盐酸阿霉素增强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL抑制肝癌细胞生长的研究

盐酸阿霉素(DOX)作为一种抗肿瘤抗生素,通过抑制癌细胞遗传物质的合成,对多种肿瘤均有杀伤作用,然而,其单独作用疗效有限,且加大剂量时其副作用较强。目前,携带抗癌基因的溶瘤腺病毒在肿瘤治疗中的作用日渐显现,溶瘤腺病毒ZD55-Trail联合DOX治疗肝癌的研究鲜有报道。通过MTT和结晶紫染色试验检测DOX药物处理对肝癌细胞系Bel-7404存活率的变化情况;Hoechst33342染色和流式细胞术检测肝癌细胞的凋亡;Western blot检测Trail蛋白和凋亡相关蛋白的表达;免疫荧光和流式细胞术检测凋亡相关受体表达的情况。结果显示,ZD55-Trail与DOX联合使用能够有效抑制肝癌细胞增长并诱导其凋亡,并且联合处理能增加Trail受体DR4和DR5的表达。初步探讨了DOX与ZD55-Trail两者协同诱导肝癌细胞凋亡的机制,为利用ZD55-Trail与DOX联合治疗肝癌提供依据。     

溶瘤腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD联合阿霉素抑制肝癌细胞HepG2生长

目的:研究溶瘤腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD与阿霉素联合使用对肝癌细胞HepG2生长的影响。方法:MTT法检测经CD55-TRAIL-IETD-MnSOD与阿霉素联合处理后HepG2细胞生存率的变化,Hoechst33342染色及流式细胞术检测联合处理诱导细胞凋亡时细胞形态变化及凋亡细胞数量,Western印迹检测联合处理所引发的凋亡通路。结果:MTT实验显示,联合使用CD55-TRAIL-IETD-MnSOD和阿霉素能更有效地抑制HepG2细胞的生长,且阿霉素与CD55-TRAIL-IETD-MnSOD是协同作用;Hochest染色实验和流式细胞术实验结果均显示联合使用CD55-TRAIL-IETD-MnSOD和阿霉素增强了诱导细胞凋亡的作用;Western印迹表明CD55-TRAIL-IETD-MnSOD和阿霉素联合使用激活了Caspase细胞凋亡途径。结论:阿霉素能促进溶瘤腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD的复制,联合阿霉素和溶瘤腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD可更有效激活Caspase细胞凋亡通路,抑制肝癌细胞HepG2生长。     

雷帕霉素联合ZD55-TRAIL病毒对肿瘤抑制及其机制探讨

溶瘤腺病毒的肿瘤靶向性研究一直是一个热点。目前已有商业化的ONYX-015、H101溶瘤腺病毒。在此基础上,科学家又进一步发展形成基因-病毒治疗方案,如文中应用的ZD55-TRAIL病毒。本研究利用刘新垣实验室提供的携带TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TNF相关的凋亡诱导配体)的溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL联合雷帕霉素杀伤肿瘤     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合溶瘤腺病毒ZD55-IL-24诱导SW480细胞凋亡

研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合溶瘤腺病毒ZD55-IL-24对结肠癌SW480细胞的体外杀伤作用。采用MTT法、结晶紫实验检测NSAHA、ZD55-IL-24以及二者联合使用对结肠癌细胞株SW480及人正常肺上皮细胞株Beas-2B的增殖抑制作用;利用Hoechst33342染色对经各种处理的细胞进行凋亡形态学观察,采用流式细胞术对凋亡进行量化;通过Westernblot法在蛋白水平上检测sw480细胞中IL-24的表达情况。结果显示SAHA与ZD55-IL-24联合处理对SW480的增殖抑制作用明显优于两者单独使用。10MoI病毒ZD55-IL-24与0．5gmol／LSAHA联合作用4天,SW480细胞存活率仅为12％,明显低于10MOI病毒单独处理组细胞的存活率（40％,P〈O．05）。然而,正常细胞对于联合给药显示出良好的耐受性。Hoechst33342染色和流式细胞术结果也表明联合处理组的sw480细胞凋亡特征更明显。此外,IL-24在ZD55-IL-24病毒单独感染组及病毒与药物联合组的SW480细胞中均能有效表达。     

溶瘤腺病毒ZD55对类肝癌干细胞的抑制效应

溶瘤腺病毒能够靶向和杀死癌症干细胞,被认为是一种很有前景的抗癌药物.已有研究表明,溶瘤腺病毒ZD55能够靶向肝癌,并且表现出明显的细胞毒性效应.然而,其对肝癌干细胞是否具有同样地杀伤效力仍需进一步探讨.利用悬浮培养富集类肝癌干细胞,并验证其肝癌干细胞的特征.进一步通过MTT、结晶紫染色、Hoechst染色、Western blot和流式细胞术等检测ZD55对类肝癌干细胞的细胞存活率、凋亡诱导和病理效应等.结果发现,悬浮培养的类肝癌干细胞具有自我更新和分化能力、高表达干细胞相关转录因子(如NANOG和OCT4)、处于静息状态和具有耐药性等特性,溶瘤腺病毒处理后表现出明显的细胞毒性效应和杀伤特性,类肝癌干细胞的最低生存率仅为26.7%.ZD55能够非常明显地诱导类肝癌干细胞凋亡,其凋亡率最高达到60%.因此,ZD55可能会成为靶向肝癌干细胞的一种很有前景的治疗药物,对肝癌的临床治疗具有一定的应用价值.     

硫利达嗪联合溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL对HeLa细胞抑制作用及其机制探讨

靶向基因-病毒治疗方法是近年来产生的一种较为有效的癌症生物治疗方法。但其癌症治疗效果仍需进一步提高。在该研究工作中,通过联合使用临床神经治疗药物硫利达嗪（thior_idazine）与溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL来增强对HeLa细胞的杀伤作用。通过MTT实验、倒置显微镜观察、结晶紫染色实验观察了联合使用thioridazine和ZD55-TRAIL对子宫颈癌细胞株HeLa细胞的毒性作用;使用Hoechst33342染色、流式细胞实验和Western blot实验检测了联合使用thioridazine和ZD55-TRAIL在引起HeLa细胞发生凋亡上的作用。结果表明,小分子药物thioridazine与病毒ZD55-TRAIL联合使用可以增强对HeLa细胞的杀伤作用,通过下调抗凋亡蛋白XIAP的水平,更显著地促进HeLa细胞发生凋亡。该研究首次报道了联合使用精神疾病药物thioridazine和ZD55-TRAIL对子宫颈癌细胞HeLa的抑制作用,可能是子宫颈癌治疗的一种有效方法。     

溶瘤腺病毒转染内皮祖细胞抑制肺腺癌的研究

目的:利用溶瘤腺病毒CNHK500体外转染内皮祖细胞,评估其在体外对肺腺癌细胞的特异性杀伤作用。方法:通过溶瘤腺病毒CNHK500转染内皮祖细胞,构建携带CNHK500的内皮祖细胞,并将内皮祖细胞和CNHK500分为三组,即CNHK500组,转染CNHK500的内皮祖细胞组和内皮祖细胞组,分别感染肺腺腺癌细胞A549,用MTT法检测不同肺腺癌细胞A549的生长抑制情况。结果:成功的分离并培养、鉴定内皮祖细胞,并完成CNHK500对内皮祖细胞的转染,CNHK500滴度为2.0×107 pfu/m L,其中CNHK500组肺腺癌细胞A549的存活率为(75.54±5.46)%,转染CNHK500的EPCs组肺腺癌细胞A549的存活率为(80.81±3.69)%,EPCs组肺腺癌细胞A549的存活率为(98.13±2.98)%。结论:本实验首次成功的将CNHK500转染内皮祖细胞,并应用于肺腺癌细胞的生长抑制中,这将有助于为肺腺癌的生物治疗提供一个崭新的策略。     

靶向Wnt信号的溶瘤腺病毒抑制肝癌干细胞研究

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大癌症并成为癌症死亡的主要原因,传统治疗早期肝癌取得了一定的进展,但是癌症的复发、转移和耐药仍未得到根本解决,这些现象可通过癌症干细胞理论(cancer stem cell,CSC)进行解释.本研究通过悬浮富集培养的方法,获得了MHCC-97H细胞的三维立体球细胞(sphere cell),并检测其干细胞特性,通过删除5型腺病毒的E1A CR2区域24 bp碱基,并用Wnt活性转录元件TCF/TEF调控E1A基因表达,同时插入抗癌基因TSLC1,得到了双靶向溶瘤腺病毒Ad.wnt-E1A(△24 bp)-TSLC1,通过MTT、结晶紫染色实验、Hoechst、细胞划痕、蛋白质印迹技术、Transwell及免疫荧光技术检测重组病毒对肝癌类干细胞的EMT(epithelial-mesenchymal transition)转化、杀伤、凋亡以及迁移的作用.结果表明,悬浮富集培养的MHCC-97H sphere细胞具有自我更新、分化能力、静息性以及耐药性,高表达肝癌干细胞表面标志物(如CD133等),重组病毒处理后表现出明显的杀伤效果及抑制细胞迁移与侵袭的特性,靶向抑制MHCC-97H sphere细胞能力更强(P0.001),且重组病毒能有效诱导肝癌类干细胞通过caspase途径发生凋亡.因此,重组病毒Ad.wnt-E1A(△24 bp)-TSLC1有可能成为靶向肝癌干细胞的治疗药物,具有一定的临床应用前景.     

携带TRAIL的溶瘤腺病毒联合LiCl对癌细胞的生长抑制效应

研究糖原合成激酶3的抑制剂LiCl联合携带TRA／L基因的溶瘤腺病毒Ad．sp—ElA—E1B（△55kDa）．TRAIL—Flag（Ad．sp—TRAIL—Flag）对癌细胞的体外杀伤作用。采用MTT法检测癌症特异性病毒Ad．sp—TRAIL—Flag联合药物LiCl对三种癌症细胞株的生长抑制作用;通过结晶紫实验进一步检测联合用药的杀伤效果：进而通过Western blot实验检测联合作用对癌细胞中TRAIL蛋白表达的影响,最后通过流式细胞仪检测其对癌细胞的凋亡作用。结果显示,LiCl联合Ad．sp—TRAIL．Flag的处理对癌细胞的增殖抑制作用明显优于两者单独使用。Western blot实验证明,LiCl可提高溶瘤腺病毒Ad．sp—TRAIL—FIag处理后TRAIL蛋白的表达水平,从而增强了溶瘤腺病毒Ad．sp—TRAIL—Flag通过乃己4儿的信号通路的杀伤效果。     

转染E1B55K基因提高Hep2细胞包装肠腺病毒Ad41的能力

人F组腺病毒Ad40、Ad41难以在体外培养的细胞中传代,被称为难养腺病毒(Fastidious adenovirus).本研究观察了在Hep2细胞表达Ad41 E1B55K基因对Ad41复制的促进作用.从Ad41阳性粪便标本中用PCR的方法获得E1B55K基因,构建真核表达载体,转染Hep2细胞,筛选单克隆,用RT-PCR检测了E1B55K基因的表达.用引起293细胞完全CPE比较产毒量的方法对所得细胞克隆进行初步筛选,获得一株产毒相对较强的细胞Hep2-E1B#4.与对照细胞Hep2、Hep2-DNA3相比,等量Ad41接种Hep2-E1B#4产生的细胞病变效应(CPE)程度明显加深.用免疫细胞化学的方法测定产毒的感染滴度,等量Ad41接种后,Hep2-E1B#4产生的子代腺病毒滴度大于对照的9倍;半定量PCR测得Hep2-E1B#4子代病毒基因组拷贝数约为对照细胞的4倍.结果说明转染E1B55K基因促进了Ad41在Hep2细胞的复制,获得的Hep2-E1B#4细胞株可用于Ad41的分离、培养和体外扩增.     

双靶向溶瘤腺病毒MD55对肿瘤细胞与正常细胞的杀伤作用比较

应用分子克隆和同源重组技术构建双靶向溶瘤腺病毒MD55.分析MD55病毒在细胞中的复制能力,并用MTT和结晶紫方法检测MD55对肿瘤细胞和正常细胞生长的影响,West-ern印迹检测病毒感染后细胞中E1A蛋白和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片断的表达.结果显示,MD55能在MN/CA9阳性的肿瘤细胞SW620和OSRC-2中特异性表达E1A蛋白.并且在这些细胞中的复制能力和对这些细胞的杀伤性与对照病毒ZD55基本相同,而其在正常细胞中的复制能力很弱,对正常细胞的伤害很小;同时MD55可诱导肿瘤细胞SW620和OSRC-2的凋亡,而对正常细胞的凋亡无影响.实验结果表明双靶向溶瘤腺病毒MD55靶向性和安全性比单靶向病毒ZD55更高,有望成为一种很好的肿瘤靶向基因一病毒治疗载体.     

腺病毒介导hIL-24抑制裸鼠肝癌荷瘤生长及其机制研究

为了研究腺病毒hIL-24抑制SMMC-7721肝癌细胞裸鼠荷瘤的生长抑制及其作用机制,构建了重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-hIL-24(Ad-hIL-24),经PacI线性化后转染QBI-293A细胞,多轮感染后收获高效价腺病毒重组病毒子。用SMMC-7721肝癌细胞使16只裸鼠致瘤,然后随机NS分成干预组、5-Fu组、Ad组和Ad-hIL-24组,进行抗肿瘤试验。四组均使用瘤体内注射干预用药,100μL/只NS组、Ad组(107pfu)和Ad-hIL-24组(107pfu)隔日一次,共注射5次;5-Fu组20μg/kg,连续注射5d。用药前、用药后1周和2周分别测皮下瘤体的长径(L)、短径(W),计算出瘤体体积,治疗开始后第15天,将裸鼠脱颈处死,摘取瘤体称重,计算出抑瘤率。显微镜观察细胞生长形态、免疫组化法测caspase3蛋白表达、P53及P27核内抑癌基因表达、CD34染色标记测定的MVD及VEGF蛋白表达。与NS组比较,Ad-hIL-24组与5-Fu组的抑瘤率分别为68.52%(P<0.01)和65.64%(P<0.01);镜下Ad-hIL-24组肿瘤组织的caspase3蛋白表达细胞数较其它3组呈显著性升高(P<0.01),P27核内抑癌基因表达细胞数也较NS组明显增高(P<0.01),CD34染色标记测定的CD34及VEGF较NS组和Ad组明显减少(P<0.001),P53未见明显变化。结论Ad-hIL-24可以显著抑制裸鼠SMMC-7721荷瘤的生长,其机制可能通过激活caspase途径、上调P27抑癌基因表达、抑制血管形成等多途径发挥抑瘤作用。     

海藻多糖通过下调肝癌细胞Hep3B糖酵解途径抑制细胞增殖和迁移

目的:探讨海藻多糖(algal polysaccharides,AP)对肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移的影响及其可能的作用机制,为治疗肝癌提供新的思路。方法:(1)比较正常细胞与癌细胞中糖酵解(embden-meyerhof-parnas,EMP)途径的表达差异,用紫外分光光度计比色法检测EMP限速酶酶活力:己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK),用乳酸测定试剂盒测定EMP产物:乳酸。(2)AP处理Hep3B后,检测EMP表达水平变化。(3)AP处理细胞后,检测肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移能力及对上皮细胞-间充质转化(EMT)的影响,方法包括MTT、q PCR和Transwell小室实验。(4)MTT、Transwell和q PCR检测HK抑制剂3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate,3-BrPA)对肝癌Hep3B细胞的活力和迁移能力及EMT的影响。(5)Western blot和相关试剂盒检测AP与3-BrPA分别处理细胞时,对EMP水平及Akt通路的影响。(6)AP联合3-BrPA处理Hep B3后,检测HK和Akt信号通路表达水平及细胞活力和迁移的变化。结果:(1)癌细胞(Hep3B、He La、SW480)EMP代谢水平均高于正常肝细胞(HL02),其中Hep3B差异最为显著。(2)AP能抑制Hep B细胞EMP代谢水平,且抑制程度随着AP浓度升高而升高,存在浓度依赖性。(3)AP可抑制肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移,且抑制EMT的发生。AP浓度为200mg/ml,处理时间为48h时,生长抑制率达(55±2.8)%,细胞迁移数为对照组的(32±2.9)%;(4)3-BrPA可下调Hep3B细胞HK活性,并抑制细胞活力与迁移,且抑制EMT的发生。200μmol/L 3-BrPA作用细胞48h后,与对照组相比,细胞活性下降了(52±5.8)%(P0.001),细胞迁移数下降了(48±6.1)%(P0.01)。(5)AP和3-BrPA均下调EMP代谢水平,且抑制Akt信号通路。(6)AP与3-BrPA联合处理Hep3B后,HK表达下降,显著抑制Akt信号通路,细胞活性和迁移能力均较AP单用组显著下降(P0.05)。结论:肝癌细胞Hep3B EMP代谢水平高于正常肝细胞,AP可下调Hep3B细胞EMP代谢水平,低EMP代谢水平可能通过下调EMT和Akt信号通路抑制Hep3B的增殖和迁移。当AP和3-BrPA联合应用时,抑制肝癌迁移和增殖效果更明显。     

雷帕霉素联合紫杉醇对子宫内膜癌STAT3 表达的影响

目的:探讨雷帕霉素联合紫杉醇对子宫内膜癌STAT3表达的影响及其临床意义。方法:选取我院收治的子宫内膜癌患者90例,随机分为对照组及实验组,对照组采用常规化疗治疗,实验组采用雷帕霉素联合紫杉醇化疗治疗。观察并比较两组患者治疗前后细胞生长抑制率以及干扰素、生长因子、白细胞介素及STAT3水平的变化情况。结果:与治疗前比较,两组患者治疗后细胞生长抑制率、生长因子、白细胞介素及STAT3表达水平均降低,而干扰素水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);与对照组比较,实验组患者治疗后细胞生长抑制率、生长因子、白细胞介素及STAT3表达水平较低,而干扰素水平较高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:雷帕霉素联合紫杉醇可改善机体免疫功能活性,增强肿瘤细胞免疫活性,阻断细胞恶性增殖有丝分裂进程,提高吞噬细胞对肿瘤细胞杀伤性,临床疗效较化疗优异,可作为临床有效治疗方案,并具有重要意义。     

癌症靶向基因-病毒ZD55-XAF1抗肝癌移植瘤的生长及其安全性研究

目的:探讨溶瘤腺病毒(ZD55-gene)作为载体携带外源抗癌基因(XAF1)抗肝癌移植瘤的生长及其安全性。方法:抽提溶瘤腺病毒ZD55-XAF1的基因组DNA,PCR扩增鉴定病毒;细菌平板培养和支原体检测试剂盒检测细胞有无细菌、支原体污染;通过荷瘤小鼠动物实验,观察溶瘤腺病毒ZD55-XAF1对肝癌移植瘤生长的抑制、小鼠的临床反应指标、血清肝毒性指标、各脏器组织中的病毒残留分布及病理切片观察。结果:细胞培养过程无细菌和支原体污染;较对照组,受试小鼠血清肝酶AST活性上升(P0.05),而ALT和ALP活性基本无变化(P0.05);PCR检测各脏器均有病毒基因组DNA存在;HE染色显示受试小鼠各脏器具有不同程度的损伤,病毒处理对肿瘤细胞具有明显的杀伤效果,而受试小鼠的临床反应并无明显异常。结论:溶瘤腺病毒ZD55-XAF1能够抑制肿瘤生长,杀死肿瘤细胞,对小鼠血清肝酶活性影响较小而对各脏器有不同程度的轻微损伤,作为癌症基因治疗载体有潜在的应用价值但其安全性还有待提高。     

溶瘤腺病毒靶向杀灭葡萄膜黑色素瘤的实验研究

葡萄膜黑色素瘤是成人最严重的原发性恶性肿瘤之一.传统的治疗方法,包括手术、放射治疗和化学治疗效果都不是很理想.溶瘤腺病毒H101,能够特异性地在p53突变的肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞,同时对正常细胞影响较少,且已由中国国家食品药品监督管理总局批准上市.为了研究H101对葡萄膜黑色素瘤的治疗效果,通过体外感染葡萄膜黑色素瘤细胞,发现H101能够显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡,抑制细胞周期,而对正常的ARPE-19细胞没有影响.在体内实验中,建立了SP6.5细胞的荷瘤小鼠模型,在H101治疗后抑制了肿瘤的生长,延长了动物寿命.上述结果表明,溶瘤腺病毒H101治疗葡萄膜黑色素瘤是一种可行的方法.     

加热调控的溶瘤腺病毒载体构建及其特征研究

溶瘤腺病毒作为近年来新兴的肿瘤基因治疗策略,因具有“细胞溶解”和“旁观者效应”而备受关注．构建了受热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体Ad-HSP70p-E1A,观察该病毒与热疗联合应用对肺癌细胞生长的抑制作用和带动治疗基因在肺癌细胞中表达的效果．体外实验结果表明,Ad-HSP70p-E1A在肺癌细胞株A549内能较好地实现自身复制,并产生一定的溶瘤作用,在联合热疗后,Ad-HSP70p-E1A的自身复制能力和溶瘤效果分别增强了2～10倍和5倍以上．此外,Ad-HSP70p-E1A还可通过反式提供E1A蛋白而使10 moi用量的复制缺陷型腺病毒AdGFP、Ad-CMV-hGMCSF和Ad-CMV-mIL12的表达提升76.64倍、5倍和7倍．     

太白银莲花皂苷B对胶质瘤细胞生长抑制的研究

目的:太白银莲花皂苷B(Anemone taipaiensis saponin B)是第一次从太白银莲花中经过系统化学分析和分离鉴定的皂苷之一,所以它的生物学效应目前仍然不清楚。在本研究中,我们首次体外研究太白银莲花皂苷B对胶质瘤细胞系的生物学效应,观察它对胶质瘤细胞增殖的的抑制作用。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定太白银莲花皂苷B对胶质瘤细胞生长曲线的影响,Hoechst 33342细胞核染色后荧光显微镜观察,采用光学显微镜观察细胞的形态学变化。结果:MTT实验结果显示太白银莲花皂苷B对胶质瘤细胞U87MG和U251MG有强烈的生长抑制作用,且具有剂量依赖性,应用SPSS18.0统计软件得出太白银莲花皂苷B对U87MG细胞72 h的抑制浓度为IC25=5.2μmol/L,IC50=6.7μmol/L and IC75=8.7μmol/L,U251细胞的抑制浓度为IC25=6.2μmol/L,IC50=7.9μmol/L and IC75=10.5μmol/L。Hoechst 33342细胞核染色荧光显微镜观察以及光学显微镜下细胞形态观察显示出典型的凋亡细胞形态学特征,经过皂苷B处理后,细胞皱缩成圆球形,细胞核碎裂或者致密浓染,向核膜边缘聚集,染色质浓缩为半月状、车轮状或者马蹄状,凋亡小体出现。这些特征在24 h时更明显。结论:体外实验初步显示,太白银莲花皂苷B对U87MG和U251MG细胞具有明显的增殖抑制作用,并具有促凋亡作用。