体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的研究

肝脏是体内最重要、最复杂的器官之一,是机体物质代谢的核心,具有生物分化和免疫等重要功能;同时,肝脏也是一个极易受损伤的器官,病毒、肿瘤等会导致肝脏功能的缺损甚至累及生命;而随着肝移植技术的发展,肝细胞移植有望成为治疗肝功能衰竭的一种新方法。干细胞是一类具有自我更新、增殖和分化能力,特别是具有向肝脏干细胞、肝细胞及血管内皮细胞分化潜能的一类细胞,因而干细胞有望成为肝组织工程新的种子细胞来源。因此,本文对骨髓间充质干细胞的分离、培养,定向诱导肝细胞的影响因素以及应用前景等几方面的内容进行了总结。     

生长因子对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stemcell,BMSC)是骨髓基质细胞的重要组成部分,由于其不但能与其他细胞一起支持造血干细胞造血,而且还具有较强的增殖功能及多向分化潜能,在一定诱导因素下可定向分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等,近年来已成为生物学和医学的研究热点。本文简要介绍了不同生长因子如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等对BMSC增殖、分化的影响。     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头无菌性坏死的临床观察

目的:观察自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头无菌性坏死的临床效果及安全性.方法:对2012年9月至2013年1月期间在我院骨科住院治疗的55例患者随机分成两组,对照组接受常规治疗,治疗组接受自体骨髓间充质干细胞移植治疗治疗.结果:治疗组的临床疗效优于对照组,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);治疗组治疗后的DSA检查结果与对照相比,差异有统计学意义(P＜0.05);两组不良反应相互比较,无统计学意义(P＞0.05).结论:自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头无菌性坏死效果显著,优于常规治疗.     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究

无论是在体外实验、还是在体内实验,MSCs都可以向中枢神经系统(CNS)神经细胞分化,但争议颇多。因为功能性神经元不仅要具有典型神经元的形态、特异性标记,还要求具有可兴奋性、能和其他神经元形成突触联系、产生突触电位等,所以对于骨髓间充质干细胞是否能诱导出真正具有功能的神经元存在很大分歧。在此对MSCs向神经细胞诱导分化研究的现况、存在的问题及发展前景给以综述。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的研究

通过体外诱导人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向多巴胺(dopamine, DA)神经元分化,探讨人BMSCs来源的DA神经元的功能特征及其分化机制,为临床上细胞移植替代治疗诸如帕金森氏病(parkinson's disease, PD)等神经精神性疾病提供一种理想的细胞来源。通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs。50μmol/L脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophy factor, BDNF),10μmol/L forskolin(FSK)和10μmol/L DA联合对BMSCs进行诱导。电子显微镜观察诱导2周后细胞是否具有神经元的超微结构特点;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测DA神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH）的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3和Lmx1b的表达;高效液相色谱（high performance liquid chromatogram, HPLC）检测诱导2周后的细胞多巴胺的释放水平。 结果表明,诱导2周后,电镜下细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成。RT-PCR结果显示NSE(neuron specific enolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学染色结果表明诱导2周后TH阳性细胞(24.80±3.36）%的表达较诱导3d后(3.77±1.77)%明显提高(P<0.01）;HPLC检测到诱导2周后的细胞DA释放水平［(1.22±0.36)μg/mL(n＝6)］高于未经诱导的细胞［(0.75±0.22)μg/mL(n＝6) (t＝－2.79,P＝0.038)］。 由此得出,BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs向DA神经元分化,并具有DA神经元的功能特征,是临床用于治疗神经精神性疾病的理想细胞来源。     

不同强度静电磁场对体外培养骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响

本实验研究不同强度静电磁场对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化作用. 体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代后随机分为6组,分别用强度为0（对照组）、0.9、1.2、1.5、1.8和2.1 mT的静电磁场处理,每d每次处理30 min. 在磁场处理后的9~10 d ,骨髓间充质干细胞开始出现钙化小颗粒. 0.9 mT组抑制骨髓间充质干细胞增殖,1.5到2.1mT组促进骨髓间充质干细胞增殖. 在磁场处理后的12 d和15 d ,1.5和1.8 mT组极显著地增加了碱性磷酸酶(AKP)活性. 采用AKP组织化学染色和钙化结节染色对骨髓间充质干细胞成骨性分化进行鉴定,AKP组织化学染色和钙化结节染色都呈现了极强的阳性结果,尤以1.5 mT和1.8 mT阳性染色面积最大. 在SEMFs处理后的48 h 和96 h ,1.5 mT和1.8 mT组胶原I(collagen-Ⅰ)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2, Bmp-2) 基因表达水平显著高于对照组.在SEMFs处理后的12 d, BMP-2蛋白表达量高于对照组. 研究表明,0.9 mT 组抑制骨髓间充质干细胞增殖,1.5 mT到2.1 mT组不同强度静电磁场促进体外培养骨髓间充质干细胞的增殖. 磁场组能促进骨髓间充质干细胞成骨性分化,其中尤以1.5 mT和1.8 mT组促进大鼠骨髓间充质干细胞分化作用效果最为明显.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化的研究

通过体外诱导人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)向多巴胺(dopamine,DA)神经元分化,探讨人BMSCs来源的DA神经元的功能特征及其分化机制,为临床上细胞移植替代治疗诸如帕金森氏病(parkinson’sdisease,PD)等神经精神性疾病提供一种理想的细胞来源。通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs。50μmol/L脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophy factor,BDNF),10μmol/Lforskolin(FSK)和10μmol/LDA联合对BMSCs进行诱导。电子显微镜观察诱导2周后细胞是否具有神经元的超微结构特点;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测DA神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3和Lmx1b的表达;高效液相色谱(highperformance liquid chromatogram,HPLC)检测诱导2周后的细胞多巴胺的释放水平。结果表明,诱导2周后,电镜下细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成。RT-PCR结果显示NSE(neuron specificenolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学染色结果表明诱导2周后TH阳性细胞(24·80±3·36)%的表达较诱导3d后(3·77±1·77)%明显提高(P<0·01);HPLC检测到诱导2周后的细胞DA释放水平[(1·22±0·36)μg/mL(n=6)]高于未经诱导的细胞[(0·75±0·22)μg/mL(n=6)(t=-2·79,P=0·038)]。由此得出,BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs向DA神经元分化,并具有DA神经元的功能特征,是临床用于治疗神经精神性疾病的理想细胞来源。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞方向分化

探讨成纤维生长因子-2(FGF-2)在体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向肝细胞样细胞分化的作用及量化关系。体外分离培养大鼠BM-MSCs,将第3代BM-MSCs采用不同剂量的FGF-2诱导。诱导后,在显微镜下观察细胞形态学的改变;用免疫细胞化学法检测白蛋白和CK19的分泌;Shiff染色法检测糖原的分泌。诱导后BM-MSCs由梭形向多角形、卵圆形方向变化,白蛋白、CK19和糖原12 d即有阳性表达,以后随着诱导时间的延长阳性率逐渐升高。20 ng/mL FGF-2诱导比10 ng/mL FGF-2诱导细胞白蛋白、CK19和糖原的表达量均多。20 ng/mL FGF-2具有较强的诱导BM-MSCs向肝细胞样细胞分化的能力。     

表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的体外研究

目的:研究表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的可能性。方法:体外培养骨髓间充质干细胞,利用流式细胞仪分析其细胞表型。采用含EGF的培养液诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化,并利用免疫荧光法进行鉴定。结果:从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到神经干细胞标志物nestin、神经胶质细胞标志物GFAP和视网膜光感受器细胞标志物Rhodopsin呈阳性表达的细胞。结论:从骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。     

AcSDKP抑制体外培养条件下人骨髓间充质干细胞的增殖

N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,AcSDKP)是一种具有生理调控活性的四肽因子,对造血干/祖细胞增殖具有抑制作用。本研究采用集落形成实验、甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、细胞分裂指数测定等方法,考察了AcSDKP对体外培养的人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)增殖的影响。结果显示,在AcSDKP浓度为1×10-12mol／L-1×10-9mol／L的培养体系中,人骨髓MSC集落生成率和大小、活力细胞数和分裂指数均降低,最大效应浓度为1×10-11mol／L。以上实验结果表明,在体外培养条件下,一定浓度的AcSDKP对人骨髓MSC 的增殖具有抑制作用。     

骨髓间充质干细胞的多向分化潜能研究进展

骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cell,BMSSC)是成体干细胞中最受关注的细胞之一,它不仅在造血和免疫细胞发生发育中发挥重要作用,而且参与多种器官组织的再生和损伤修复,特别是近年来发现BMSSC具有向不同胚层来源细胞跨越分化(trans-differentiation)的可塑性,不仅有可能揭示细胞分化的新机制,而且为众多疾病的临床治疗提供了新思路。目前已揭示,BMSSC除了具有向成骨、软骨和脂肪细胞分化潜能外,还有向肝细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞和胰岛细胞等多向分化的潜能,本文就当前BMSSC的多向分化潜能研究进展作一综述。     

间充质干细胞体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化

研究间充质干细胞(MSC)能否在体外调控造血。体外分离培养人骨髓来源的MSC,RT-PCR检测其造血生长因子的表达,并以其为饲养层细胞,接种骨髓单个核细胞(MNC),观察生长情况,并通过形态学观察和流式细胞术分析,鉴定细胞来源和分化方向。结果显示,MSC构成性表达SCF、Flt3L和M-CSF,不表达C-CSF和GM-CSF,在骨髓MNC和MSC共培养体系中,大约2周左右可以看到大量的圆形细胞粘附在梭型MSC上生长,细胞胞体为圆形,胞浆较丰富,胞核为圆形、半月型或肾型,部分细胞呈典型的单核细胞形态,流式细胞术分析该类细胞表达CDl4,不表达CDl5、CD41、glycophorin A、CD5和CDl9。表明不需要添加外源性造血生长因子,间充质干细胞能在体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化,其定向分化可能与MSC分泌造血生长因子及MSC与造血细胞间相互作用有关。     

体外化学诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

为了探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养及化学诱导向心肌细胞分化的过程及条件,我们用1.073g/mL密度梯度离心法分离健康人骨髓单个核细胞,经骨髓间充质干细胞培养基传代培养后用流式细胞仪检测细胞表面抗原,在完全培养基中分别加入3、5、10μmol/L的5氮胞苷(每组n=5)进行化学诱导分化,阴性对照组采用完全培养基培养,诱导后21天细胞爬片免疫荧光法鉴定,透射电镜观察细胞超微结构。结果显示人MSCs为形态均一的梭形细胞,生长旺盛时呈旋涡样分布,流式细胞仪检测细胞表面CD44阳性,CD34、CD45阴性;5、10μmol/L的5氮胞苷进行化学诱导后细胞形态变长,诱导后14天时20%-30%细胞融合形成多核肌管样结构,3μmol/L组MSCs未出现肌管结构,诱导后21天5、10μmol/L组MSCs中desmin、心肌早期转录因子GATA4、心肌特异性cTnI及闰盘蛋白connexin43的表达阳性,10μmol/L组cTnI阳性染色细胞数目(65.3±4.7%)高于5μmol/L诱导组(48.2±5.4%)(p<0.05);3μmol/L组及阴性对照组无心肌特异性蛋白的表达。细胞诱导后28天透射电镜下可见肌丝形成。本实验说明,人MSCs在体外经化学诱导可分化为心肌样细胞,而且5-氮胞苷对于心肌相关蛋白的表达呈浓度依赖性正相关。     

体外化学诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

To investigate the potential of adult mesenchymal stem cells (hMSCs) derived from human bone marrow to undergo cardiomyogenic differentiation after exposure of 5-azacytidine in vitro. A small bone marrow aspirate was taken from the iliac crest of human volunteers, and hMSCs were isolated by 1.073 g/mL Percoll and cultured in the right cell culturing medium as previously described. The phonotypes of hMSCs were identified by flow cytometry. The stem cells were cultured in cell culture medium (as control) and medium mixed with 5-azacytidine (5-aza, 3, 5, 10 micromol/L) (n=5, respectively) for cellular differentiation. We examined respectively with immunohischemistry at 21 days of inducement on desmin, cardiac-specific cardiac troponin I (cTnI), GATA4 & connexin43. The ultrastructures of induced cells were examined by transmission electron microscope. The results indicated that the hMSCs showed a fibroblast-like morphology with vortex distribution in their peak propagation, and express high level of CD44 but negative for CD34 and CD45. 20%-30% cells grown after 5, 10 microl/L 5-aza treatment connected with adjoining cells and coalesced into myotube structures after 14 days. After 21 days of culturing, immunohistochemistry revealed expression of desmin, GATA4, cTnI and connexin43 in 5, 10 micromol/L showed positive, but no cardiac specific protein were found in neither 3 micromol/L nor in control group. The ratio of cTnI positive stained cells in 10 micromol/L group were higher than that in 5 micromol/L group (65.3+/-4.7% vs 48.2+/-5.4%, p<0.05). Electron microscopy revealed myofilaments were formed. The results indicated that purified hMSCs from adult bone marrow can be differentiated into cardiac-like muscle cells with 5-aza inducement in vitro and the differentiation is in line with the 5-aza concentration.     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞(mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,m UCMSCs)探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法通过贴壁培养法将m UCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的m UCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的m UCMSC,可见红色结节。结论贴壁培养法分离培养所获得的m UCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

中药诱导骨髓间充质干细胞多向分化研究进展

干细胞（stem cell）是指具有自我更新、高度增殖及多分化潜能的未分化细胞,它能产生出表型与基因型完全相同的子细胞,是机体其他细胞的起源。根据其发展阶段和来源不同,干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞

观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)植入体内后,在心肌微环境诱导下分化为心肌细胞的能力。无菌条件下取出大鼠双侧股骨及胫骨,冲洗骨髓腔获得细胞,贴壁筛选法纯化MSCs,体外培养、扩增,4,6-二咪基-4-联苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记细胞,注入结扎冠脉左前降支所致心肌梗塞模型鼠的心肌组织。在不同时间点处死大鼠,获取心肌组织,采用HE染色和电镜技术对植入MSCs进行形态学观察和超微结构检测,荧光免疫组化检测植入MSCs肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性抗原Cx43的表达,同时应用RT-PCR技术检测心脏早期发育基因NKx2．5、GATA-4的表达。结果发现细胞标记效率为100％,通过连续检测MSCs植入后细胞形态从无规则状态、幼稚细胞表型逐渐向成熟心肌细胞方向转化,植入细胞排列同正常肌纤维方向平行,且植入四周后电镜检测到闰盘的存在;两周出现MHC的表达,后随时间延长表达逐渐增强。四周出现Cx43的表达,以后表达稳定,RT-PCR检测NKx2．5、GATA-4在一天即出现弱表达,两周～三周时表达最强,以后强度逐渐减弱。结果表明MSCs在体内微环境条件下能够转化为心肌细胞。     

川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

为了探讨川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞的作用,以小鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,实验分为空白对照组、β-巯基乙醇（BME）阳性对照组和川芎嗪诱导组。采用荧光免疫化学和Western blot方法,分别检测神经干细胞巢蛋白（nestin）和经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达;RT-PCR检测诱导不同时间对神经细胞相关基因Nestin、NSE、β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和核受体相关因子-1（Nurr1）mRNA表达的影响。结果显示川芎嗪诱导间充质干细胞24 h后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞。细胞死亡率低于β-巯基乙醇诱导组。免疫荧光化学法和western blot结果显示：川芎嗪诱导后的细胞nes-tin和NSE蛋白表达呈阳性,且表达丰度显著高于β-巯基乙醇诱导组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl。结果表明川芎嗪能定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,是较理想的诱导剂。     

起搏基因体外调控骨髓间充质干细胞分化为类起搏细胞的研究

目的本研究旨在通过体外构建起搏基因质粒pIRES2-EGFP-HCN2,电穿孔转染骨髓间充质干细胞,检测其在体外的表达情况。方法对含mHCN2 cDNA的PTR载体进行转化和扩增,将所得mHCN2基因定向克隆到含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP中,进行双酶切来鉴定克隆的正确性。将重组质粒及空白质粒用电穿孔法转染骨髓间充质干细胞,并在体外与心肌细胞共培养,观察搏动频率变化及mHCN2的表达,并检测其电生理和组织学特征。结果构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2。荧光显微镜下可见转染后的骨髓间充质干细胞呈绿色荧光,细胞中mHCN2的阳性表达率为98.2%。免疫荧光显示转染起搏基因的骨髓间充质干细胞mHCN2的表达,而对照组无表达。实验组共培养的心肌细胞搏动频率较对照组干细胞共培养的明显增快(140±11次/分VS 100±13次/分,P0.05),动作电位显示实验组最大舒张期电位值小于对照组(-62±2mv VS-71±2mv,P0.05)。免疫荧光显示干细胞与心肌细胞间形成间隙连接。结论成功构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2,转染后的骨髓间充质干细胞可在体外成功表达功能性mH-CN2通道,提供起搏电流,具有类起搏细胞的功能,为进一步构建生物起搏器提供依据。     

诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

选用Wistar大鼠分离骨髓间充质干细胞作体外培养及鉴定其表达抗原CD44、CDw90;采用10μmol／L 5-氮胞苷诱导第1代的骨髓间充质干细胞,于诱导后2、4周进行免疫细胞化学反应检测α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T。证实体外培养的第1代骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞,为指导体外诱导的心肌细胞应用于。临床提供一定的理论依据和技术手段。