红花花青素合成酶基因的克隆及表达分析

根据红花转录物测序结果中得到的中间序列,采用R11-PCR和RACE方法从红花花瓣中克隆到1个4嬲基因的全长cDNA,该基因全长序列1226bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1050bp,编码349个氨基酸。生物信息学软件分析显示,该基因编码的蛋白理论分子量约为82．27kDa,等电点为5．09,序列里含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly（A）。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的ANS蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2．0-酮戊二酸结合位点。结合其他物种的臌因构建系统树表日月,红花ANS蛋基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与芍药的亲缘关系最近。应用实时荧光定量PCR分析表明,ANS基因在红花的初花期和盛花期的表达量最高。     

红花CHS基因的过表达提高了拟南芥黄酮含量

该研究旨在获得红花查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因全长片段,并在拟南芥中进行过表达,初步验证该基因的功能根据红花转录物测序结果中获得的中间序列,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplifi cation of cDNA ends,RACE)方法从红花花瓣中克隆到1个CHS基因的全长cDNA,命名为Ct CHS1,全长序列1 360 bp。生物信息学分析表明,该基因具有完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),共1 113 bp,编码370个氨基酸。亚细胞定位预测结果显示,该基因编码的蛋白质定位于细胞质。结合其他物种的CHS基因构建系统树表明,Ct CHS1具有高度保守性,其与水母雪莲花的亲缘关系最近。荧光定量PCR(Real-time PCR)分析表明,Ct CHS1基因在吉红油姊妹系的衰落期和吉红一号的盛花期表达量最高。该研究成功构建了含有Ct CHS1基因的植物表达载体,并在拟南芥中进行过表达,获得了高黄酮含量的转基因拟南芥T2株系。结果表明,过表达红花CHS基因可以提高拟南芥中的黄酮含量,为后续该基因的功能验证奠定基础。     

南蛇藤假种皮形成过程中萜类合成基因的表达分析

为探究南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）假种皮发育过程中萜类物质合成相关基因的表达差异,本文选取3个不同发育时期（盛花期、落花期和幼果期）的南蛇藤雌花为实验材料,构建3个cDNA文库,通过Illumina HiSeq^TM 2000平台进行转录组测序,共获得87600个unigene序列,平均长度为453bp,N50/N90比值为4.64。通过3个不同发育阶段基因差异表达的比较及功能富集分析,鉴定出16个萜类合成相关基因,其中8个基因的编码蛋白参与调控7个萜类合成代谢位点。还确定了与萜类合成相关的7个转录因子家族的成员数量以及相对表达量最高的基因。     

初花期和盛花期的桂花比较转录组分析

桂花开放期间色泽和香味均发生明显变化,目前对于其内在的分子机制尚不清楚。本研究以四季桂"金玉台阁"为实验材料,对初花期和盛花期桂花花朵进行转录组测序。去除低质量数据后,初花期桂花文库得到6 342万条Clean reads,盛花期桂花文库得到4 941万条Clean reads,经de novo组装后共得到113 292条Unigenes,平均长度为775 bp。在设定阈值下(|log2 Ratio|≥1且FDR≤0.05),有1 381个Unigenes上调表达,464个Unigenes下调表达。Gene Ontology (GO)分析显示有47个GO类别被显著富集;KEGG分析显示有24代谢通路显著富集,涉及植物激素与信号传导、类胡萝卜素生物合成、萜类生物合成、苯丙氨酸代谢、淀粉与蔗糖代谢等代谢过程。此外,还在转录组数据中鉴定到9个类胡萝卜素合成基因和3个香味形成基因,大部分基因在盛花期的表达量要高于初花期。本研究有助于桂花花色和香味形成关键基因的挖掘,且对今后桂花遗传改良育种有一定的指导意义。     

基于转录组挖掘‘云香’水仙萜类合成基因及NaIDI的克隆

为深入挖掘中国水仙转录组中萜类合成相关基因,了解中国水仙萜类代谢途径和分子调控机制,该研究以‘云香’水仙为材料,在其盛花期花瓣与副冠转录组测序的基础上,筛选已注释的萜类合成途径基因并利用NCBI blastn进行再注释,通过对部分候选基因的表达量与生物信息分析进一步筛选出代表基因,采用RT PCR技术克隆了水仙异戊烯基焦磷酸异构酶基因NaIDI,并对其蛋白序列与特异性表达进行分析。结果表明：(1)Blast比对筛选得到52 个与萜类合成上游途径相关的Unigenes,二次筛选获得11个显著差异表达的代表基因。(2)NaIDI基因开放阅读框(ORF)长度为858 bp,编码285个氨基酸,其氨基酸序列与‘金盏银台’水仙相似度97.19%;亚细胞定位预测显示该基因定位在叶绿体;系统进化分析表明其与芦笋亲缘关系比较近。(3)实时荧光定量分析结果表明,NaIDI基因在水仙开花的不同时期和不同组织器官中差异表达显著,且在盛花期时副冠中的表达量最高,与中国水仙挥发性萜类化合物在开花不同时期和不同组织器官中的表达规律一致,表明NaIDI在萜类代谢中发挥着一定作用。     

锥栗种仁转录组及淀粉和蔗糖代谢相关酶基因的表达分析

本研究采用高通量测序技术对淀粉积累高峰期的锥栗种仁进行转录组测序分析,对得到的Unigene进行功能注释、分类及代谢通路分析,并进一步通过实时定量PCR方法分析了7个与淀粉和蔗糖代谢相关酶基因在锥栗种仁发育过程中的表达特征。结果显示:de novo组装后共获得53629条Unigene序列,序列平均长度为746 bp;通过与其他核酸、蛋白质数据库的Blast搜索比对,共26739条Unigene序列获得基因注释,占All-Unigene的49.86%;与COG数据库比对后将其注释的14413条Unigene序列划分成25类;GO功能注释的33926条Unigene基因共分成细胞组分、分子功能和生物过程3大类58个分支;与KEGG数据库比对结果注释的5277条Unigene序列划分为116条代谢通路;7个与淀粉和蔗糖代谢相关酶基因表达量变化趋势中,CH.29636(淀粉合成酶,SS),CH.11971(淀粉分支酶,SBE)两个基因随着种仁的发育呈现逐渐上升的趋势,而其余5个基因(CH.31302、CH.33690、CH.19238、CH.30128、CH.13088)表达量随着种仁的发育呈先上升后下降的趋势,该结果与锥栗种仁发育期淀粉和蔗糖的变化规律一致。这些信息为锥栗果实品质形成相关功能基因的研究提供了重要依据。     

松树蜂毒腺转录组分析

【目的】构建入侵种松树蜂Sirex noctilio毒腺转录组数据库,筛选并分析松树蜂毒腺基因数据。【方法】采用新一代高通量测序平台Illumina HiSeq^TM 4000对松树蜂雌成虫毒腺进行转录组测序、数据组装和生物信息学分析。【结果】共获得12.7 Gb松树蜂雌成虫毒腺有效转录组数据,并组装到37 098条unigenes,平均长度968 bp,N50长度为2 364 bp。将所得的unigenes数据使用BlastX与各大数据库比对,共注释到13 515条unigenes,并且在NR数据库中注释的unigenes最多,共11 108条(占总数的29.94%),其中相似基因占比最高的物种为丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis,达815条(占总数的7.29%)。在GO数据库中注释到5 726条unigenes,根据功能被分为生物学进程、细胞组分和分子功能3大类63个亚类。KEGG代谢通路分析表明,7 602条unigenes注释到357个代谢通路。根据基因注释信息进一步筛选到43条嗅觉相关基因,包括嗅觉受体(odorant receptor, Or)基因25条、化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)基因10条、离子型受体(ionotropic receptor, IR)基因5条和气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因3条。此外,还筛选出11条漆酶基因,包括漆酶1(laccase1, LAC1)基因5条、漆酶2(laccase2, LAC2)基因4条、漆酶4(laccase4, LAC4)基因1条和漆酶9(laccase9, LAC9)基因1条,且其中1条LAC2基因在所有被注释的基因中表达量最高(FPKM值=21 126)。【结论】本研究获得的松树蜂毒腺转录组数据为松树蜂毒液组分的鉴定和生物学功能的研究奠定了一定的理论基础。     

草地贪夜蛾雄性成虫和5龄幼虫的转录组比较分析

【目的】草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是一种新近入侵我国的重要害虫。本研究旨在对草地贪夜蛾雄性成虫和5龄幼虫两个不同发育阶段的转录组进行比较分析。【方法】利用高通量测序技术对草地贪夜蛾雄性成虫和5龄幼虫进行转录组测序和数据组装,并对转录组数据进行功能注释和比较分析。【结果】经de novo组装共获得209 002条转录本,平均长度为687.55 bp,N50为982 bp。共有46 198条(57.43%) unigene在至少一个数据库中获得功能注释,其中1 713条(2.13%) unigene在所有数据库中均能获得注释。在GO数据库中获得205 269条unigene的注释,主要包括68个功能分类;在KEGG数据库中共有3 408条unigene得到注释,涉及277个代谢通路。共鉴定到424个嗅觉相关的基因,并且在雄性成虫和5龄幼虫之间的表达存在差异。通过比较转录组分析,在雄性成虫中鉴定到9 162个上调和6 399个下调差异表达基因(DEGs);功能富集分析发现在上调DEGs中涉及信息素以及信号转导的代谢通路显著富集,而下调DEGs中涉及解毒相关的通路显著富集。【结论】这些转录组数据为探究草地贪夜蛾的生长发育、嗅觉相关功能基因以及候选分子靶标提供资源信息。     

粗柄独尾草不同器官蒽醌类成分的消长规律

采用高效液相色谱法对沙生类短命植物粗柄独尾草苗期、营养生长期、初花期、盛花期、果期各器官中大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素含量的消长规律进行了研究。结果表明:叶中,芦荟大黄素的含量在苗期和初花期都较高,在盛花期时最低;大黄酸的含量在苗期最高,盛花期时最低;大黄素的含量在苗期达到最高,初花期和盛花期最低;大黄酚的含量也以苗期最高,盛花期和果期最低。且在初花期时,4种蒽醌类物质含量均呈现明显的叶先端>叶中部>叶基部的空间差异性。根中,芦荟大黄素的含量在苗期和营养生长期较高,而以盛花期和果期较低;大黄酸的含量在果期最高,其余时期差异不显著;大黄素的含量以苗期和初花期较高;大黄酚的含量在果期达最高,而盛花期时最低。同时期的根叶蒽醌含量相比,叶中的芦荟大黄素要高于根,而根中大黄酚含量要高于叶。同时期各器官蒽醌总量相比:叶>根>花>花葶。故若选取粗柄独尾草作为蒽醌类药材利用,建议最佳采集方式为采集初花期的叶先端部分。     

叶子花花瓣状苞片和叶片的比较转录组学研究

叶子花(Bougainvillea spectabilis Willd.)的苞片色彩鲜艳,呈花瓣状,在景观园艺和环境美化有着广泛应用。为了进一步了解花瓣状苞片的演化机制,该研究采用RNA-seq技术分别对苞片和叶片进行测序,比较苞片和叶片在基因表达水平的差异。最终获得54.48 M对长度为150bp的双向clean reads,从头拼接出55 782条Unigenes,平均长度为1 003.79bp,N50为1 402bp。共有30 874条Unigenes能被注释到公共数据库,其中有12 631条Unigenes能被注释到基因本体。差异化表达分析确定苞片和叶片差异表达的基因共有456个。该研究分别对不同组织差异表达的基因进行GO富集分析和KEGG富集分析,结果表明,在苞片中高表达的差异化基因有黄酮类合成相关的基因,花色合成关键酶多巴双加氧酶(DODA)以及发现与花瓣发育相关的基因,在叶片中高表达的差异化基因主要是参与光合作用。     

红花查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析

实验通过下载已报道查尔酮异构酶基因序列,设计简并引物,利用RACE克隆红花查尔酮异构酶基因全长,克隆了两个红花查尔酮异构酶基因,分别命名为CtCHI1和CtCHI2,NCBI登录号分别为MF996507和MF996508。用在线软件对序列进行分析,并用MEGA进行进化树分析,CtCHI1全长967 bp,CtCHI2全长997bp,属查尔酮异构酶家族基因。定量PCR分析红花查尔酮异构酶基因表达得出,CtCHI1在花中且在时期2表达量较高,而在叶、茎及根中不表达,CtCHI2仅在茎中有少量表达。实验还发现,MeJA显著促进CtCHI1基因的表达,而对CtCHI2无调控作用,推测CtCHI1参与红花花中类黄酮的生物合成。实验成功克隆了两个查尔酮异构酶基因并对其进行表达分析,为红花类黄酮的生物合成及调控机理研究奠定基础。     

黑果枸杞果实成熟发育过程表达谱差异分析

对黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)3个不同发育时期的果实进行转录组测序,分析对比黑果枸杞果实不同发育时期相关基因表达谱的变化。提取果实RNA进行Illumina高通量测序,利用GO、KEGG等公共数据库进行功能注释、分类,利用数字基因表达谱技术对比分析。结果显示,KEGG pathway富集分析表明亮氨酸生物合成途径在变色期对比青果期有7个差异表达基因,黑熟期对比变色期有35个差异表达基因,且全部为上调表达。在糖酵解途径中3个不可逆的反应步骤限速酶基因在黑熟期均为上调表达。对黑果枸杞亮氨酸合成和糖酵解涉及到的基因进行了功能和代谢通路的分析,为黑果枸杞种质资源探索提供理论基础。     

基于高通量测序的阿尔泰蝠蛾(鳞翅目:蝙蝠蛾科)幼虫转录组分析

本研究采用Illumina HiSeq TM 2500测序平台对阿尔泰蝠蛾Hepialus altaicola Wang幼虫进行转录组测序及生物信息学分析.经序列拼接后共获得100133个Unigenes,总长度86319112 bp,平均长度862 bp,N50长度1628 bp.将Unigenes与NR、COG/KOG、Pfam、Swiss-Prot、GO、KEGG数据库比对,共获得38198条Unigenes,其中Nr数据库注释的Unigenes最多,为32381条,占32.34％.通过GO功能分类,共有13216个Unigenes在GO数据库中细胞组分、分子功能和生物学过程等3大类57个分支中找到注释;KEGG通路分析,共有15058条Unigenes被注释,归属于305条代谢通路.CDS预测发现54002条序列可被编码,占全部基因的53.93％.基因注释进一步获得311个与冷适应相关的代谢调节基因,并用FPKM值对基因表达量进行评估.本研究获得的转录组信息及分析结果,为进一步研究阿尔泰蝠蛾的基因功能及低温生态适应性奠定分子基础.     

RNA-Seq探索低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌机制

为了探索低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌机制,本研究采用Illumina HiSeq 4000高通量转录组测序技术对低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌(P10748 MIC:8 mg/L)和利奈唑胺敏感粪肠球菌(3138 MIC:2 mg/L)进行测序及生物信息学分析,以标准菌株ATCC29212作为质量评估参考。利用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行注释与富集分析,并利用荧光定量PCR对测序中的差异表达基因进行验证。结果显示,测序共获得了3.57 Gb有效数据,通过De novo拼接获得1 920条unigenes,总长度为2 122 210 bp,平均长度为1 105 bp。差异基因模式聚类分析显示共有150个显著性差异表达基因(FDR≤0.001,|log2 Ratio|≥1),其中141个上调,9个下调。其中生物膜形成和外排泵相关基因esp、optrA、fexA在耐药菌中显著上调。GO功能注释结果显示,催化活性、代谢过程和细胞是注释最多的条目;Pathway富集分析发现,肽聚糖生物合成、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸的降解和硫代谢为显著性富集通路(p<0.05)。荧光定量PCR结果与测序结果基本一致。推测膜转运蛋白和生物膜形成可能在耐药机制中具有重要作用,为低水平利奈唑胺耐药肠球菌机制提供了可参考的耐药靶标。     

基于RNA-seq的能源植物芒转录组分析

芒(Miscanthus sinensis Anderss)是多年生C4草本植物,可为能量和纤维素产品生产提供高品质的木质纤维素材料,是一种理想的能源植物。采用Illumina Hi Seq?2000高通量测序技术,对芒花芽和叶芽进行转录组分析。经拼接组装共获得98 326个Unigene,序列平均长度822 bp,N50为1 337 bp。将Unigene序列与NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、GO和COG数据库进行比对(Evalue1e-5),共有74 134条Unigene获得了基因注释,占总Unigene的75.40%。其中,通过GO功能分类,45 507个Unigene映射到GO不同的功能节点上;通过KEGG pathways分析,共有36 710个Unigene参与了128个代谢通路;比对到同源序列比例最高的物种分别为高粱(37 731,60.86%)、玉米(16 258,26.22%)、水稻(3 065,4.94%),共占所有同源序列的92.02%。此外,获得了芒C4关键酶相关基因24个。这些注释信息的完成为芒功能基因及相关候选基因的发掘提供了重要依据。     

与草菇原基形成相关的过氧化物酶基因VvDyP的结构与表达分析

DyP-type过氧化物酶作为氧化物酶家族中的一员,参与了菌体氧化应激调节反应以及基质降解等过程。本研究从草菇基因组中获得一个DyP-type 过氧化物酶的编码基因,将其命名为VvDyP。对该基因进行结构分析,结果显示草菇的DyP-type 过氧化物酶编码基因全长为 2 333bp,含有8个外显子,7个内含子;开放阅读框长为1 485bp,编码494个氨基酸。通过系统发育分析发现它与灰盖鬼伞以及糙皮侧耳DyP蛋白同源性最高;分析DyP-type 过氧化物酶编码基因在草菇各个时期的表达谱情况并进行荧光定量PCR实验验证发现,草菇的DyP-type过氧化物酶编码基因只在原基中高表达,推测DyP-type过氧化物酶编码基因可以清除过量的活性氧自由基以保证原基的正常形成。     

滇水金凤花距发育相关基因GRF的克隆及表达分析

采用RT-PCR技术对滇水金凤(Impatiens uliginosa Franch.)GRF基因进行克隆,对其编码蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析,并利用qRT-PCR方法分析GRF基因的时空表达模式。结果显示,从滇水金凤中成功获得两个GRF基因,其cDNA全长分别为1137和903 bp,分别编码378和300 aa,分别命名为IuGRF1和IuGRF2,二者均具有QLQ和WRC结构域。除了保守区域外,滇水金凤GRF基因编码产物序列与其他物种的同源性较低。系统进化分析结果表明,IuGRF1和IuGRF2分别位于两个不同的进化分支。基因表达分析发现,IuGRF1在花苞期和盛花期距部表达量最高,而在檐部的表达随花距的发育逐渐降低。IuGRF2在花苞期檐部表达量最高,随着花距的发育逐渐降低。此外,IuGRF1和IuGRF2基因均在始花期花距弯部表达量最高,且随着花距的发育,在尖部和弯部的表达量逐渐降低,而在基部的表达量逐渐升高。推测滇水金凤的两个基因为同源基因,IuGRF1主要参与花距距部的生长和发育,而IuGRF2主要参与檐部的生长和发育。     

烟草脉斑驳病毒侵染本氏烟的转录组研究

为了研究烟草脉斑驳病毒（TVMV）侵染本氏烟的抗病分子机制,本文建立了TVMV转录组数据库,挖掘抗病相关基因以及代谢和信号通路,采用Illumina Novaseq 6000高通量测序平台对侵染TVMV的本氏烟进行转录组测序,并进行生物信息学分析;利用R package:edge R等软件分析了有关抗病的差异表达基因,对差异表达基因进行基因本体论（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）基于途径的通路富集分析。基于TVMV侵染本氏烟转录组的测序结果中共获得4 593个差异表达基因,其中3 564个基因上调表达,1 029个基因下调表达。共筛选出10个抗病相关的差异表达显著基因,6个上调,4个下调。GO数据库中注释到生物学过程、细胞组分及分子功能等三大类共50个功能组。其中,在第三大类分子功能中,蛋白质结合功能以及ATP结合功能所涉及的差异表达基因最显著,分别为501个和453个差异基因。KEGG共富集20条通路,注释到核糖体途径的差异基因富集程度最高,基因最显著,差异表达基因数为307个。蛋白质结合、ATP结合、核糖体、真核生物核糖体的生物反应、DNA复制（DNA replicat...     

红花microRNAs靶基因的生物信息学预测

miRNA是一类动、植物细胞中负责转录后调控的非编码RNA,植物的miRNA通常来源于具有茎环结构的单链RNA前体上,加工成熟后同ARGONAUTE转变成蛋白复合体结构,通过结合并沉默蛋白合成模板的方式关闭完整的基因表达网络。由于miRNA存在组织表达的特异性,且miRNA在植物中的表达高度保守。通过高通量测序获得的红花(Carthamus tinctorious L.)miRNA序列信息与红花转录EST数据库比对,通过靶基因预测筛选,对属于104个家族的173个红花miRNA进行预测,其中得到109个miRNAs对应调控的385个红花靶基因。并且通过Nr基因注释表明多数红花miRNA的靶基因编码包括调控细胞生长发育、信号转导及新陈代谢等相关的功能蛋白。     

vv-2ogo,一个在草菇原基中高表达的基因

本研究结合草菇子实体不同生长时期的表达谱数据及荧光定量PCR分析结果,获得一个在原基高表达的基因,推测它与草菇原基时期子实体的生长分化有关。基因组注释结果显示它是一个编码2-OG依赖性氧合酶(2-oxoglutarate dependent oxygenases)的基因,系统发育分析也支持基因注释的结果,该基因被我们命名为vv-2ogo。转录组Reads定位结果表明,该基因全长1 451 bp,含有3个外显子,2个内含子,编码440个氨基酸,其中第二个内含子在RNA加工过程中有保留现象。