H2O2诱导的2BS早老细胞中自噬体增多

自噬在细胞复制性衰老中起着重要的作用.然而,早老细胞中的自噬现象基本无相关的报道.本文通过外源性过氧化氢(H₂O₂)的诱导,构建人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS细胞）早老模型.首先,通过SA-β-gal染色,验证细胞早老;从形态学和特异标志分子及雷帕霉素作用的靶位点(mTOR)信号通路不同角度检测自噬的变化,其中形态学检测包括丹（磺）酰戊二胺(MDC)自噬分子定量法及电镜自噬超微结构的观察;特异标志分子LC3的检测包括GFP-LC3自噬定位法和免疫印迹法检测LC3;及检测mTOR信号通路下游激酶p70S6蛋白的表达变化.结果表明,过氧化氢诱导的早老细胞中自噬体相对年轻细胞明显增多,且具有保护早老细胞的作用.     

Bel-7402细胞通过自噬逃避FAS/ActD诱导的凋亡

为了探究FAS抗体与放线菌素D（actinomycin D,ActD）诱导肝癌细胞Bel-7402凋亡的作用机制,通过自噬阻断剂3-MA的作用,来探讨自噬与凋亡的关系.利用电子显微镜和流式细胞仪观察细胞自噬及凋亡.结果表明,FAS/ActD在诱导细胞凋亡的同时伴有细胞自噬现象,在3-MA作用下,FAS/ActD所诱导的细胞自噬体减少,而凋亡现象严重.并且通过流式细胞仪分析表明,3-MA明显增高FAS/ActD所诱导的细胞凋亡率. Western印迹分析进一步显示,FAS/ActD能引起caspase-3激活产生断裂,同时刺激LC3和BECN1表达,而3-MA作用后自噬体减少,同时LC3和BECN1表达降低,但是caspase-3断裂带表达明显增加.以上结果提示,FAS/ActD诱导的Bel-7402细胞凋亡的同时伴有细胞自噬,Bel-7402细胞通过自噬逃避FAS/ActD诱导的凋亡.     

细胞自噬对酒精诱导的肝细胞毒性的保护作用

目的：研究细胞自噬对酒精诱导的人肝细胞系（CL-1）的保护作用。方法：培养正常肝细胞系CL-1细胞,80mmol／L酒精常规处理24小时,采用CCK-8法观察酒精对细胞活力的影响;流式细胞技术观察酒精对细胞凋亡的影响;免疫蛋白印迹及转染GFP-LC3法检测细胞自噬水平;选用rapamycin和3-MA调节细胞自噬,观察酒精处理后细胞活力及凋亡的变化。结果：酒精处理体外培养的CL-1细胞,实验组较对照组细胞活力下降（P〈0．05）;实验组细胞46．2％发生凋亡,显著高于对照组8．4％;LC3II及Beclinl水平显著高于对照组;GFP-LC3荧光数显著高于对照组（P〈0．05）;调节细胞自噬水平,rapamycin组细胞活性增加（P〈0．01）,31．1％（46．2％）细胞发生凋亡;3-MA组细胞活性降低（P〈0．05）,54．1％（46．2％）细胞发生凋亡。结论：酒精处理降低CL-1细胞活性,促进凋亡,提高自噬水平;提高或降低细胞自噬水平,细胞凋亡及活力随之降低和增加;细胞自噬能够对抗酒精诱导的肝细胞凋亡。     

磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)参与了曲格列酮诱导的HeLa细胞自噬和凋亡

【目的】明确磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)在细胞自噬和凋亡中的作用。【方法】利用电镜、荧光显微镜、蛋白免疫杂交、siRNA干扰、流式细胞计数、MTS细胞活性检测等对曲格列酮(troglitazone,TZ)处理的HeLa细胞自噬和凋亡情况进行了检测。【结果】不同检测方法均表明TZ增加了HeLa细胞的自噬,这种自噬的发生伴随着AMPK的磷酸化的降低;抑制AMPK增加基础细胞自噬,而阻断了TZ引起的自噬标记物LC3-II的增加,同时也减少了TZ引起的凋亡分子PARP的切割;用自噬抑制剂3-MA和干扰细胞自噬基因,不仅PARP的切割明显地受到抑制,而且也部分阻断了TZ引起的细胞活性丧失。【结论】AMPK直接参与了TZ引起的HeLa细胞自噬过程,这种自噬发生促进了其诱导的细胞凋亡。     

小豆蔻明调控自噬抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的研究

目的：卵巢癌为女性常见病,死亡率高,分子靶向治疗药物较少,研发高效低毒的靶向新药意义重大。细胞自噬（autophagy）维持着细胞内稳态和生长,是抗癌药物作用的关键靶部位。本课题旨在明确小豆蔻明（Cardamonin,CAR）调控自噬对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。方法：体外培养卵巢癌SKOV3细胞,不同药物分组处理,荧光显微镜下观察单黄酰戊二胺（MDC）染色后细胞自噬囊泡,WesternBlot法检测细胞自噬相关蛋白LC3的表达,四氮唑蓝（MTT）法观察SKOV3细胞增殖情况,流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡的变化。结果：自噬抑制剂3-MA显著性降低SKOV3细胞内MDC染色的荧光颗粒数目、LC3II蛋白表达,抑制细胞增殖;而CAR（高、中剂量）、雷帕霉素和AZD8055与3-MA联用后细胞内MDC荧光颗粒数目增多、LC3II蛋白表达增加、细胞增殖抑制率及凋亡率明显升高;且高剂量CAR（10^-6mol·L^-1）的作用比低剂量CAR（10^-6mol·L^-1）明显。结论：CAR能够抑制SKOV3细胞增殖,诱导细胞自噬,促进细胞凋亡。CAR有望成为卵巢癌药物治疗的先导化合物。本研究为进一步研发此类化合物提供了实验依据及一定的理论基础。     

人表皮角质形成细胞自噬功能细胞模型的构建及鉴定

目的: 建立稳定表达GFP-LC3的人永生化角质形成细胞HaCaT细胞系。方法: 将构建的pcDNA3.1-GFP-LC3 真核表达载体转入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达的细胞系。HaCaT细胞中GFP-LC3的表达分别用荧光显微镜与Western blot方法检测,并利用该稳定表达的细胞系观察验证Rapamycin对细胞发生自噬透射电镜超微结构的变化。结果: 获得了3株转染并经G418反复筛选的HaCaT细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光细胞的表达率在95% 以上,Western blot结果证实了GFP-LC3融合蛋白的表达。Western blot和激光共聚焦显微镜均证明Rapamycin可以诱导自噬的发生。透射电镜细胞超微结构的观察表明Rapamycin可以有效地诱导HaCaT-LC3细胞自噬的发生。结论: 成功构建GFP-LC3稳定表达的HaCaT系,该细胞系可以作为研究人角质形成细胞自噬功能的一种细胞模型。     

小豆蔻明调控自噬抑制卵巢癌SKOV3 细胞增殖的研究

目的：卵巢癌为女性常见病,死亡率高,分子靶向治疗药物较少,研发高效低毒的靶向新药意义重大。细胞自噬（autophagy） 维持着细胞内稳态和生长,是抗癌药物作用的关键靶部位。本课题旨在明确小豆蔻明（Cardamonin,CAR）调控自噬对卵巢癌 SKOV3 细胞增殖的影响。方法：体外培养卵巢癌SKOV3 细胞,不同药物分组处理,荧光显微镜下观察单黄酰戊二胺（MDC）染色 后细胞自噬囊泡,Western Blot 法检测细胞自噬相关蛋白LC3的表达,四氮唑蓝（MTT）法观察SKOV3 细胞增殖情况,流式细胞 术检测SKOV3 细胞凋亡的变化。结果：自噬抑制剂3-MA 显著性降低SKOV3 细胞内MDC染色的荧光颗粒数目、LC3Ⅱ蛋白表 达,抑制细胞增殖;而CAR（高、中剂量）、雷帕霉素和AZD8055 与3-MA 联用后细胞内MDC荧光颗粒数目增多、LC3Ⅱ蛋白表达 增加、细胞增殖抑制率及凋亡率明显升高;且高剂量CAR（10-5mol·L-1）的作用比低剂量CAR（10-6mol·L-1）明显。结论：CAR能够 抑制SKOV3 细胞增殖,诱导细胞自噬,促进细胞凋亡。CAR有望成为卵巢癌药物治疗的先导化合物。本研究为进一步研发此类 化合物提供了实验依据及一定的理论基础。     

ASPP2以p53非依赖形式促进自噬引起Hep3B细胞凋亡

p53凋亡刺激蛋白2（apoptosis stimulating protein 2 of p53, ASPP2）能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡的功能,进而发挥抗肿瘤作用. 本室前期研究发现,ASPP2可以通过p53-DRAM自噬途径诱导细胞凋亡. 在本研究中,利用ASPP2 腺病毒感染Hep3B细胞(p53缺陷型肝癌细胞系)并用甲基磺酸(MMS)处理后; Calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡;GFP-LC3质粒转染细胞后检测自噬; 荧光定量PCR和免疫印迹检测自噬基因表达. 结果表明,ASPP2在p53缺陷的Hep3B细胞内可诱导发生凋亡;在MMS存在和缺失条件下, Adr-ASPP2均引起自噬体水平升高及自噬基因的表达增 加,且MMS协同Adr-ASPP2能使自噬水平增加; 进一步用VPS34 siRNA和DRAM siRNA抑 制自噬发现,细胞凋亡水平下降, 说明由Adr-ASPP2诱发经损伤相关自噬调节蛋白（ DRAM）介导的自噬参与了肝癌细胞系凋亡的发生. 综上结果表明,ASPP2可以通过非p53依赖的DRAM介导自噬,并促进肝癌细胞凋亡. 该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.     

自噬抑制剂3-MA上调H2O2损伤的PC12细胞氧化应激水平

为探究自噬抑制剂6-氨基-3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）对损伤细胞氧化应激水平的影响,将3-MA作用于H2O2诱导的PC12细胞损伤模型,以自噬增强剂雷帕霉素（rapamycin,Rap）作为对照,探讨自噬与氧化应激的关系。测定线粒体的膜电位和细胞内的活性氧（reactive oxygen species, ROS）与丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,评价损伤细胞的氧化应激状态。单丹(磺)酰戊二胺（monodansylcadaverine,MDC）染色,观察损伤细胞的自噬情况。蛋白质印迹分析损伤细胞中的自噬相关蛋白质LC3-II/LC3-I比值变化。实验结果显示：与正常组相比,H2O2损伤细胞的ROS水平上升到正常组的141%,MDA含量增加(P<0.001);CAT与SOD酶活力显著降低(P<0.001),差异均有统计学意义,证明损伤细胞氧化应激水平增加;MDC染色结果表明,H2O2组自噬明显增加。Western印迹结果表明,LC3-II/LC3-I值显著升高（P<0.05）;与损伤组相比,3-MA组MDC染色结果表明,自噬水平降低。Western印迹结果表明,LC3-II/LC3-I值下降;细胞内ROS水平升高,增加到正常组的208%。MDA含量增加(P<0.001),CAT、SOD酶活力降低(P<0.001)。综上结果表明,自噬抑制剂可增加H2O2诱导的PC12细胞损伤模型的氧化应激水平,增加细胞凋亡。     

白假丝酵母激活的巨噬细胞自噬 促进MHCⅡ抗原提呈

目的探究白假丝酵母(Candida albicans)激活的Raw264.7细胞自噬在主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHCⅡ)抗原提呈以及协同刺激分子表达中的作用。方法 C.albicans刺激Dectin-1单克隆抗体封闭或白皮杉醇阻断的Raw264.7细胞,Western blot法检测LC3Ⅱ表达量,RT-PCR检测CD80与CD86的表达。免疫荧光实验观察有无3-MA预处理的GFP-LC3-Raw264.7细胞与C.albicans共孵育后MHCⅡ与LC3在胞浆的分布,ELISA法检测有无封闭Dectin-1或3-MA预处理的Raw264.7细胞与C.albicans共孵育不同时间段后IL-6的分泌。结果阻断Dectin-1或Sky后C.albicans诱导的LC3Ⅱ表达降低。LC3、MHCⅡ与胞内C.albicans存在显著的共定位关系,阻断自噬后C.albicans与MHCⅡ的共定位明显减弱。C.albicans引发Raw264.7细胞表达CD80与CD86mRNA,封闭Dectin-1或阻断自噬后二者转录水平降低。C.albicans通过Dectin-1引发Raw264.7细胞分泌IL-6,阻断自噬对IL-6分泌无显著影响。结论 C.albicans通过Dectin-1/Sky通路激活巨噬细胞自噬,自噬体的构建促进MHCⅡ招募至胞内C.albicans,并促进协同刺激分子的表达。     

低氧对血清剥夺后山羊颞下颌关节盘细胞凋亡和自噬的影响

该研究体外分离山羊颞下颌关节盘(temporomandibular joint disc,TMJ disc)细胞并培养至p2代。通过HE(Hematoxylin-Eosin)染色、Hoechst 33258和丹磺酰戊二胺(dansylcadaverine,MDC)荧光染色观察血清剥夺后细胞的形态学变化以及是否存在自噬和凋亡。随后,通过流式细胞术和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)分别检测血清剥夺0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h后细胞的凋亡率和自噬水平的变化以及加入自噬抑制剂3-MA(3-methyladenine)后的凋亡变化。检测给予血清(10%FBS)或血清剥夺(0%FBS)的细胞在常氧(21%O2)或低氧(2%O2)条件下的凋亡和自噬的变化。结果发现:血清剥夺后,凋亡率随时间的延长逐渐上升,自噬率先上升后下降;当血清剥夺诱导的自噬被3-MA抑制后,细胞的凋亡率明显上升。自噬能够抑制血清剥夺引起的细胞凋亡,说明自噬在细胞的存活中有很重要的作用。与常氧培养的细胞相比,低氧条件下细胞的凋亡率和自噬率均下降。低氧通过降低细胞的过度自噬减少长期血清剥夺引起的细胞凋亡,比常氧更有利于细胞的存活。     

抑制自噬促进冬凌草甲素诱导的多发性骨髓瘤细胞凋亡涉及胞内ROS产生

目的本实验主要研究冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤发生自噬、凋亡,两者之间的关系以及所涉及的相关机制。方法利用MTT比色法检测冬凌草甲素对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖活性影响;透视电镜观察细胞内凋亡和自噬的形态学改变;TUNEL检测细胞凋亡;分别利用以下技术检测处理后的细胞内的自噬变化:使用QDs605nm-Anti-LC3荧光探针以及免疫荧光技术定位细胞胞内LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白,利用western blot免疫印记技术检测Beclin 1蛋白表达水平;利用DCFH-DA探针以及流式细胞术检测细胞胞内ROS水平。结果冬凌草甲素能明显抑制RPMI8226细胞增殖,其抑制作用呈时间、剂量依赖性;冬凌草甲素能同时诱发细胞凋亡、自噬和胞内ROS产生;NAC完全抑制胞内ROS产生后冬凌草甲素诱导的细胞凋亡消失;3-MA抑制自噬后,冬凌草甲素诱导的胞内ROS产生进一步增多,凋亡增多。结论冬凌草甲素能明显抑制RPMI8226细胞增殖;冬凌草甲素同时诱发细胞凋亡和自噬;胞内ROS产生介导冬凌草甲素诱导的凋亡;凋亡为细胞死亡的主要途径,而自噬通过下调胞内ROS产生抑制凋亡。     

硫链丝菌素诱导非小细胞肺癌细胞自噬性死亡

自噬在细胞的生命过程中起了非常重要的作用,它能通过清除受损的细胞器和过多的蛋白质以维持细胞内环境稳定基本能量代谢的稳定。然而,自噬的持续激活可导致细胞器以及必需的蛋白质的过度消耗,导致不依赖caspase的自噬性细胞死亡。因此,通过这种自噬途径诱导细胞死亡可能是癌症治疗的一种新方法。在本研究我们发现,硫链丝菌素能够减少非小细胞肺癌PC-9细胞的细胞活力和诱导细胞凋亡。另外,我们发现硫链丝菌素诱导了PC-9细胞自噬。此外,我们也发现硫链丝菌素诱导的细胞凋亡可以被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻止。这些结果表明,硫链丝菌素促进人体非小细胞肺癌细胞的自噬性死亡。在本研究我们的发现也提示硫链丝菌素联合自噬诱导剂可能在临床上对治疗人非小细胞肺癌有效。     

ASPP2过表达可增强DRAM介导的自噬对HepG2细胞的促调亡作用

p53凋亡刺激蛋白2（apoptosis stimulating protein 2 of p53, ASPP2）能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡功能,进而发挥抗肿瘤作用.最近文献提示,自噬对肿瘤发生、发展及肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应都具有重要作用.在本研究中,甲基磺酸(MMS)处理HepG2细胞24 h后,用calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡,可引起早期（M30免疫组化阳性）和晚期细胞凋亡（PI染色阳性）. 给HepG2细胞转染GFP-LC3质粒后,发现MMS处理24 h可引起自噬的发生. ASPP2腺病毒（rAd-ASPP2）感染HepG2细胞引起ASPP2过表达后,再用MMS处理24 h,能引起更明显的早期、晚期细胞凋亡和自噬. 荧光定量PCR检测发现,rAd-ASPP2诱导了更高的BCL-2相关X蛋白基因（BAX）和p53蛋白的目的基因p53诱导的自噬调节蛋白（p53-induced modulator of autophagy,DRAM）的表达. 但仅用rAd-ASPP2处理HepG2细胞不能引起自噬和凋亡.利用2条DRAM特异性的siRNA下调DRAM的表达,发现rAd-ASPP2引起的自噬被完全抑制, 早期和晚期凋亡均部分被抑制,同时BAX 的mRNA水平也明显下降. 以上结果说明,ASPP2可通过上调BAX和DRAM基因的转录而促进MMS引起的HepG2细胞凋亡; 另外,DRAM介导的自噬是ASPP2促进MMS引起的肿瘤细胞凋亡的机制之一. 该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.     

自噬对高糖诱导的人冠状动脉内皮细胞凋亡的保护作用

目的:研究自噬对高糖诱导的人冠状动脉内皮细胞凋亡的影响。方法:将人冠状动脉内皮细胞,分别用常规培养基(正常对照组)、含30 mmol/L D-葡萄糖的高糖培养基(高糖组)、高糖培养基合并雷帕霉素(Rapamycin,RAPA;100 nmol/L)干预(RAPA组)和高糖培养基合并3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,5 mmol/L)干预(3-MA组)培养。利用CCK-8法检测细胞生长活力,使用流式细胞术检测细胞凋亡水平,western blot检测细胞自噬标记蛋白(Beclin1)的表达水平。结果:(1)高糖溶液刺激内皮细胞24 h后,细胞生长活力为正常组的55.0%(P0.01),自噬标记蛋白Beclin1的表达水平明显增加,凋亡水平为正常组的2.0倍;(2)与高糖组相比,RAPA组细胞生长活力明显增加,Beclin1的表达明显升高(P0.01),凋亡水平为高糖组的70.1%;(3)与高糖组相比,3-MA组细胞生长活力明显减少,Beclin1的表达明显降低(P0.01),凋亡水平为高糖组的1.42倍。结论:细胞自噬可能对高糖诱导的人冠状动脉内皮细胞具有凋亡保护作用。     

MERS冠状病毒3C样蛋白酶是一种新的细胞自噬诱导蛋白

冠状病毒（Coronavirus, CoV）3C样蛋白酶（3CLpro）在冠状病毒复制过程中起重要作用,是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一,但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病性冠状病毒 --中东呼吸综合征冠状病毒（MERS CoV）为研究对象,探讨人类冠状病毒感染与细胞自噬的关系。通过免疫荧光法检测发现,MERS 3CLpro引起细胞内eGFP-LC3B绿色荧光点状聚集,同时MERS 3CLpro诱导自噬标志蛋白微管相关蛋白1-轻链3基 (LC3-II)表达增多,表明MERS 3CLpro可激活细胞自噬。进一步研究发现,MERS 3CLpro诱导细胞自噬体形成而阻断或抑制自噬溶酶体形成,即MERS 3CLpro诱导不完全细胞自噬效应,而且MERS 3CLpro诱导细胞自噬具有时间依赖性且不依赖于其蛋白酶催化活性。此外发现SARS CoV和NL63 CoV等其它人类冠状病毒3CLpro也具有诱导细胞自噬效应,表明3CLpro诱导细胞自噬可能是人类冠状病毒所具有的一种普遍生物学特性。本研究首次发现冠状病毒蛋白酶3CLpro能诱导宿主细胞自噬,是一种新型冠状病毒来源的宿主细胞自噬诱导蛋白,这一发现拓展了对人类冠状病毒蛋白酶功能的新认识,为研究冠状病毒与宿主抗病毒天然免疫以及以病毒蛋白酶为靶标的抗病毒药物研究提供了理论基础。     

氯喹抑制自噬增强宫颈癌细胞SiHa对CPT处理的敏感性

自噬诱导是肿瘤细胞对化疗药物抵抗性的原因之一,该研究探讨溶酶体抑制剂氯喹对喜树碱(camptothecin,CPT)诱导的宫颈癌细胞Si Ha死亡的增敏效果。CPT和/或氯喹处理宫颈癌Si Ha细胞,MTT法检测细胞增殖,DAPI和TUNEL染色观察细胞凋亡,Western blot和免疫荧光检测自噬及凋亡相关蛋白。结果发现,CPT处理后,Si Ha细胞MAP1LC3B荧光点和LC3II(microtubuleassociated protein light chain 3II)蛋白水平增加,p62荧光点和蛋白质水平则减少;而采用氯喹特异抑制自噬后,可明显提高CPT诱导的细胞凋亡、caspase-9的激活和PARP(poly ADP-ribose polymerase)的切割,而全长caspase-2水平显著下降。以上结果提示,氯喹可通过抑制细胞自噬而增强宫颈癌细胞株Si Ha对CPT诱导细胞凋亡的敏感性。     

mTOR信号通路诱导的自噬在心肌细胞缺氧损伤中的作用研究

目的:探讨自噬在心肌细胞缺氧损伤中的作用及分子机制。方法:体外分离培养乳鼠心肌细胞,体外建立缺氧/去血清(H/SD)模型以模拟在体的缺血环境。分别给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3MA,5 mM)和mTOR抑制剂雷帕霉素(1.0μg/L)调节心肌细胞自噬水平。分别采用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,Western blot方法检测心肌细胞蛋白表达水平。结果:H/SD损伤可以显著诱导心肌细胞自噬水平(P0.05),并且细胞自噬水平可以被3-MA及雷帕霉素调节。同时,H/SD可以显著增加心肌细胞凋亡(P0.05),而给予3-MA抑制自噬水平可以减少细胞凋亡(P0.05)。相反,雷帕霉素增加自噬同样可以加重缺氧导致的心肌细胞凋亡(P0.05)。H/SD损伤过程中,心肌细胞mTOR信号通路被激活,而自噬抑制剂3-MA可以显著提高缺氧条件下心肌细胞中p-mTOR(Ser2448)的表达水平(P0.05),并增加mTOR下游分子p-p70S6k(P0.05)和p-S6(P0.05)的表达。结论:mTOR信号通路诱导的细胞自噬可能参与了缺氧损伤诱导的心肌细胞凋亡。     

结晶型硫化镍通过自噬途径诱导16HBE细胞恶性转化癌变

镍化合物广泛存在于人类职业环境中,是人类发生肺癌的主要危险因素。我们前期研究已证实金属毒物结晶型硫化镍(NiS)的暴露是发生肺癌的重要病因,但具体的致癌机制仍未明了。本研究利用前期建立的结晶型 NiS 恶性转化人支气管上皮细胞的细胞模型,首次采用激光共聚焦扫描显微镜成像技术,在无损伤状态下,实时观测恶性转化细胞(16HBE-T)和正常细胞(16HBE-N)中自噬体标记蛋白 GFP-LC3 的荧光强度及定位,并利用 Western Blotting 技术检测细胞内自噬信号通路关键效应分子的表达。共聚焦实验结果表明:16HBE-T 细胞与 16HBE-N 细胞相比,GFP-LC3 蛋白的点状聚集明显减少,经测量只有 16HBE-N 细胞的 1/3 左右,表明自噬水平下降;Western Blotting 检测发现:mTOR 激酶活性上升,Beclin 1 表达下降。上述结果证明,结晶型 NiS可通过多个自噬途径参与诱导 16HBE 细胞恶性转化的癌变过程,将为预防和治疗肺癌提供重要信息。     

PFKFB3参与了11'-deoxyverticillin A(C42)诱导的HeLa细胞自噬和凋亡

摘要:【目的】明确糖酵解调节基因PFKFB3参与11-脱氧轮枝菌素A(11'-deoxyverticillin A,C42)诱导HeLa细胞自噬和凋亡中的作用。【方法】利用电镜、荧光显微镜、蛋白免疫杂交、转染、MTS 活性检测、siRNA干扰、定量RT-PCR等对C42处理的HeLa 细胞自噬和凋亡情况进行了检测。【结果】C42能够引起HeLa细胞不同的死亡。敲降自噬关键基因BECN1或LC3后,明显增加PARP-1的切割和促进C42引起的细胞活性丢失。尽管高浓度C42能更明显地抑制细胞增殖,但却不能增加细胞的自噬流;C42促进的自噬能被糖酵解调节基因PFKFB3的抑制剂所降低;而过量表达糖酵解调节基因PFKFB3能促进细胞自噬。【结论】糖酵解调节基因PFKFB3直接参与了C42诱导的HeLa细胞自噬,这种自噬的发生抑制了其诱导的细胞凋亡。