T7 RNA聚合酶基因表达系统在鱼腥藻7120中构建及hG-CSF的表达

外源基因的表达效率低是蓝藻基因工程发展的瓶颈之一,T7 RNA聚合酶表达系统实现了大肠杆菌中外源基因的高效表达,蓝藻与大肠杆菌同为革兰氏阴性菌,具有较高的遗传同源性,在蓝藻中构建T7 RNA聚合酶表达系统有可能提高外源基因在蓝藻中的表达效率。为了在鱼腥藻7120中构建T7 RNA聚合酶表达系统,采用重叠延伸PCR技术和酶切连接等方法构建能够表达T7 RNA聚合酶的定点整合载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2以及由T7启动子驱动hG-CSF基因表达的穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF;采用电击转化法将定点整合载体导入野生型鱼腥藻中,通过三亲接合的方法将穿梭表达载体转入已定点整合T7 RNA聚合酶的转基因鱼腥藻中。利用PCR技术鉴定外源基因在蓝藻中的存在;RT-PCR方法检测外源基因在蓝藻中的转录情况;Western blotting实验检测外源基因在蓝藻中的蛋白表达情况。结果表明两种载体构建成功,T7 RNA聚合酶基因和hG-CSF基因被转入鱼腥藻中,两个基因均在藻中表达,T7 RNA聚合酶表达系统在鱼腥藻中构建成功,与传统蓝藻表达系统相比,文中在鱼腥藻中构建的T7表达系统使hG-CSF基因的表达量提高2倍。该表达系统将为蓝藻基因工程的应用提供更优的工具,将促进蓝藻作为底盘细胞在合成生物学等领域的发展。     

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mpl8RFDNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7 RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬茵体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F',因子从大脑杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大脑杆菌菌株HMSl74F,,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。