孔出现鱼群样细胞团。部分孔经Nestin、SOX10抗体的免疫细胞化学染色结果均为阳性,其中以Nestin抗体较明显。结论:人表皮细胞对胰酶消化的耐受能达46小时,从形态学观察判断,黑素细胞贴壁早于角质形成细胞,大多数贴壁后细胞增殖力强,干细胞表面标记显示部分阳性。     

RA滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的:改良体外分离、培养类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的方法,并进行鉴定。方法:取关节镜手术中获得RA患者滑膜组织进行机械分离、胶原酶消化后直接将所有消化产物置于细胞培养皿两次贴壁培养,差速消化法纯化成纤维细胞,倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞术及免疫细胞化学的方法鉴定细胞纯度。结果:胶原酶消化后直接贴壁结合差速消化纯化法分离获得的原代滑膜细胞中呈梭形的成纤维样细胞占98%以上,细胞核呈椭圆形位于细胞中央,偶见少量圆形的滑膜巨噬细胞。流式细胞术显示98%以上的滑膜细胞具有vimeintin+CD68的成纤维细胞特征。免疫细胞化学提示滑膜细胞vimentin表达阳性、CD68不表达。结论:成功分离获得了纯度和活性很高的人滑膜成纤维样细胞,方法更简便,效率更高,为后续类风湿性关节炎滑膜侵袭机制的研究奠定了基础。     

小鼠脂肪来源干细胞体外培养、诱导分化及鉴定

目的:观察C57小鼠ASCs (Adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的生物学特性,探讨其成脂成骨诱导分化能力.方法:无菌条件下切取C57小鼠腹股沟处脂肪组织,0.25％Ⅰ型胶原酶消化,分离培养ASCs,37℃,5％CO2饱和湿度孵箱培养,细胞融合达80％时消化传代.观察其细胞形态;MTT比色法测细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第2代细胞行成骨及成脂诱导培养,3周后分别茜素红染色和油红O染色鉴定.结果:从C57小鼠脂肪组织中分离获取的ASCs呈长梭形,成纤维细胞样.细胞生长曲线呈“S”型,证明ASCs具有很强的增殖能力;流式细胞术分析结果:CD29、CD44、CD90阳性表达,CD31、CD34、CD45阴性表达;成骨诱导后茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性.结论:本试验分离培养的细胞为ASCs,具有确切分化能力.     

成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。     

实验兔骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

探讨建立兔骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为BMSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。首先抽取兔髂骨骨髓,采用Percoll密度梯度离心法得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置相差显微镜观察细胞生长状态,细胞免疫组化检测CD73、CD34。结果表明,成功建立了兔BMSCs体外分离及培养扩增的方法,发现BMSCs表现贴壁生长,P0代时呈集落生长,细胞呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,形态开始多样化;细胞免疫组化显示BMSCs表达CD73,未表达CD34,反复传代后CD73表达效率增高。上述研究表明,Percoll密度梯度离心联合骨髓贴壁法,能有效分离、纯化和扩增BMSCs,提取的细胞具有BMSCs的生长特性和抗原表型,其中P3~P6代细胞增殖能力强,可用于进一步的研究工作。     

大鼠少突胶质前体细胞(OPCs)纯化培养及糖氧剥夺(OGD)模型的建立

目的建立大鼠脑少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分离纯化培养及糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型。方法出生3d内的SD大鼠乳鼠取脑,经胰蛋白酶消化法培养混合胶质细胞,混合培养10d后,震摇及差速贴壁法分离纯化OPCs,纯化培养3d后鉴定、诱导分化OPCs为少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)及进一步OGD干预。免疫荧光法鉴定OPCs纯度及分化为OL的能力;MTT法检测OGD(37℃,1%O2,5%CO2)干预0.5h、1h、2h及4h时细胞活力改变,Edu染色检测细胞增殖情况。结果免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95%以上表达NG2+A2B5,且可分化为MBP阳性的OL。OGD 2h时,MTT显示细胞活力明显下降,Ed U染色阳性率明显降低。结论震摇及差速贴壁法可获得高纯度的OPCs,且细胞具有分化为OL的能力。2h可作为OPCs OGD模型缺血缺氧损伤合适时间。     

大鼠精原干细胞的高效分离和纯化方法

精原干细胞是精子发生的基础,是永久分化成精子的克隆源,它既可以自我更新维持体内干细胞的数量,又可以增殖分化形成各阶段的生精细胞直至成熟精子。本文以22～25日龄Wistar-Iamichi大鼠为研究对象,利用两步酶消化法分离得到睾丸曲细精管细胞悬液,根据精原干细胞与曲细精管细胞悬液中体细胞(支持细胞及少量的管周细胞)及各级分化的生精细胞贴壁能力及对细胞外基质粘附力的不同,将大鼠精原干细胞进行纯化。经纯化后,5只大鼠的睾丸可以得到约3×10~5个精原干细胞,该精原干细胞在体外培养可形成克隆,并且该克隆可表达精原干细胞特异的标记基因GFRα1和CDH1。本文所介绍的高效分离和纯化大鼠精原干细胞的方法,操作简便,且得到的精原干细胞具有很高的活力和增殖能力,该方法为今后大鼠精原干细胞的长期培养及操作研究奠定了基础。