骨桥蛋白通过NF-κB上调钙蛋白酶小亚基1促进肝癌细胞迁移

骨桥蛋白(osteopontin,OPN)参与调控多种信号途径激活转移相关基因,进而促进细胞迁移.钙蛋白酶小亚基1(calpain small subunit1,Capn4)与肿瘤转移密切相关,在许多肿瘤及其转移组织中高表达.为了探讨OPN促进肝癌细胞迁移的分子机制,应用报告基因检测、RT-PCR、免疫印迹及伤口愈合等方法检测了肝癌细胞中OPN对Capn4的调控作用及其对肝癌细胞迁移的影响.结果显示,在HepG2细胞中过表达OPN后,Capn4的启动子转录活性显著增强,同时mRNA及蛋白质表达水平也明显上调.在HepG2细胞中应用siRNA干扰OPN的表达可导致Capn4启动子转录活性受到明显抑制,同时mRNA及蛋白质表达水平也显著下调.应用核转录因子-κB(NF-κB)的抑制剂PDTC可抑制由过表达OPN导致的HepG2细胞中Capn4的上调.伤口愈合实验显示,OPN可以通过上调Capn4促进肝癌细胞迁移.因此,研究发现,OPN通过NF-κB上调Capn4的表达,进而促进肝癌细胞的迁移,这一发现对进一步阐明肝癌细胞迁移的分子机制具有重要意义.     

Map3k1调控小鼠眼睑闭合的研究进展

小鼠(Mus musculus)眼睑发育需要协调细胞增殖、细胞形态改变、迁移及凋亡.Map3k1是MAPK家族中重要的一员,Map3k1表达的蛋白质MEKK1是MAPK信号通路重要的节点.MEKK1-JNK信号通路活化c-jun,增强AP-1转录因子的转录活性,从而调控肌动蛋白纤维的形成和细胞的迁移.MEKK1还有可能...     

乳腺癌细胞中人血小板衍生生长因子受体β启动子的基础活性研究

目的:探讨低迁移表型的乳腺癌细胞MCF-7和高迁移表型的乳腺癌细胞MDA-MB-231中血小板衍生生长因子β启动子的基础活性及转录调控差异。方法:Real-Time PCR,Weastern blot等技术检测PDGFRβ在2株细胞中的转录和表达差异。双荧光报告系统检测PDGFRβ启动子各缺失突变片段在2株细胞中的活性,筛选差异片段。生物信息学预测启动子区可能存在的转录因子。凝胶迁移实验研究转录因子在两株乳腺癌细胞中对PDGFRβ启动子的调节活性。结果:两株细胞中都有PDGFRβ的内源性表达,且在MDA-MB-231中表达较高。在2株细胞中找到了人PDGFRB 启动子的重要活性调节区,(+539bp,+1457bp)在2株细胞中均呈负调控,(+54bp,+539bp)在两株细胞中均呈正调控,(-983bp,+54bp)在MDA-MB-231中呈显著正调控,在MCF-7中没有活性。转录因子AP1的转录活性和与DNA的结合活性在MDA-MB-231中均高于MCF-7。结论:不同迁移表型的乳腺癌细胞中PDGFRβ存在不同的表达调控机制,PDGFRβ启动子活性片段(-983bp,+54bp)在两株细胞中存在显著活性差异。转录因子AP-1在两株细胞中有表达水平和结合活性差异。     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

转录因子AP-2α调控SOX9基因的表达

肝癌是肝脏中最常见的恶性肿瘤,是全球癌症相关死亡的第三大主要原因。肝癌发病具有隐蔽性、细胞异质性、耐药性的特点,且肿瘤易侵袭、转移和复发,使得其临床治疗效果欠佳。转录因子AP-2α在肝癌中作为肿瘤抑制因子发挥作用,其表达与肝癌患者的预后呈现正相关。SOX9在细胞分化、性别决定和肿瘤发生中起主要作用。在肝癌细胞中,SOX9异常增加可以促进癌细胞的生长。本研究利用JASPAR软件预测到SOX9的启动子区域含有潜在的AP-2α结合位点,通过萤光素酶和凝胶迁移试验（EMSA）证实了AP-2α可以与SOX9的启动子区域直接结合,抑制SOX9的转录活性。通过实时定量PCR和蛋白质免疫印迹发现,AP-2α抑制了SOX9的mRNA和蛋白质水平表达。这些结果提示了AP-2α可与癌基因SOX9的启动子区域结合,负调控肝癌细胞中SOX9的表达。     

乙肝病毒X蛋白通过骨桥蛋白OPN促进肝癌细胞迁移

乙型肝炎病毒(HBV)感染与肝细胞癌(HCC)的发生具有十分密切的关系,乙肝病毒X蛋白(HBx)对HCC的发生和转移具有重要的作用.研究发现,骨桥蛋白(OPN)在许多肿瘤及其转移组织中高表达,与肿瘤转移密切相关.为了进一步阐明HBx在肝癌细胞迁移中的作用及其分子机制,以稳定表达HBx的肝癌细胞H7402-X为模型探讨了HBx与OPN的关系.结果发现,HBx可激活OPN启动子转录活性和上调OPN的mRNA表达."体外划痕"实验结果显示,HBx与肝癌细胞的迁移能力呈正相关.通过RNA干扰下调OPN的表达可抑制H7402-X细胞的迁移能力.本研究发现,HBx通过上调OPN的表达促进肝癌细胞迁移,对揭示肝癌转移的分子机制具有重要意义.     

p300通过homeobox结构域增强Nanog的转录激活活性

胚胎干细胞(ES细胞)能够不断地进行自我更新来维持其多能性,很多转录因子共同调控着ES细胞的自我更新和多能性,Nanog就是其中之一,然而Nanog维持ES细胞多能性的机制并不清楚。p300是真核生物中普遍存在的转录辅助因子,与许多转录因子共同作用调控下游基因的表达。为探索p300是不是能够影响Nanog的转录活性,我们在细胞中共转Nanog(或突变体)及报告基因和p300,结果表明p300能够通过homeobox结构域增强Nanog的转录激活活性。     

蛋白激酶B对活性氧调节7721人肝癌细胞生长的影响

以有义和反义人猛型超氧化物歧化酶（MnSOD）、蛋白激酶B（PKB）cDNA分别转染入7721肝癌细胞系建立高、低表达MnSOD和PKB的模型,通过改变细胞内、外源性活性氧和抗氧水平及PKB的活性,研究活性氧调节肝癌细胞生长过程中与PKB信号转导途径的关系。结果表明,低浓度外源性活性氧过氧化氢（1～10umol/L）应激及MnSOD低表达细胞中内源性活性氧水平升高,都可促进肝癌细胞增殖,而抗氧化剂丹参素(40mg/L）干预及MnSOD高表达使细胞内源性活性氧水平相对下降,都可一定程度抑制细胞的生长。采用^32P参入法检测细胞PKB酶活性,发现细胞内、外源性活性氧均能激活PKB,而采用抗氧化干预,能明显抑制PKB的酶活性。采用PT-PCR法检测AP-1转录因子组成成员c-fos和c-jun基因的mRNA表达,发现与PKB活性呈正比。说明活性氧在特定细胞内氧化/还原环境下可通过激活PKB途径传递信号、调控转录因子AP-1表达、促进肝癌细胞生长。     

FOS／JUN介导佛波酯对内皮素基因表达的诱导作用

利用凝胶电泳迁移率改变实验、RNA印迹和蛋白质印迹分析分别检查了c-jun抗体对内皮素-1(ET-1)基因AP-1位点与核蛋白结合的影响及肿瘤促进剂佛波酯(TPA)对c-fos/c-jun基因表达的作用.结果发现,c-jun抗体可使AP-1位点-核蛋白复合物的电泳迁移率发生改变,TPA显著促进c-fos/c-jun基因表达和血管内皮细胞的AP-1结合活性.实验表明,TPA对ET-1基因表达的诱导作用是通过促进AP-1转录因子c-fos/c-jun合成来介导的.     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚．为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58)．其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性．最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1 (由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体) 分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达．研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要．     

转录因子AP-2beta和p53蛋白相互作用的研究

转录因子p53与AP-2基因家族成员AP-2beta发生突变后,均会导致个体出现相应的疾病。本文首先利用两个重组质粒p CMV-HA-p53和p Myc-AP-2beta,转染永生化的胚胎肾细胞HEK293(野生型),在细胞中表达相应蛋白质。通过免疫共沉淀实验证明AP-2beta和p53蛋白在体内可以相互作用。并将梯度增加的p MycAP-2beta质粒及等量p CMV-HA-p53质粒转染到HEK293细胞,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明AP-2beta能正向调控p53蛋白的表达。为了进一步探讨AP-2beta与p53的作用机制,利用蛋白质合成抑制剂CHX(cycloheximide)处理转染了AP-2beta与p53表达质粒的细胞,实验结果说明,AP-2beta能增加p53蛋白的稳定性来调控p53的表达。     

人类不同类型细胞中X-盒结合蛋白1转录活性研究

人类X-盒结合蛋白1(X-box binding protein1,XBP1)作为一种重要的转录因子,在细胞中涉及了广泛的信号调控过程。为进一步研究XBP1的生物学功能,首先利用生物信息学技术确定XBP1基因的启动子区域和2个缺失突变体的基因序列,聚合酶链反应扩增XBP1启动子和2个缺失突变体的基因序列,分别克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建3个报告载体p1-XBP1p、p2-XBP1p和p3-XBP1p,确定启动子活性最强的序列,并以该序列分别转染正常人肝细胞L02、人肝母细胞瘤细胞HepG2、人肝癌细胞SMMC-7721、人类红白血病细胞K562、人皮肤成纤维细胞HSF和人贮脂细胞Lipocyte Ito Cell 6种不同类型的细胞后(FuGENE 6 transfection reagents),CAT-ELISA方法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)在不同细胞系中的表达活性。每一组CAT结果反应了XBP1启动子转录活性的大小,其中p3-XBP1p在HepG2细胞中活性最强,是pCAT3-Basic的12.4倍,其次是K562和SMMC-7721,分别是10.9倍和10.0倍;在L02细胞中CAT酶活性低于上述3种异常细胞,在HSF和Ito细胞中CAT酶活性低或没有活性。运用适时荧光PCR方法和免疫印迹分别从mRNA水平和蛋白水平检测了XBP1在不同细胞中的表达情况,结果均显示XBP1在HepG2、K562和SMMC-7721细胞中的转录和表达强于L02、HSF和Ito细胞,在HSF细胞和L02细胞中转录和表达较低,在Ito细胞中几乎检测不到XBP1的表达,与CAT-ELISA检测结果一致。因此,XBP1启动子的转录活性在不同细胞中是具有差异的,而XBP1启动子转录活性的大小直接调控下游基因XBP1的表达,导致不同细胞中XBP1的表达丰度也不相同,XBP1启动子的转录活性和表达与细胞类型、细胞周期和组织特异性密切相关。本研究发现XBP1启动子的ATG上游-227bp～66bp区域与XBP1的转录活性密切相关,属于XBP1启动子的核心区域;进一步比较XBP1基因核心启动子区在不同细胞中转录活性的差别和XBP1基因表达丰度的差异,为揭示真核细胞中XBP1的转录调控机制奠定基础。     

转录因子AP-2β与SLP-2的蛋白相互作用

AP-2β是转录因子AP-2家族中的重要一员.AP-2是一个与哺乳动物的发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生都有密切联系的重要的转录因子家族.最近的研究表明,AP-2能通过与其他蛋白的相互作用来调控AP-2下游基因的转录活性.采用免疫共沉淀结合质谱鉴定的方法筛选与AP-2β相互作用的蛋白.结果筛选到Stomatin like protein2(SLP-2)蛋白可能与AP-2β相互作用.免疫共沉淀实验证实外源过表达和内源的SLP-2蛋白都能与AP-2β蛋白相互作用.而且,细胞免疫荧光实验发现外源表达的Myc-AP-2β蛋白与内源的SLP-2蛋白在MCF-7细胞的胞质中有共定位.此外,免疫印记实验结果表明过表达SLP-2能上调AP-2β的蛋白水平,这就表明SLP-2与AP-2β相互作用后,SLP-2可能使AP-2β蛋白更稳定.这些研究结果为进一步研究这两个基因的功能提供了新的切入点.     

IKKα通过不同机制介导生长促进和生长抑制信号诱导的c-Fos表达和AP-1活化

目的:探讨IKK激酶催化亚基IKKα在分别介导生长促进信号(血清)和生长抑制信号(紫外线UVB)诱导的反应中,调控转录因子AP-1关键组成亚基c-Fos实现诱导表达的信号传递机制。方法:分别采用Western印迹、RT-PCR和萤光素酶报道分析系统检测血清和紫外线刺激反应状态下IKKα对c-Fos诱导表达和AP-1诱导活化的调控作用;通过转染I-κBα功能抑制型突变体I-κBα-AA,观察NF-κB诱导活化受抑时,c-Fos诱导表达和AP-1诱导活化水平的改变情况。结果:IKKα在生长促进和生长抑制信号诱导的反应中,都能够实现对转录因子AP-1及其关键组成亚基c-Fos诱导表达的调控作用。其中,在血清反应中IKKα可通过NF-κB依赖方式在转录水平调控c-Fos的诱导表达,而在UVB反应中IKKα通过转录非依赖方式调控c-Fos的诱导表达。结论:IKKα能分别以NF-κB依赖和非依赖方式参与调控生长促进和生长抑制信号诱导的反应。     

鳖甲煎丸通过LncRNA-mRNA顺式调控抑制肝癌细胞

为了研究鳖甲煎丸抑制肝癌细胞过程中lncRNA表达谱的变化及lncRNA-mRNA顺式调控在其中的机制,本研究通过CCK8方法检测鳖甲煎丸作用于SMMC-7721细胞后的增殖活性变化,经全细胞转录组学分析lncRNA的表达和特征后构建LncRNA-mRNA顺式调控网络.结果表明鳖甲煎丸含药血清作用肝癌细胞株后其增殖活性受到抑制.全细胞转录组学分析找到差异表达的172个LncRNA.构建lncRNA-mRNA顺式调控网络,对调控基因进行生存分析发现,SCRN1、PLEKHA1、HNRNPM、TMEM107、ETNK1、ISG20L2的表达与肝细胞癌患者生存率显著负相关(P＜0.05).因此得出结论,LncRNA参与鳖甲煎丸抑制肝癌细胞增殖的过程,LncRNA-mRNA顺式调控是其分子机制之一.     

硒对转录因子的调控

近年来,国际上对硒的研究逐渐成为热点,因为发现硒对细胞增生、恶性肿瘤的形成和治疗以及细胞凋亡等重大问题的阐明均有重大的意义。随着研究的深入发现硒能调控转录因子,其调控机制也截止来越清晰。该介绍近向导年来对硒调控NF-κB、AP-1、p53、MAZ等转录因子方面的研究进展。     

骨桥蛋白通过调控MMP-2和VEGF参与肝癌细胞侵袭的机制研究

目的：骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）在肝癌细胞侵袭中的作用机制。方法：采用siRNA干涉的方法处理人肝癌细胞,用PCR和Western-blot法检测OPN的表达;用transwell小室检测不同处理后的HepG2和MHCC97H细胞的侵袭能力;采用Western．b1．ot和ELISA方法检测基质金属蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2,MMP-2）和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）蛋白表达和活力的变化情况。结果：在不同肝癌细胞系中,随着肝癌细胞系侵袭能力的增强,OPN的表达逐渐增高。siRNA可以降低HepG2和MHCC97H细胞中OPN的表达,并且能够降低HepG2和MHCC97H细胞的侵袭能力;抑制OPN的表达能够降低MMP-2和VEGF蛋白表达和蛋白活性。结论：OPN在肝癌侵袭过程中起着重要作用,其作用机制可能是通过调控MMP-2和VEGF蛋白表达和活性来参与肝癌的侵袭,OPN可作为肝癌侵袭转移治疗的新靶点。     

薯蓣皂苷激活p38MAPK/FOXO3a信号抑制三阴性乳腺癌细胞上皮–间质转化及侵袭

该研究探讨了薯蓣皂苷(Dioscin)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231、BT549细胞体外侵袭及上皮–间质转化(epithelial to mensenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制。以正常人乳腺上皮MCF-10A细胞为对照,通过MTS法、克隆形成实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力;Western blot法检测p38MAPK、p-p38MAPK、FOXO3a及上皮–间质转化(epithelial to mensenchymal transition,EMT)相关标志物的表达。结果显示,Dioscin能明显抑制MDA-MB-231、BT549细胞的增殖,且具有浓度依赖性,对MCF-10A细胞抑制作用较弱;Dioscin处理后肿瘤细胞的侵袭、迁移能力明显降低,Dioscin可显著下调细胞间质样标志物波形蛋白(vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)并促进上皮样标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达,EMT关键转录因子Snail的表达也受到抑制。进一步研究发现,Dioscin能够上调p38MAPK磷酸化水平并促进转录因子FOXO3a的表达,而干扰FOXO3a能够逆转Dioscin对细胞EMT及侵袭的抑制作用。以上研究表明,Dioscin能够抑制三阴性乳腺癌细胞EMT及体外侵袭、迁移能力,其机制可能与Dioscin调控p38MAPK/FOXO3a信号有关。     

NAIF1对肝癌细胞 HepG2 增殖与迁移能力的影响

目的:在肝癌细胞Hep G2中过表达外源NAIF1(核凋亡诱导因子1),探讨NAIF1的亚细胞定位以及对Hep G2增殖和迁移能力的影响。方法:以真核表达质粒p EGFP-N1为对照组,p EGFP-N1-NAIF1为实验组,瞬时转染肝癌细胞Hep G2,利用免疫印迹方法检测NAIF1蛋白表达效率;以DAPI染核,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定位,确定NAIF1的亚细胞定位;通过MTT方法绘制细胞增殖曲线;通过transwell小室法检测NAIF1对Hep G2迁移能力的影响。结果:在肝癌细胞Hep G2中,外源表达NAIF1主要定位于细胞核;与对照组Hep G2/p EGFP-N1相比,Hep G2/p EGFP-N1-NAIF1的细胞增殖、迁移能力下降(P<0.05)。结论:外源表达NAIF1蛋白定位于Hep G2细胞核,过表达NAIF1抑制Hep G2的细胞增殖与迁移能力,NAIF1可能作为肝癌治疗的潜在靶点。