大肠杆菌表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化及其二聚体分析

采用阴离子交换和凝胶过滤色谱法纯化大肠杆菌高密度培养所表达的重组葡激酶－水蛭素融合蛋白（rSFH）,经SDS-PAGE和RP-HPLC分析纯度达到98％以上,每升发酵液得率约0.7g。同时利用疏水色谱、MALDI-TOF对纯化过程中出现的rSFH同源二聚体的分析和表面疏水面积的计算及利用高效排阻色谱（HPSEC）分析NaCl、温度对rSFH的可逆二聚化行为的影响,认为疏水作用在rSFH的可逆二聚化行为中发挥着重要作用。     

重组葡激酶和水蛭素融合蛋白的血栓靶向性机制

为解释以凝血因子Xa(FXa)的识别序列为连接肽的葡激酶和水蛭素的融合蛋白(命名为SFH)在体内的强溶栓和低出血的特征,研究分析了SFH的两个血栓靶向性作用机理.首先采用ELISA和免疫组化的方法在体外分析了由水蛭素游离的C末端赋予的SFH对血栓的靶向性,结果显示SFH对凝血酶和富含凝血酶的血栓具有更高的亲和力.为阐明SFH抗凝活性在血栓部位的靶向性释放,构建表达了仅在水蛭素N末端连接FXa识别序列的水蛭素衍生物(命名为FH).体外试验结果表明完整的FH无抗凝活性,在体内FH可以发挥抗栓作用,且出血副作用较低,这些结果说明FXa的识别序列可以封闭水蛭素的抗凝活性,在体内FH可以由于FXa的成功裂解而释放其抗凝活性,且其抗凝活性可能仅局限于血栓局部.这就间接说明了SFH的抗凝活性可以在血栓局部进行靶向性释放.以上两个血栓靶向性作用机理是SFH在体内发挥更高溶栓效率和降低出血副作用的重要机制.     

重组大肠杆菌高密度培养研究进展

大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达,表达水平有些高达细胞总蛋白的３０％以上,为了提高单位体积设备产物的产量,除了提高表达水平外,还需提高重组大肠杆菌的培养密度。大肠杆菌高密度培养的早期工作主要是以宿主菌为模型进行研究的,而近年来,重组大肠杆菌高密度高表达的研究已经有了较大进展。本文着重综述了培养基成分、溶氧、比生长速率和代谢副产物乙酸等因素对工程菌生长和表达的影响,及提高菌密度和表达水平的培养方法。     

重组葡激酶工程菌的构建方法

目的：利用N端缺失10个氨基酸的葡激酶（recombinant staphylokinase,rSaK）重组质粒,构建了表达可溶性rSaK126蛋白的工程菌,并研究不同条件下工程菌诱导表达目的蛋白含量的差异及纯化途径。 方法：采用细菌活化和培养方法诱导目的蛋白,并用SDS-PAGE测其含量,应用层析技术纯化蛋白。 结果：成功构建表达重组葡激酶的工程菌,表达的重组葡激酶蛋白约占菌体总蛋白的50％,经纯化后回收率为60%,纯度达99%以上。结论：成功构建高效表达重组葡激酶的工程菌,并获得了高含量、高纯度的目的蛋白。     

重组大肠杆菌高密度培养研究进展

重组大肠杆菌细胞高密度培养(High cell-density cultivation,HCDC)是获得高外源蛋白产率的一种重要策略,影响重组大肠杆菌高密度培养的因素主要有以下几个方面:重组体的构建及其稳定性,培养基成分,培养方式,培养条件及培养过程中抑制性代谢产物的积累等。从以上几个方面对近期的研究进展进行了综述。     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg^2＋浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明,在优化后的培养基中,磷酸盐浓度、Mg^2＋浓度分别为80mmol/L 与20mmol/L时菌体生长与表达效果较好;分批补料培养中,37℃培养9h菌体达到对数期中期(约45OD600)为适宜诱导时期,加入终浓度为10mmol/L IPTG后诱导5h,OD600达到80以上,重组蛋白表达量达到29.74％,为最适收获菌体时间;37℃表达的包含体80％以上溶解在4mol/L的尿素溶液中,最终浓度达到14mg/mL; 10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐中进行了放大培养,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐上具有可放大性与重复性, 可以应用于工业生产。     

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白工程菌的高密度发酵

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)是治疗用生物制品Ⅰ类新药,具有多种功效,可用于治疗脑卒中.本文旨在优化TNHH工程菌发酵工艺,以实现该工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高效表达.笔者采用摇瓶试验和发酵罐发酵,从培养基碳、氮源配比正交试验入手,对工程菌生长和目的蛋白表达影响较大的单因子条件进行重点考察,如温度、...     

重组葡激酶的高效表达及分离纯化

利用基因重组技术,将葡激酶基因克隆到枯草芽孢杆菌（B.subtilis)中,经过发酵培养,葡激酶被高效表达,并以可溶性活性状态分泌到胞外,本文报道利用SP Sepherose和S－200 Sephacryl二步柱层析来纯化葡激酶,最终纯度在98％以上,得率为50％－60％。     

重组水蛭素HV2的稳定性

重组水蛭素ＨＶ２是凝血酶的特异性抑制剂,是一种非常稳定的蛋白质,温度的升高（１００℃水浴）和ＰＨ（１－１３）的改变不影响其活力,在某些变性剂（８ｍｏｌ／Ｌ素、１％ＳＤＳ和６ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍）存在的条件下也非常稳定,０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ在７０℃时使其部分失活,只有ＰＨ和温度同时升高其活力才开始下降,ＰＨ１３、８０℃处理１５ｍｉｎ即完全失活,氨基酸组成和活性分析发现失活样品的Ｃｙｓ和Ｌｙｓ被破坏。     

重组大肠杆菌高密度培养

重组大肠杆菌的高密度培养是增加单位时间,体积重组蛋白产率的最有效途径之一。如何在获得高密度的同时取得较高的单位时间／体积目的蛋白产率,是高密度培养（过程中亟待解决的问题,这与所选用的菌体、构建的表达系统、发酵时pH、溶氧、培养基成分及培养温度、质粒稳定性、代谢副产物的限制及时比生长速率的控制等因素有关。试从这些方面加以综述,分析这些条件对重组蛋白生产的影响,介绍大肠杆菌高密度培养领域的一些研究进展。     

重组大肠杆菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺研究

以表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌作为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立了大肠杆菌工程菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺。通过测定细胞密度、细胞干重、分离菌体可溶性成分与不溶性成分及SDS-PAGE电泳,分析重组大肠杆菌的生长和普鲁兰酶的表达情况。摇瓶试验使用合成培养基和LB培养基,重组大肠杆菌在合成培养基生长较慢,诱导5 h的普鲁兰酶表达量高于LB培养基,包涵体比例低于LB培养基。重组大肠杆菌的高密度发酵使用合成培养基,补料阶段采用指数流加的工艺,在设定细胞的比生长速率为0.12的前提下,限制补料中碳源的供应,以阻止乙酸的产生。当细胞密度OD600达到70.0开始诱导,最终细胞密度为每升53.3 g细胞干重,细胞内可溶性普鲁兰酶为每升1.35 g。     

培养模式对重组大肠杆菌高密度培养生产谷胱甘肽的影响

利用生物技术方法生产谷胱甘肽（ＧＳＨ）的研究正方兴未艾。本研究室已对面包酵母生产ＧＳＨ进行了较为深入的研究［１,２］,但距工业化生产尚有一段距离,关键在于高ＧＳＨ含量面包酵母的选育较为困难。近来这一方向的研究重点又转向构建重组大肠杆菌来生产ＧＳＨ。虽...     

利用恒溶氧．补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A

对表达人骨形成蛋白２Ａ（ＢＭＰ２Ａ）的重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＤＨＢ２ｍ在５００ｍｌ摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用５Ｌ自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取ｒｈＢＭＰ２Ａ。两种培养方式结果比较表明,在培养过程中保持３０％～４０％左右的溶解氧和限制性流加葡萄糖可以使ＢＭＰ２Ａ的含量达到２７８ｇ／Ｌ,最终菌体密度为ＯＤ６００５３（相当于干菌２１２ｇ／Ｌ）,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的２５％。该培养技术的关键是：（１）在培养过程中保持适当的溶解氧;（２）限制性流加葡萄糖;（３）４２℃起始诱导的时间控制在对数生长中期,持续表达时间为４ｈ;（４）细菌持续生长的比生长速率控制在０３ｈ１左右。     

重组蛋白在大肠杆菌周间腔的分泌表达

大肠杆菌是用于生产重组蛋白的重要工程宿主菌。但是,要获得足够的正确折叠的蛋白还存在一定的缺陷,其中一种解决此问题的方法就是使重组蛋白分泌到大肠杆菌的周间腔里。在这篇综述中,主要讨论了使重组蛋白分泌表达至大肠杆菌周间腔的近期的研究进展。     

Heat-Induced Production of Human Growth Hormone by High Cell Density Cultivation of Recombinant Escherichia Coli

The temperature-induced, over-expression of the human growth hormone gene in a recombinant E. coli during high cell density cultivation is reported. Human growth hormone (hGH) production and stability were tested under different heat shock conditions. Cell densities were 25 and 60 g l(-1) in a pH-stat fed-batch mode in defined and complex medium, respectively, and the fermentation time was decreased from 41 to 32 h. hGH was produced at 2 g l(-1) in complex medium. By using glycerol as main carbon source in the complex medium with exponential feeding, cell density and hGH production were increased to 100 g l(-1) and 2.7 g l(-1), respectively.     

可溶性TRAIL蛋白的高密度培养及补料策略研究

采用分批补料的方法高密度培养重组大肠杆菌C600/PbvTRAIL制备人可溶性TRAIL蛋白,优化发酵工艺,探索简单高效的分离纯化方法并测定蛋白生物活性。通过比较几种不同的补料策略：间歇流加、Dostat、pHstat,摸索了一种流加策略,即DOstatpHstat组合流加,有效的避免了发酵过程中,尤其是诱导表达阶段乙酸积累的增加,使TRAIL蛋白在高密度培养条件下,得到高效表达。菌体密度最终达到300g/L（WCW）以上,可溶性TRAIL蛋白占菌体总蛋白的4.2%,含量为1.1g/L。在整个发酵过程中,乙酸浓度接近于0,且未使用任何特殊手段,如纯氧、加压等,简化了发酵工艺,降低了发酵成本,为TRAIL的工业化生产创造了条件。     

重组PAI－1在大肠杆菌中的高效表达

纤溶酶原激活物抑制因子－１（ＰＡＩ－１）在天然状态下含量很低。为了进行ＰＡＩ－１的结构与功能的研究,构建了表达重组ＰＡＩ－１的质粒ｐＢＶ２２０／ＰＡＩ－１,并在大肠杆菌中得到了高效表达。最高表达量为菌体总蛋白量的４９％以上,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ检测,得到了分子量为４３．０ｋＤａ的反应条带。对形成包涵体的表达产物进行变、复性处理及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５的初步纯化,得到了潜伏态的重组Ｐ