KLF4/BNIP3介导的线粒体自噬在FNDC5抵抗阿霉素心肌毒性中的作用

摘要 目的：本研究旨在探究FNDC5（Irisin）是否通过激活KLF4而抑制BNIP3介导的线粒体过度自噬,保护线粒体功能及降低纤维化蛋白的表达,明确其在DOX导致的心肌细胞毒性中的保护作用机制。方法：将分离的心肌成纤维细胞随机进行如下分组：对照组（CON）、FNDC5处理组（FNDC5）、DOX损伤组（DOX）、FNDC5保护组（DOX-FNDC5）、DOX+Scramble siRNA损伤组(DOX-Scramble siRNA)、FNDC5+Scramble siRNA保护组（DOX-FNDC5-Scramble siRNA）、DOX+KLF4 siRNA组（DOX-KLF4 siRNA）、DOX+FNDC5+KLF4 siRNA组（DOX-FNDC5-KLF4 siRNA）,并检测ROS生成量、Western Blot检测线粒体功能及心肌成纤维细胞纤维化标志蛋白的表达等试验方法,观察FNDC5处理对DOX诱导的心肌细胞毒性的作用机制。结果：体外研究表明,与CON组细胞相比,DOX处理后可显著抑制ATP生成,而细胞凋亡率显著增加、同时线粒体自噬过度激活（BNIP3、Atg5及LC3的蛋白表达量明显增加）、细胞纤维化标志蛋白（Collagen I、α-SMA）的表达量显著增加,而FNDC5处理后可显著逆转DOX诱导的心肌细胞损伤。进一步的研究证实,FNDC5通过激活KLF4而抑制BNIP3介导的线粒体自噬,保护线粒体功能及降低纤维化。然而,FNDC5对BNIP3介导的线粒体自噬的抑制作用可被KLF4 siRNA部分抵消,细胞纤维化蛋白表达增加。结论：FNDC5通过激活KLF4信号而抑制BNIP3介导的线粒体过度自噬,保护线粒体功能及降低纤维化蛋白的表达,进而缓解DOX导致的心肌细胞毒性。     

T型钙通道α1G亚单位在细胞增殖中的功能研究

利用稳定过表达人类T型钙通道α_(1G)亚单位的HEK-293细胞研究了T型钙通道在细胞增殖中的作用。RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α_(1G)单位的过表达的实现。生长曲线表明,T型钙通道α_(1G)亚单位的过表达能显著促进细胞增殖,HEKα_(1G)~+细胞的细胞群体倍增时间(13.7±0.3h)比对照HEK-293细胞的细胞群体倍增时间(22.1±1.1h)缩短了约8h;流式细胞分析结果也与此吻合,在稳定过表达了人类T型钙通道α_(1G)亚单位的细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高,相反地处于G_0/G_1期的百分率比对照HEK-293细胞低,以上结果证明过表达T型钙通道α_(1G)亚单位能促进细胞增殖;T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制HEKα_(1G)~+细胞增殖,IC_(50)为3.5/μmol/L,表明在HEK-293细胞过表达T型钙通道对细胞增殖的促进作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制,这就进一步证明了T型钙通道在促进细胞增殖方面的直接作用。Western杂交结果提示了T型钙通道α_(1G)亚单位的表达是通过某种信号途径提高了与细胞周期有关的蛋白质,cyclin A、cyclin E和CDK2的表达水平,从而刺激了细胞周期的进程。本研究有助于理解细胞增殖的机制并为开发治疗与细胞增殖异常有关疾病的新药提供了理论依据。     

异氟醚经Pink1/Parkin信号通路激活线粒体自噬对小鼠心肌缺血再灌注的保护作用

目的 探究异氟醚（isoflurane, ISO）通过Pink1/Parkin信号通路对小鼠心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion,IR）损伤中线粒体自噬的影响。方法 本研究建立小鼠心肌IR模型,并将24只小鼠分为4组：假手术（Sham）组、假手术+异氟醚（Sham+ISO）组、缺血再灌注（IR）组、缺血再灌注+异氟醚（IR+ISO）组。通过HE染色评估心肌组织损伤,利用TUNEL染色观察心肌细胞凋亡,通过Western blot检测心肌细胞线粒体自噬相关蛋白（包括Pink1、parkin、Beclin、P62和LC3）的表达,并使用相关试剂盒测定心肌细胞线粒体内膜电位及ATP含量。结果 与Sham组相比,IR组的心肌细胞损伤更为严重,心肌组织损伤评分增加,细胞凋亡率升高。线粒体自噬相关蛋白表达紊乱,线粒体内膜电位和ATP含量显著下降。值得注意的是,在ISO处理的IR小鼠中,IR损伤导致的心肌组织损伤评分和心肌细胞凋亡率明显减轻;线粒体自噬相关蛋白的表达部分恢复,线粒体内膜电位和ATP含量的降低也得到了显著改善。结论 ISO可以通过Pink1/Parkin信号通路抑制...     

丙酮酸对细胞寒冷应激损伤的保护作用研究

目的:细胞冻存、移植器官保存过程中,机体细胞会产生细胞寒冷应激过程,导致细胞产生损伤作用,而其作用机制尚不清楚,本研究通过观察4℃冷暴露对HEK293细胞增殖活性及凋亡的影响,分析线粒体分裂蛋白Drp1在此过程中的表达变化,阐明Drp1在细胞寒冷应激中作用及其机制.方法:采用MTT法观察4℃环境暴露对HEK293细胞损伤的影响,流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot方法检测蛋白Drp1、Bcl2表达水平变化,提取线粒体观察线粒体中Drp1表达水平.结果:4℃冷暴露抑制HEK293细胞增殖(P＜0.05),Drp1线粒体表达水平增高,并向线粒体转位;丙酮酸可以逆转4℃冷暴露对细胞增值抑制,抑制Drp1线粒体表达水平增高,并向线粒体转位,增加细胞中Bcl2表达水平.结论:研究发现细胞寒冷应激可以使细胞凋亡,细胞增殖出现显著抑制,而寒冷应激引起细胞Drp1的线粒体转位,丙酮酸干预后可以对细胞起到保护作用,研究发现丙酮酸可以逆转Drp1的线粒体转位过程,增加Bcl2表达水平,可能是其产生保护作用的机制之一.     

人源性长寿保障基因2通过与V-ATPase作用抑制肝癌细胞的生长

人源性长寿保障基因2(Homo sapiens longevity assurance homologue2,LASS2)是本实验室克隆到的一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因。前期研究显示,LASS2可与V-ATPase质子泵的c亚基ATP6L结合,过表达LASS2可以抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长。本研究旨在探讨LASS2对V-ATPase质子泵功能的调节是否参与LASS2对肝癌细胞生长的抑制作用。使用本室构建、保存的pCMV-HA2-LASS2质粒瞬时转染肝癌细胞(HCCLM3),而未转染质粒的HCCLM3细胞作为空白对照,运用CCK-8试剂盒检测细胞生长情况;采用BCECF-AM和BCECF氢离子敏感探针分别测定细胞内、外H+浓度;应用流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测线粒体和胞质内细胞色素c(cytochrome c,Cytc)、胞质中的无活性pro-caspase-3的表达情况。结果显示,外源性LASS2的过表达对HCCLM3细胞生长有抑制作用;过表达LASS2使HCCLM3细胞内H+浓度上升,细胞凋亡率提高,线粒体Cyt c释放增加,胞质中pro-caspase-3含量下降。以上结果提示提示LASS2可能通过调控V-ATPase质子泵的功能,提高细胞内H+浓度,从而激活细胞线粒体凋亡途径、抑制肝癌细胞的生长。     

绵羊Follistatin基因表达及其结构域的功能分析

为研究羊Follistatin基因的功能,提取了绵羊卵巢总RNA,通过RT-PCR方法获得羊Follistatin cDNA的完整开放阅读框 (1 038 bp)。去除信号肽序列后与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pFSsig?,经大肠杆菌诱导表达获得FS sig?蛋白 (66 kDa)。通过RT-PCR克隆了包含N端和结构域1的Follistatin突变体 (FS N+D1),将FS N+D1片段插入慢病毒载体 (pLEX-MCS) 构建了pFS-N+D1慢病毒重组表达质粒。在293T细胞中进行慢病毒的包装,再感染绵羊肌肉原代细胞,得到稳定表达FS N+D1的肌肉细胞系,通过细胞生长曲线结果显示稳定表达FS N+D1的肌肉细胞明显比正常肌肉细胞增殖快,且差异极显著 (P＜0.01),表明绵羊FS N+D1结构域有促进肌肉细胞生长的功能。     

H1N1流感病毒血凝素对人肺细胞的损伤作用及机制研究

目的:研究H1N1流感病毒血凝素HA对人胚肺成纤维细胞的损伤作用并初步探讨其机理。方法:合成2009 H1N1的HA基因全长,分别将HA的PCR产物和pEGFP-N1质粒经Hind Ⅲ和EcoRI酶切电泳、纯化、连接并转化大肠杆菌DH5α,构建真核表达质粒pEGFP-N1/HA。质粒转染293细胞,检测其转染效率,并收获细胞总蛋白进行Western blotting检测。将阳性质粒转染MRC-5细胞,CCK-8检测HA的表达对细胞增殖活性,线粒体膜电位检测试剂盒检测其对细胞的早期凋亡的影响,ATP检测试剂盒检测HA的表达对ATP水平的改变。结果:PCR电泳检测获得分子量为1700 bp左右的目的条带,菌落PCR鉴定HA片段成功插入pEGFP-N1载体。荧光显微镜下检测pEGFP-N1/HA转染293细胞有明显荧光,Western blotting结果显示pEGFP-N1/HA转染细胞有单一的目的蛋白表达。HA的表达可明显抑制MRC-5细胞活力,HA的高表达降低MRC-5细胞的线粒体膜电位及ATP水平。结论:H1N1流感病毒HA对人肺细胞的损伤作用可能与影响肺细胞的线粒体功能有关。     

CLIC1通过干扰线粒体动力学平衡促进内皮细胞损伤的研究

该文通过研究H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中氯离子通道蛋白1(chloride intracellular channel 1, CLIC1)对线粒体动力学平衡的影响,探讨CLIC1在内皮细胞损伤中的作用及机制。体外培养HUVEC细胞,分别用CLIC1抑制剂IAA94(40μmol/L)、H2O2(0.9 mmol/L)、IAA94(40μmol/L)和H2O2(0.9 mmol/L)联合处理,荧光法检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量; JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位的变化;定量PCR技术检测CLIC1、线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)以及线粒体融合蛋白1(mitofusin 1, Mfn1)的mRNA表达;免疫印迹技术检测CLIC1、Drp1蛋白的水平。结果显示:与正常组相比, H2O2处理的内皮细胞中ROS、MDA含量增加(P0.05), CLIC1表达量上调(P0.05),三磷酸腺苷(ATP)含量减少(P0.05),线粒体膜电位降低(P0.001),线粒体融合蛋白Mfn1表达显著降低(P0.05),线粒体分裂蛋白Drp1表达显著升高(P0.05);而IAA94预处理2 h后,内皮细胞中ROS、MDA含量减少(P0.05),线粒体融合蛋白Mfn1表达显著增加(P0.05),线粒体分裂蛋白Drp1表达显著降低(P0.05),线粒体膜电位升高(P0.001)。以上结果表明, CLIC1在H2O2诱导的内皮细胞线粒体损伤中发挥重要作用,其机制可能与CLIC1干扰线粒体动力学平衡有关。     

辣椒素对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及TRPV1通路相关性研究

研究辣椒素的抗肾脏缺血再灌注损伤(I/R)的作用及可能的作用机制。将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量辣椒素组(4μg/kg)、中剂量辣椒素组(8μg/kg)、和高剂量辣椒素组(16μg/kg)。辣椒素组在缺血前45分钟通过腹腔注射(4、8、16)μg/kg的辣椒素,辣椒素组在缺血前45分钟通过腹腔注射(4、8、16)μg/kg的辣椒素,假手术组和模型组在缺血前45分钟通过腹腔注射等体积生理盐水。利用ELISA检测血清中肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的含量;过碘酸雪夫染色(PAS)染色检测肾组织病理形态;酶法检测肾脏线粒体Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性;硫代巴比妥酸比色法(TBA)检测肾脏线粒体丙二醛(MDA)的含量;黄嘌呤氧化酶法检测肾脏线粒体超氧化物歧化酶(SOD)活性;比色法检测肾脏线粒体谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)活性;免疫蛋白印记法(Western bloting)检测瞬时感受器电位香草酸受体-1 (Transient Receptor Potential Vanilloid-1,TRPV1)和p-TRPV1蛋白水平;高效液相色谱法检测肾脏线粒体三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量,并计算和腺苷酸池(ATP+ADP+AMP)含量。结果显示:与假手术组相比,模型组Cr、BUN和线粒体MDA的含量以及p-TRPV1表达水平和肾组织病理损伤均明显增加,而线粒体SOD、GPx、CAT、Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性以及ATP、ADP、AMP和ATP+ADP+AMP含量均明显降低,而TRPV1表达无差异;与模型组相比,利用辣椒素预处理可呈剂量依赖性减少Cr、BUN和线粒体MDA的含量以及肾组织病理损伤,并可呈剂量依赖性增加肾脏线粒体SOD、GPx、CAT、Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性以及p-TRPV1表达和ATP、ADP、AMP和ATP+ADP+AMP含量,而TRPV1表达无差异;以上结果均表明辣椒素减轻大鼠肾缺血再灌注损伤与抑制线粒体脂质过氧化反应相关。     

慢病毒介导的重组TM9SF1蛋白通过诱导自噬和内质网应激抑制293T细胞生长

九次跨膜超家族蛋白成员1（transmembrane 9 superfamily protein member 1,TM9SF1）在进化过程中高度保守,在人体组织和多种细胞系广泛表达。目前,关于该蛋白质的功能研究十分有限和初步。本研究采用慢病毒介导的TM9SF1表达系统,研究了重组TM9SF1蛋白的生化特点及其对细胞生长的调控作用。慢病毒感染的293T全细胞裂解液的蛋白质免疫印迹结果揭示,TM9SF1蛋白具有表观分子质量约为70 kD的单体及寡聚体两种主要形式;在室温及加热37℃时蛋白质相对稳定,随变性温度升高（56 ℃以上）逐渐失去其稳定性。CCK8法显示,与慢病毒空载体感染的293T细胞比较,TM9SF1慢病毒表达载体感染的293T细胞在感染2 d后增殖明显减缓（P<0.001）。Western印迹结果证明,过表达TM9SF1引起LC3Ⅱ表达明显上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例升高,说明TM9SF1可引起293T细胞发生自噬。荧光实时定量PCR结果显示,过表达TM9SF1的293T细胞内质网应激标志分子CHOP、GADD34和XBP1（S）表达水平是对照细胞的3～4倍,提示发生了内质网应激反应。以上结果提示,TM9SF1具有抑制293T细胞生长的功能,该功能可能与其引起的内质网应激和自噬有关。这一结论将进一步加深对TM9SF1在细胞生长调控中的功能的认识。     

LOX-1过表达诱发H9C2心肌细胞肥大

目的:构建携带过表达大鼠凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)基因的慢病毒载体,研究LOX-1与心肌细胞肥大的关系。方法:构建大鼠LOX-1基因pHIV-LOX-1过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293T细胞,检测其侵染效率。包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞,72 h后观察其侵染效率。qPCR法检测细胞LOX-1表达。检测过表达LOX-1后心肌细胞面积及其蛋白含量变化。结果:成功构建过表达LOX-1 H9C2心肌细胞。过表达LOX-1组(Lv.LOX-1+)心肌细胞面积(16691.890±1022.368μm2)较对照组(Lv.NC)(3459.865±343.175μm2)显著增加(P0.001)。Lv.LOX-1+组心肌细胞蛋白含量(132.457±8.188 pg/cell)较Lv.NC组(45.095±1.655 pg/cell)显著增加(P0.001)。结论:LOX-1过表达能诱导H9C2心肌细胞肥大。     

HCMV感染单核细胞对细胞能量代谢的影响

该文旨在探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染人单核白血病细胞(THP-1)后对其能量代谢的影响。采用流式细胞仪、海马生物能量测定仪分别检测HCMV感染THP-1后细胞的存活率、有氧呼吸率(oxygen consumption rate,OCR)和细胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR);Western blot检测线粒体动力学相关蛋白;采用RNA-seq和质谱技术检测细胞代谢相关基因及蛋白表达水平。结果显示,HCMV感染24 h、48 h及72 h后,线粒体氧化磷酸化水平上升,糖酵解水平下降(P0.05);感染组线粒体融合相关蛋白MFN1、OPA1及OMA1表达量较对照组升高(P0.05);感染组ATP8A1、ATP6AP1L及ATP6V1C2等氧化磷酸化相关基因表达显著上调(P0.001),LDHA、ENO3及ENO1等糖酵解相关基因表达显著下调(P0.001);感染组ATP6V1A、ATP5O及PGP等细胞代谢相关蛋白表达显著上调(P0.01)。研究表明,HCMV感染THP-1细胞可能通过诱导线粒体融合及调控细胞能量代谢相关基因和蛋白的表达,促进细胞氧化磷酸化并抑制糖酵解水平。     

miR-155对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的作用及机制研究

目的:探讨mi R-155对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:首先构建慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,然后感染椎间盘退变髓核细胞得到稳定过表达细胞系,同时设置空载体和空白细胞组对照。用荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白GFP的表达,分别提取三组细胞总RNA,采用RT-q PCR方法检测mi R-155的表达;通过流式细胞术检测细胞凋亡,Western-Blot检测细胞中凋亡相关蛋白FADD、Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达,JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化情况。结果:在荧光显微镜下,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白细胞组未见绿色荧光;RT-qPCR结果显示构建的稳定过表达细胞系(GV369-miR-155-NP)中mi R-155的表达水平较高,且与空载体细胞系及空白细胞对照组均呈显著性差异(P0.05);与空载体组(GV369-NP)及空白细胞对照组相比,过表达组(GV369-miR-155-NP)细胞凋亡率显著降低(P0.05),FADD、Caspase-3、Bax的表达水平均明显下降,而Bcl-2表达水平显著增加(P0.05)。结论:mi R-155可能通过靶向结合Caspase-3和FADD阻止FasL-Fas途径或通过线粒体途径抑制人椎间盘退变髓核细胞凋亡。     

SIRT3抑制线粒体自噬并减轻高糖加重的神经元缺氧再灌注损伤*

目的:探讨SIRT3调控的线粒体自噬对高糖加重神经元缺氧再灌注损伤的影响及机制。方法:高糖(50 mmol/L)干预HT22细胞后,构建细胞缺氧/复氧模型,利用SIRT3抑制剂3-TYP抑制SIRT3表达。倒置显微镜观察细胞形态改变,CCK8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,TMRE荧光试剂盒检测细胞线粒体膜电位,RT-qPCR、Western blot检测相关分子的基因和蛋白质表达。结果:高糖使神经元缺氧再灌注后的细胞碎片进一步增加,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高(P<0.05)。此外,高糖降低了神经元缺氧再灌注后的线粒体膜电位(P<0.05)。进一步研究发现,高糖上调神经元缺氧再灌注后线粒体分裂相关蛋白DRP1的表达水平,降低了线粒体融合相关蛋白OPA1和线粒体外膜蛋白TOM20的表达;并且增加了自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1和线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达;同时,高糖升高了SIRT3的基因和蛋白质表达(P<0.05)。而SIRT3抑制剂3-TYP使神经元高糖缺氧再灌注损伤加重,同时进一步上调DRP1、LC3Ⅱ和PINK1的蛋白质表达(P<0.05)。结论:高糖可显著加重神经元缺氧再灌注损伤,破坏细胞线粒体功能,激活细胞线粒体自噬;SIRT3可抑制PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬并减轻神经元高糖缺氧再灌注损伤。     

人酪氨酸蛋白激酶Lyn的真核表达、纯化及鉴定

[目的]构建含人酪氨酸蛋白激酶Lyn基因的载体并进行真核表达、纯化和研究其对细胞增殖的影响。[方法]提取人Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法获得Lyn基因并克隆至pcDNA3.1(-)载体。经双酶切、PCR和测序方法鉴定后,将重组质粒瞬时转染HEK 293T细胞表达目的蛋白,应用组氨酸标签镍离子螯合磁珠纯化融合蛋白,通过Western Blot检测蛋白的表达及纯化,并用CCK-8法检测过表达Lyn后细胞增殖能力的变化。[结果]成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Lyn并进行瞬时表达和蛋白纯化,CCK-8法检测过表达Lyn的HEK 293T细胞的增殖能力显著性下降(P0.01)。[结论]Lyn在HEK 293T细胞中成功瞬时表达及纯化,并可以使细胞的增殖能力受到明显抑制,为稳定表达和深入研究其生物学功能及作用机制奠定基础。     

SS-31通过调控线粒体功能延缓细胞衰老的分子机制

摘要 目的：探讨SS-31通过调控线粒体功能延缓细胞衰老的调控效应。方法：将HEK293T细胞分为空白组、模型组、SS-31组。使用H₂O₂诱导应激性衰老模型,然后采用SS-31对HEK293T细胞进行干预。SA-β-gal衰老染色试剂盒检测细胞衰老水平;JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位水平;荧光倒置显微镜观察线粒体活性氧（ROS）荧光强度;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;蛋白质免疫印迹检测P53,P21,Acetyl-p53,Sirt1蛋白表达。结果：模型组SA-β-gal阳性率高于空白组,应用SS-31后阳性率显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;ROS荧光检测：与空白组比较,模型组荧光强度上升,而SS-31组荧光强度较模型组下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;线粒体膜电位检测：与空白组比较,模型组红色荧光强度显著下降,SS-31干预后,红色荧光强度显著上升,差异有统计学意义（P＜0.05）;ATP检测：模型组ATP水平低于对照组,SS-31组高于模型组,差异有统计学意义（P＜0.05）;此外,模型组P53,P21及Acetyl-p53蛋白表达水平较空白组增加（P＜0.05）,而SS-31组较模型组有所降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,模型组Sirt1蛋白表达水平较空白组降低（P＜0.05）,而SS-31组较模型组升高,差异有统计学差异（P＜0.05）。结论：SS-31能够通过改善线粒体功能延缓HEK293T细胞衰老。     

PGC-1α基因在HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导神经元线粒体功能障碍中的作用及机制研究

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency viru,HIV)包膜糖蛋白gp120具有神经毒性,可引起神经元损伤,与HIV相关性痴呆的发生有关,但gp120引起神经元损伤的机制尚不清楚.有研究报道gp120能够引起神经元出现线粒体功能障碍,而PGC-1α是促进神经元内线粒体生成的关键基因.因此,本研究将分析PGC-1α基因在HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导神经元线粒体功能障碍中的作用及机制.原代培养皮层神经元细胞后分为对照组、gp120组、空白质粒组、gp120+空白质粒组,gp120+PGC-1α质粒组、PGC-1α质粒组,检测细胞活力OD490nm线粒体膜电位(△ψm)水平、三磷酸腺苷(ATP)含量、活性氧簇(ROS)含量、凋亡率及PGC-1α、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达水平.结果 显示,gp120组皮层神经元的PGC-1α表达水平、OD490nm水平、△ψm水平、ATP含量均低于对照组,ROS含量、凋亡率、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达水平均高于对照组;过表达PGC-1α后,gp120+PGC-1α质粒组皮层神经元的PGC-1α表达水平、OD490nm水平、△ψm水平、ATP含量均高于gp120+空白质粒组,ROS含量、凋亡率、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达水平均低于gp120+空白质粒组.以上结果表明,gp120诱导皮层神经元出现线粒体氧化呼吸功能减退、线粒体途径凋亡等线粒体功能障碍的表现,抑制PGC-1α基因表达是gp120诱导线粒体功能障碍的相关机制之一.本研究的创新点在于探究了gp120诱导神经元线粒体功能障碍的分子机制,研究发现抑制PGC-1α基因表达是gp120诱导神经元线粒体功能障碍的相关机制之一,这为今后阐明gp120诱导神经元损伤及HIV相关性痴呆的发病机制提供了实验依据.     

人源核小体组装蛋白1类似蛋白5（NAP1L5）促进293T细胞增殖

人源NAP1L5为核小体组装蛋白（NAP-1）家族成员,目前功能未知。肝癌研究暗示Nap1l5可能为抑癌基因,抑制细胞增殖;但NAP-1家族其他功能已知的一些成员,可促进细胞增殖和加快周期进程。人源NAP1L5是促进还是抑制细胞增殖,目前未知。本研究里,我们发现过表达Nap1l5促进293T细胞增殖,抑制表达则降低293T细胞增殖速度。细胞周期分析表明：Nap1l5过表达增加G2期、减少G1期细胞比例;抑制Nap1l5表达,则增加G1期、减少G2期细胞比例。我们的研究表明：人源NAP1L5会加快293T细胞周期进程,促进增殖,并且提示原来关于Nap1l5是抑癌基因的推测是不对的。     

建立CRISPR/Cas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因

旨在构建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除体系,获得高效、稳定、永久性AIP1敲除的人胚肾细胞株(293T)。针对AIP1的外显子设计3个20 bp的sg RNA(sp1、sp2和sp3)。与PX458载体连接,构建PX458-sg RNA敲除表达载体。T7E1实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sg RNA与lenti CRISPRv2慢病毒载体连接,构建lenti CRISPRv2-sg RNA敲除表达载体,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中,收集病毒上清液转染293T细胞。对敲除成功的293T细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1基因的稳定细胞株。Western blot测定转染后293T细胞中AIP1蛋白的表达量。结果显示,测序证实AIP1的3个靶序列分别正确插入PX458表达载体中,T7E1实验证实AIP1sg RNAsp2靶向敲除效率最高;成功构建lenti CRISPRv2-sg RNAsp2 AIP1敲除表达载体,并包装病毒,感染293T细胞;Western blot证实获得稳定的AIP1基因表达缺失的293T细胞株。建立了能稳定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的293T稳定细胞株。     

慢病毒介导shRNA特异性干扰MRPL18基因对胰岛素瘤细胞线粒体能量代谢的影响

为了观察线粒体核糖体蛋白大亚基18(mitochondrial ribosomal proteins L18,MRPL18)基因低表达对小鼠胰岛素瘤细胞(MIN6)线粒体能量代谢的影响,该研究利用慢病毒介导的MRPL18 shRNA特异性干扰MRPL18基因,构建MRPL18基因低表达的MIN6细胞模型。Real-time PCR和Western blot检测干扰前后MRPL18 mRNA和蛋白质的表达情况。流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化。海马生物能量代谢仪检测细胞线粒体功能。高效液相色谱检测细胞ATP、ADP和AMP含量。结果显示:转染MRPL18-shRNA后,MRPL18 mRNA和蛋白质表达均显著降低(P0.05、P0.01),细胞ROS明显升高(P0.05);细胞氧耗率、基础呼吸、最大呼吸和储备呼吸能力显著降低,同时ATP产量和质子漏也减少(P0.05、P0.01)。细胞ATP含量和能荷较对照组减少,ADP和AMP含量显著增加(P0.05、P0.01)。证实了MRPL18基因表达下调后细胞内发生了代谢障碍。推测MRPL18是影响线粒体功能的关键蛋白质,该蛋白在细胞代谢过程中发挥着重要作用。MRPL18表达下降所建立的线粒体功能障碍的MIN6细胞模型,可用于线粒体糖尿病发病分子机制的研究。